从小鼠胚胎植入前胚胎干细胞系的推导
August 20th, 2017
这篇文章描述了一个协议，以有效地获得和囊胚阶段文化从小鼠胚胎多能干细胞系。
干细胞是多能和特化的细胞，其特征是它们的长期自我更新，并且能够在一定条件下从三个胚层产生分化细胞。由于这些特性，干细胞在再生医学、疾病建模和动物工程方面具有巨大潜力。多年来，用于研究目的的胚胎干细胞系主要来源于小鼠胚胎，但总体而言，所达到的衍生效率一直很低。
在本视频中，我们展示了一种使用标准条件衍生小鼠胚胎干细胞系的简单方案，该方案提供了相当高的衍生效率，与使用信号通路调节剂（如 2i）时获得的效率相当。在该协议中，我们将人包皮成纤维细胞作为 ESC 衍生和培养的饲养细胞。在开始 ESC 衍生过程之前，有必要灭活饲养细胞。
首先，取一个储存在液氮中的人包皮成纤维细胞的低温小瓶，将小瓶浸入 37 摄氏度的水浴中解冻，解冻后，稀释补充有胎牛血清的 DMEM 中的内容物。将稀释液接种在 Falcon 培养瓶中，并培养直至达到汇合阶段。接下来，为了灭活成纤维细胞，在补充有胎牛血清的 DMEM 中稀释丝裂霉素 C，并在该灭活溶液中孵育细胞 3 小时。
然后，去除灭活溶液，用 Hanks'Balanced Salt Solution 冲洗细胞 3 次，以消除丝裂霉素 C 残留物。要分离灭活的饲养层细胞，请添加 1 毫升胰蛋白酶-EDTA 溶液，并将细胞孵育 5 分钟。之后，在倒置显微镜下观察细胞，以确保它们从培养瓶中分离出来。
然后，用巴斯德移液管移液细胞，通过添加 4 毫升补充有胎牛血清的 DMEM 来解离细胞团块并中和酶溶液。取一小份等分试样，用盐水溶液稀释，并使用 Neubauer 腔室测定细胞数。同时，离心样品的其余部分。
弃去上清液，在冷冻溶液中以每毫升 100 万个细胞的终浓度稀释沉淀。将悬浮液分装在低温小瓶中。最后，将低温小瓶放入冷冻容器中，并置于零下 80 摄氏度，第二天，将它们储存在液氮中。
在开始衍生过程前 1 到 4 天，取储存在液氮中的灭活饲养细胞的冻存管，在 37 °C 的水浴中解冻，然后，在补充有胎牛血清的预热 DMEM 中稀释细胞，轻轻移液以确保混合物均匀。向四孔板的每个孔中加入 500 微升预热的明胶溶液，并在 37 摄氏度下保持 10 分钟。之后，从每个孔中取出明胶。
向每个孔中加入 500 μL 饲养层细胞稀释液，并轻轻摇动板，以确保饲养层细胞在孔底部均匀分布。避免做圆周运动，因为这会将细胞集中在孔的中心。然后，将板放入 37 度和 5% 二氧化碳的培养箱中至少 24 小时。
第二天，在倒置显微镜下观察细胞，检查它们是否附着并充分分布。最后，用补充有胎牛血清的预热 DMEM 更换饲养细胞的培养基，以去除 DMSO 残留物。在胚胎收集之前，通过腹膜内注射 5 个国际单位的妊娠母马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素，间隔 48 小时诱导小鼠雌性超排卵。
将雌性与雄配，并在 24 小时后将它们分开。为了收集双细胞期胚胎，在后 48 小时对雌性实施安乐死，解剖雌性小鼠以获得输卵管和一小部分子宫角，并将它们放入装有 HEPES 缓冲 CZB 培养基的培养皿中。然后，在立体显微镜下用 HEPES 缓冲的 CZB 培养基一个接一个地冲洗输卵管以收集胚胎。
将双细胞胚胎转移到前一天制备的培养皿中，其中有几滴覆盖有矿物油的胚胎培养基。将胚胎保存在培养箱中，直到囊胚阶段。每 24 小时监测一次胚胎发育。
胚胎预计在体外培养开始后 48 小时达到囊胚阶段。如果可能，仅选择扩增的囊胚以开始衍生过程。在胚胎接种当天，准备用于干细胞衍生的培养基。
将白血病抑制因子 （LIF） 添加到补充有 2-β-巯基乙醇非必需氨基酸和 KnockOut 血清替代物的 DMEM 中。如果需要，添加 MAPK 抑制剂和 GSK-3 抑制剂以获得 2i 培养基。从培养箱中取出带有单层饲养层细胞的四孔板。
去除培养基，加入 800 μL 新鲜制备的衍生培养基。在将囊胚接种到饲养细胞上之前，必须去除透明带。为此，将一个胚胎从培养板转移到一滴酸性 Tyrode 溶液中，并保持在那里，直到透明带被消化。
通过调整立体显微镜的焦点和对比度，确保透明带已被完全去除。然后，在几滴衍生培养基中冲洗无带的胚胎，并将其接种在单层饲养细胞上。对其余胚胎重复该过程。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下培养板。在倒置显微镜下每 24 小时监测一次培养物，以评估其生长情况并识别潜在的分化早期迹象，例如生长物周围出现折射细胞肿胀，甚至将饲养细胞推到一边。每隔一天更换一次培养培养基。
为此，从培养箱中取出四孔板，从每个孔中取出培养基，并加入 800 微升预热的衍生培养基，补充有 LIF 和 2i（如果使用）。将板放回培养箱中，并保持培养物，直到观察到生长物。囊胚接种后 6 至 8 天，应观察生长物，并且必须进行传代培养。
对于此过程，需要类似剔除的手柄和干细胞作移液器。要制作它们，请使用长头巴斯德移液管并使用本生灯加热其较薄的部分。变软后，将移液器从火焰中取出，将两端分开，直到它们分开。
使用较厚的部分作为干细胞作移液器。加热较薄部分的尖端，并塑造它，直到获得一个钩子，以准备类似剔除的手柄。要对生长物进行传代培养，请在立体显微镜下定位它。
在手柄的帮助下，推开围绕生长物的分化细胞。为避免最终分化，在从生长物边缘去除分化的细胞时，必须严格要求。使用干细胞作移液管，吸出生长物并将其放入一滴预热的胰蛋白酶-EDTA 溶液中。
在手术刀的帮助下，将生长物切成几块，以机械和酶促方式分解。回收生长片段，并将它们放入一滴预热的衍生培养基中，以中和胰蛋白酶的作用。最后，将生长片段接种到带有单层饲养层细胞的四孔板中，并在 37°C 和 5% 二氧化碳的衍生培养基中培养它们。
干细胞样培养物必须维持至少 6 周，然后才能认为 ESC 细胞系已建立。在此期间，有必要每隔一天更换一次培养基，并每周进行一次传代培养。随着传代次数的增加，菌落的形态逐渐从圆顶形状转变为更细长和扁平的形态。
6 代后，小鼠 ESC 细胞系组成型表达多能性标志物，例如 Oct 4 和 Sox 2。此外，通过在补充有 10% 胎牛血清且没有饲养细胞的 DMEM 中培养 ESC 体外分化后，可以通过免疫荧光检测代表三个胚层的分化标志物。在这里，我们展示了抗微管蛋白 β-3 蛋白作为外胚层标志物、中胚层 α-平滑肌肌动蛋白和内胚层 α-胎蛋白的检测。
按照这个简单的程序，可以从小鼠囊胚中提取胚胎干细胞，效率从 60% 到 78% 不等在尝试此程序时，每天或每隔一天控制细胞很重要，因为此处提供的时间仅供参考。如果胚胎干细胞集落过度生长，它们会因细胞积累而变得更暗，并且往往更容易分化。看完这个视频，您应该对使用标准条件的小鼠胚胎干细胞衍生和培养有很好的了解。
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概述
本文描述了一种从囊胚期的小鼠胚胎中高效衍生和培养多能干细胞系的协议。该协议旨在提高与传统方法相比的衍生效率。
关键研究组成部分
科学领域
- 干细胞生物学
- 再生医学
- 胚胎发育
背景
- 干细胞是多能的，可以分化为各种细胞类型。
- 它们在再生医学和疾病建模中具有重要潜力。
- 胚胎干细胞系主要来自小鼠胚胎。
- 传统的衍生方法通常效率较低。
研究目的
- 提出一个简单的衍生小鼠胚胎干细胞系的协议。
- 达到与使用信号通路调节剂相当的高衍生效率。
- 使用人类包皮成纤维细胞作为ESC培养的补料细胞。
使用的方法
- 在ESC衍生之前使补料细胞失活。
- 使用标准培养条件。
- 与传统方法比较衍生效率。
- 为研究人员应用简单的协议。
主要结果
