Name: 成人果蝇脑内蘑菇体和感光神经元的解剖和荧光染色 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习成年果蝇大脑解剖与免疫荧光染色技术，用于研究蘑菇体和感光神经元的发育与连接模式。该方法可快速识别神经形态缺陷，为神经科学研究提供可靠工具。

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我们感谢Changhui Pak和Alysia Vrailas Mortimer最初向SMK传授了脑解剖技术。我们还感谢Ken Moberg实验室的成员，特别是Chris Rounds，对稿件进行了批判性审阅。识别Fas2（1D4）和chaoptin（24B10）的抗体来自发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）。抗体24B10由Seymour Benzer和Nansi Colley提交至DSHB24,60,61，抗体1D4由Corey Goodman提交至DSHB22,23,56。果蝇品系来自布卢明顿品系中心（Bloomington Stock Center）。我们还要感谢俄亥俄州农业研究与发展中心（OARDC）MCIC影像中心提供共聚焦显微镜，用于获取图4A和图4B中的脑部图像。SMK的研究由NICHD资助（1 R15 HD084241-01A1）。M. Kahl的研究由美国国家科学基金会（NSF）资助（NSF REU #1560061）。

1. Drosophila melanogaster 遗传学及可选的热激处理步骤
<ol>
	<li>在果蝇杂交并孵化出F1代子代后，获取具有适当基因型的雌性或雄性果蝇。根据所研究的脑区，应每天收集果蝇，并按性别分离，以便更清晰地区分脑连接的年龄依赖性特征和/或性二型性模式。 
	注意：可选步骤：若果蝇用于带有可抑制细胞标记物的镶嵌分析（Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker, MARCM）12,47，则应在37 °C下对胚胎、幼虫或蛹进行30–45分钟的热激处理，以诱导有丝分裂重组。为在MARCM分析中靶向特定的蘑菇体区域，热激时间应依据文献12确定的时间表，并参照图5B中所示方案进行。若使用MARCM研究除蘑菇体以外的其他脑区，则应开展预实验以确定最佳热激发育阶段。尽管以下步骤以羽化后的成虫为操作对象撰写，但一旦去除蛹壳，围蛹成虫（pharate adults）也可采用相同步骤进行解剖。</li>
</ol>
2. 解剖工作站准备
<ol>
	<li>将体视显微镜及带有光纤蛇形管的光源放置在较大的实验台面上。为确保解剖过程中手部动作稳定并减少手部&#34;抖动&#34;，显微镜周围必须留出充足的手部和手臂支撑空间。确保显微镜两侧各留有约8–10英寸的空间，显微镜底座与实验台边缘之间保留4–6英寸的距离。</li>
	<li>在玻璃制的9孔或3孔培养皿中，向其中2至3个孔各加入1.0 mL PTN缓冲液（0.1 M 磷酸钠缓冲液，pH 7.2，含0.1%非离子型表面活性剂，完整组分见材料表），并将该培养皿置于冰上，靠近解剖操作台。新解剖获得的脑组织将转移至此培养皿中，并在固定前冷藏保存。
	<ol>
		<li>注意：若需进行活体成像，解剖缓冲液应使用1×磷酸盐缓冲液（PBS）或HL3缓冲液48。若需检测细胞内蛋白定位，PBS也可作为解剖和固定步骤的替代缓冲液。固定后，应使用含0.1%或0.3%非离子型去垢剂的PTN缓冲液进行洗涤，以实现细胞膜的通透化处理。</li>
