在体内小鼠激光诱导脉络膜新生血管模型的多模态成像与分析

在这里, 我们介绍了纵向的在体内成像在激光诱导的小鼠脉络膜新生血管形态学变化中的作用。

新生血管过程是几种常见眼部病变的特征。最突出的是渗出性年龄相关性黄斑变性或简称湿性 AMD、增殖性糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变。这些疾病共同构成了全球大多数合法失明病例，并与其他眼部并发症有关，例如玻璃体出血和新生血管性青光眼。

然而，尽管它们很普遍，但眼部新生血管疾病的治疗选择是有限的。目前与 AMD 和增殖性糖尿病视网膜病变相关的新生血管形成的护理标准是玻璃体内注射针对血管生成和新生血管形成的关键介质血管内皮生长因子或 VEGF 的人源化抗体。然而，尽管玻璃体内注射在阻止疾病进展和改善功能性视力方面具有疗效，但玻璃体内注射成本高昂，而且远非没有风险。

并发症可能包括感染、眼内炎、视网膜脱离和眼出血。因此，迫切需要开发有效、安全且成本较低的新型治疗方案。为了推进新生血管疾病的药物开发，小动物模型至关重要。

此类模型需要具有可重复性，具有已建立和验证的读数和终点，并且理想情况下使用临床相关的参考化合物作为阳性对照。在该协议中，我们将介绍小鼠脉络膜新生血管或 CNV 模型，这是研究导致 CNV 的病理生理机制和开发新型抗新生血管药物最常用的模型之一。在 CNV 模型中，Bruch 膜使用氩激光破裂。

从而启动源自脉络膜的新生血管过程。通过光谱域光学相干断层扫描（简称 SD-OCT）和荧光素血管造影采用纵向体内成像，提供了一种跟踪 CNV 增殖和消退的方法。从而评估新型药物干预的疗效和时间进程。

图像处理的最新进展还允许自动分割以测量视网膜厚度，提供了一种没有研究者偏见的方法来评估水肿的存在。在本文中，我们将讨论徕卡显微系统公司的新型 InVivoVue Diver 软件在小鼠 CNV 模型中自动分割视网膜层的有用性。最后，我们将讨论视网膜整个支架的组织学分析如何补充该模型中的纵向体内成像。

将一滴托吡卡胺涂抹在每只眼睛上以扩大瞳孔。随后，将动物轻轻地置于啮齿动物对齐阶段。调整鼠标以露出眼睛，并使用鼻托和一条轻轻贴在背部的实验室胶带固定。

接下来，将一滴润滑剂涂抹在眼睛上以保湿，并使用滤纸棉签小心去除任何多余的液体。最后，将载物台对准 OCT 设备前方进行基线 OCT 成像。在激光应用之前，在基线处进行体内光谱域光学相干断层扫描成像，以验证是否存在任何视网膜异常。

轻轻地从支架上取下鼠标。将一滴 Viscotears 凝胶滴在盖玻片上以贴近角膜。将鼠标定向，使视神经头位于中心，并将激光束聚焦在视网膜色素上皮上。

避开视神经周围 4 点钟、8 点钟和 12 点钟位置的视网膜血管，进行 3 次激光注射。在所有激光注射后检查眼睛的硬度，是否有任何视网膜出血。和以前一样，将鼠标对准支架并进行荧光素血管造影和 OCT 成像，以确认 Bruch 膜的损伤。

对于荧光素血管造影，首先使用红外反射模式聚焦在激光烧伤区域，该模式允许可视化激光施用的部位。小心注射 0.1 毫升 5% 荧光素钠盐，体重约为 20 克，而不改变小鼠眼睛位置。开始在脉络膜水平和视网膜水平拍摄荧光素血管造影图像，大约每 30 秒一次。

像以前一样对齐 OCT 成像的眼睛并开始成像。平均 SD-OCT 信号有助于更好地可视化详细的视网膜形态，如此序列所示。执行 SD-OCT 成像后，小心地从支架上取下鼠标。

为双眼涂抹润滑剂。此时，您可以选择通过皮下注射美托咪定的 α-2 拮抗剂阿替美唑来逆转麻醉，或等待动物从麻醉中恢复。在随访第 5 天、第 10 天和第 14 天对麻醉动物重复体内 SD-OCT 和 FA 成像。

使用 InVivoVue Diver 软件的自动分割功能进行视网膜厚度测量。对于健康的视网膜，视网膜总厚度被认为是从神经纤维层到 RPE 的所有层的厚度。在健康的视网膜中，自动分割可以准确检测单个视网膜层，如本例所示。

一提的是，在存在 CNV 的地方，应分别对每个 CNV 病变部位进行视网膜厚度的手动测量。从神经纤维层到穿过 RPE 层的假想线。此序列显示了在存在 CNV 病变的部位进行手动厚度测量的工作流程。

神经纤维层位于图像的顶部，脉络膜位于图像的底部。使用鼠标或触摸板，手动确定神经纤维层和脉络膜的边界，软件根据这些坐标自动计算视网膜总厚度。该图显示了在脉络膜水平每 20 秒拍摄一次的序列图像。

图像 1 是在红外反射模式下采集的。而其他的，在腹膜内荧光素注射后。图像 1 中的白色箭头指向激光位点，显示荧光素在较晚的时间点泄漏，在图 18 中由白色箭头突出显示。

该图像显示了在视网膜水平采集的 FA 连续成像。图 18 中的白色箭头指向一个激光位点，显示荧光素泄漏比其他两个位点出现得更快，在图 18 中用圆圈勾勒。此摘要图显示了 SD-OCT 图像的时间进程。

在基线、激光后立即以及第 5、10 和 14 天的随访时间点。总之，使用 SD-OCT 和 FA 成像对 CNV 病变进行纵向体内成像的方案允许对 CNV 病理和视网膜水肿的存在进行快速、多模式和可靠的分类。感谢您的关注。