- 该协议提供了相当高的衍生效率。
- 效率水平与使用2i调节剂获得的水平相当。
- 成功从小鼠胚胎中衍生出多能干细胞系。
- 补料细胞在培养过程中起着至关重要的作用。
结论
- 所提出的协议简化了小鼠胚胎干细胞的衍生。
- 它提高了效率，使其可用于研究目的。
- 该方法可以促进再生医学的进步。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient derivation of mouse embryonic stem cell (mESC) lines enables robust early discovery platforms for disease modeling and regenerative medicine research. High-yield, reproducible mESC generation supports scalable assay development and mechanistic de-risking at the target validation stage. This capability strengthens translational continuity and portfolio decision-making in preclinical R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of pluripotent cell lines for hypothesis-driven target interrogation.
- Supports functional validation of genetic and pathway targets in a controlled system.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing a renewable source of undifferentiated cells.
- Improves predictive confidence for downstream disease modeling studies.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-efficiency mESC lines for reproducible assay platforms.
- Enables quantitative assessment of differentiation and pluripotency markers.
- Supports scalable screening workflows for compound evaluation and phenotypic analysis.
- Improves assay readiness and platform reuse across discovery programs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro pluripotency and differentiation outputs with disease-relevant models.
- Enables continuity from early discovery to preclinical validation using consistent cell sources.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, characterized cell lines.
- Facilitates translational biomarker development through controlled differentiation protocols.
Pipeline & Workflow Integration
This mESC derivation protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless progression from target validation to disease modeling.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification using pluripotent cell systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound screening.
- Analytics: Enables measurement of pluripotency and differentiation markers for comparative analysis.
- Translational Research: Provides a foundation for preclinical model development and biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for mESC line generation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of stem cell workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery assets.
Implementation Considerations
- Requires basic mammalian cell culture expertise and standard laboratory infrastructure.
- Relies on validated feeder cell preparation and consistent derivation medium composition.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell line generation and characterization.
- Adaptable to both permissive and non-permissive mouse strains with minor protocol modifications.
- Dependent on daily monitoring and timely subculturing to maintain pluripotency and prevent differentiation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:08
Feeder Cells Inctivation and Storage
3:21
Feeder Cells Culture
5:14
Embryo Collection and Culture
6:32
ESC Derivation
9:06
ESC Culture and Maintenance
11:22
Results: Validation of the Stemness and the In Vitro Differentiation Potential of the ESC Lines Established
12:07
Conclusion