		<li>若使用PBS进行解剖和固定操作，移液器吸头应在使用前至少用含去垢剂的缓冲液（如PTN缓冲液）冲洗一次，以防止脑组织在转移至微量离心管时粘附于塑料吸头表面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一个空的35 mm玻璃或塑料培养皿，制备含有硅胶弹性体的解剖用培养皿。具体操作为：按照制造商说明混合弹性体组分，倒入35 mm培养皿中，并在平坦表面上静置过夜使其聚合。使用含硅胶弹性体的解剖皿可保护解剖镊的精细尖端，避免其与较硬表面（如玻璃皿）接触而造成损伤。我们亦常规从在线供应商处购买市售的硅胶涂层培养皿。为在解剖过程中增强对比度，含有失活活性炭（因而呈黑色）的硅胶弹性体解剖皿尤为适用。</li>
</ol>
3. 成年小鼠脑组织解剖操作步骤
<ol>
	<li>麻醉3至5日龄的成年个体 D. melanogaster 与 CO2 或使用冰进行麻醉。若使用冰，将装有果蝇的离心管倒置（塞子朝下）放入冰桶中约5分钟。将离心管倒置放入冰中可防止果蝇卡在食物中。果蝇麻醉后，将其转移至置于冰上或二氧化碳装置上的冰冷金属板或培养皿中2 发光蝇垫。若解剖脑组织以分析神经退行性病变，也可使用较老的果蝇。</li>
	<li>使用移液管或P200移液器将少量（150 - 200 µL）PTN置于解剖皿中央，以形成 &#34;气泡&#34; PTN的处理。将解剖皿置于体视显微镜下，调节光源和焦距，使PTN气泡充满整个视野并获得均匀照明。</li>
	<li>操纵果蝇，使其处于 &#34;仰卧&#34; (即，腹面朝上）置于金属或CO2 垫板</li>
	<li>使用一对 #5 镊子夹住待解剖果蝇的腹部，并保持夹持状态，将果蝇完全浸入解剖皿中的 PTN 溶液中。 
	注意：在本实验方案的后续步骤中，所有操作均需在头部浸没于PTN溶液中进行。</li>
	<li>使用另一把5号镊子夹住果蝇喙的基部，将两把镊子分开，使果蝇头部与身体分离。丢弃腹部和胸部。此步骤中，必须确保头部不被松开，避免其漂浮在PTN溶液表面。一旦头部漂浮，再次夹取将非常困难，且容易压碎脑组织。 
	注意：使用该方法会切断大脑与腹神经索之间的连接。若需要保持中枢神经系统这些区域之间的完整连接，应采用其他解剖方案，例如49,50应遵循上述步骤。若在移除头部前喙已从果蝇头部脱落，则会在喙原来的位置留下一个孔洞。此时，应使用镊子夹住靠近单眼一侧的孔洞边缘，然后施加适当力度，将两对镊子相互分离，从而取下头部。有时在将头部从身体分离时，肠道和/或腹神经索仍会附着在头部上，应在继续解剖前将其去除。</li>
	<li>当一对镊子夹住吻部时，另一对镊子应夹住右侧果蝇眼睛的内侧边缘。缓慢地将两对镊子向两侧拉开。此步骤需施加轻微且稳定的横向力。随着镊子缓慢分离，吻部应从头部被拉出，并在头壳上形成一个中央孔洞。用第一对镊子将吻部丢弃，同时保持第二对镊子夹住右侧眼睛的内侧部分不松开。 
	注意：成年 D. melanogaster 脑位于尾侧（即，后部/尾部）区域。因此，应避免抓握果蝇头部的这一区域。理想情况下，仅抓握吻侧（即用镊子直接夹住靠近内侧视网膜的头部前端。此时，通过外骨骼上的中央开口应可观察到脑组织及相关的气管。此时可将从开口处伸出的白色丝状气管组织清除并丢弃。</li>
	<li>用第二对镊子夹住左视网膜的内侧边缘（位于头壳中央孔洞的边缘处）。为移除视网膜及其附着的头壳组织，缓慢以180°角将镊子向相反方向拉开。当视网膜逐渐与下方的视叶分离时，应能感受到张力轻微下降。操作应缓慢进行，以避免撕裂视叶。 
	注意：在此步骤中，若镊子分离过快，可能导致视叶撕裂或蘑菇体结构受损。有时外骨骼已被去除，但部分视网膜仍附着在视叶上。若仅对蘑菇体进行成像，无需完全去除整个视网膜。然而，若需分析其他脑区（如视网膜神经元对视叶的支配），则需按所述方法彻底去除视网膜48,51. 
	注意：当视网膜逐渐从其下方的视叶分离时，应可观察到视叶为被白色丝状气管覆盖的不透明白色结构。一旦一侧视网膜被移除，即可弃去。在分析视网膜神经元投射路径时，此步骤需格外小心，以避免损伤视叶。另有专注于感光神经元解剖与活体成像的实验方案可供参考48.</li>
	<li>现在，仔细移除尽可能多的可见气管组织。气管可能已含有空气或在后续步骤中充气，导致脑组织漂浮，进而在后续免疫染色过程中可能丢失。为去除气管，使用一对非常锋利的#5镊子轻轻夹取并将其从脑组织上剥离。</li>
	<li>使用两把镊子夹住果蝇左侧视网膜的内侧区域，去除残留的视网膜及周围角质层。小心地将视网膜撕成两半，以清除视网膜碎片和角质层。在某些情况下，不压碎脑组织而去除残留角质层尤为困难。此时，我们发现可用一把镊子夹住残留的腹神经索，同时用另一把镊子小心去除剩余的角质层。</li>
	<li>使用 p200 移液器将解剖得到的脑组织转移至含有 PTN 的 9 孔或 3 孔培养皿中的一个孔内。相同基因型的脑组织应集中置于同一孔中，并保持在冰上。脑组织应在解剖后一小时内进行固定。若需要较多脑组织，可分批固定后再合并。在大多数情况下，经验丰富的研究人员通常可在约 3 至 5 分钟内完成一个脑组织的解剖并将其转移至玻璃收集皿中。</li>
</ol>
4. 固定与免疫荧光染色步骤
<ol>
	<li>使用 p200 移液器将解剖好的脑组织从 9 孔板转移至含有 0.5 mL 用 PTN 稀释的 4% 多聚甲醛的 0.5 mL 微量离心管中。相同基因型的至少 10 - 15 个脑组织可合并置于同一微量离心管中。所有后续步骤（直至将脑组织装载到载玻片上）均在 0.5 mL 微量离心管中完成。 
	警告：应于通风橱中操作多聚甲醛（PFA）。PFA 废液需收集并妥善处理。购自玻璃安瓿瓶的 20% 多聚甲醛可分装至微量离心管中，于 -20 °C 保存，直至使用。</li>
	<li>在通风橱内，将脑组织置于4%多聚甲醛中，在室温下以低速摇动孵育20分钟。</li>
	<li>固定后，让脑组织依靠重力自然沉降至微量离心管底部。 
	注意：有时脑组织可能会粘附在微量离心管的管壁上。若发生此情况，通常可将管子置于食指与拇指之间轻轻横向旋转，或非常轻柔地将管子在实验台面上轻敲几下，以促进脑组织沉降至管底。</li>
	<li>使用 P1000 移液器去除固定剂，并进行两次 &#34;快速&#34; 用500 µL PTN洗涤，每次洗涤之间让脑组织在微量离心管底部自然沉降。在这些快速洗涤过程中，一旦所有脑组织通过重力沉降至微量离心管底部，即可立即更换为新鲜缓冲液；无需额外的洗涤时间。 
	注意：通常情况下，保留少量多余缓冲液在离心管中，优于因过度吸液而导致脑组织被吸出的风险。常需仔细检查移液器吸头，以确保没有脑组织被误吸出管外。若脑组织不慎被吸入移液器吸头内，应将其重新排回微量离心管中，等待脑组织沉降后，再继续移除残留的PTN。</li>
	<li>最后一次快速洗涤后，使用 p1000 移液器进行三次 &#34;长&#34; 洗涤：加入500 µL PTN，在室温下于摇床/振荡器上洗涤20分钟。此后所有步骤 &#34;长&#34; 洗涤应持续 20 分钟。 
	注意：完成这些洗涤步骤后，固定的脑组织可在 PTN 中于 4 °C 保存过夜。</li>
	<li>使用 p1000 移液器吸除最后一次洗涤液，将脑组织置于 0.5 mL 封闭液 [PTN + 5% 正常山羊血清（NGS）] 中，在室温下于摇床或旋转混合仪上孵育至少 30 分钟。
	<ol>
		<li>后续实验步骤将使用山羊来源的二抗。如果使用其他物种的二抗，则应在封闭液和抗体溶液中使用该物种的正常血清（而非 NGS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 p1000 移液器去除封闭液，加入用 PTN 稀释的一抗（PTN + 5% NGS + 稀释的一抗）。首次使用某一种一抗时，应通过实验确定其最佳稀释比例。 
	注意：为了可视化蘑菇体神经元，通常使用识别 Fas2 的抗体。该抗体可从发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank, DSHB）获得，抗体编号为 1D4，应以 PTN + 5% NGS 按 1:20 比例稀释。 
	注意：为了可视化感光神经元，通常使用识别chaoptin的抗体。Chaoptin抗体可从DSHB获取，抗体编号为24B10，应以PTN + 5% NGS按1:20比例稀释。 
	注意：固定过程通常会消除荧光蛋白（如绿色荧光蛋白，GFP）的荧光信号。因此，在使用MARCM分析单个蘑菇体神经元轴突导向时，应采用识别GFP的抗体。</li>
	<li>在4 °C下，将脑组织置于一抗溶液中，在摇床/振荡器上孵育2至3个晚上。</li>
	<li>孵育一抗后，让脑组织沉降至微量离心管底部，然后移除一抗溶液。</li>
	<li>使用 p1000 移液器，执行 2 次 &#34;快速&#34; 洗涤和3 &#34;长&#34; 按照上述步骤4.4和4.5所述，用0.5 mL PTN进行每次20分钟的洗涤，在每次洗涤之间，轻轻依靠重力使脑组织自然沉降到微量离心管底部。</li>
	<li>室温下用适当的荧光标记的二抗孵育脑组织3小时。二抗通常用0.5 mL PTN + 5% NGS稀释至1:200浓度。 
	注意：一旦加入荧光二抗，脑组织在后续实验过程中应始终避光。 
	注意：如果残留的GFP荧光仍然存在，在进行MARCM分析时，建议使用带有与GFP激发/发射波长相似的荧光染料标记的二抗例如，异硫氰酸荧光素（FITC）或 Alexa488）。</li>
	<li>二抗孵育后，让脑组织沉降至微量离心管底部，然后移除二抗溶液。</li>
	<li>执行 2 &#34;快速&#34; 洗涤和3 &#34;长&#34; 按照上述步骤4.4和4.5所述，用0.5 mL PTN进行每次20分钟的洗涤，在每次洗涤之间轻轻让脑组织沉降至微量离心管底部。</li>
	<li>第三次之后 &#34;长&#34; 20分钟洗涤，使用p200移液器尽可能吸除缓冲液。</li>
	<li>加入75 µL荧光抗淬灭封片剂至脑组织中。用移液器吸取脑组织和封片剂，吹打一次以混匀。切勿倒置离心管，以免脑组织黏附在管盖或微量离心管管壁上。 
	注意：将脑组织置于封片剂中悬浮后，可将管子用铝箔包裹以减缓荧光淬灭，并于4 °C下避光保存过夜。如有必要，脑组织可在4 °C保存数天，但最好尽快将其封片。</li>
</ol>
5. 将成年黑腹果蝇（D. melanogaster）大脑固定于显微镜载玻片上并进行成像
<ol>
	<li>制作一个&#34;桥接&#34;载玻片。将两个&#34;基底&#34;盖玻片放置在带正电荷的载玻片上，两者相距约1 cm。确保载玻片的带正电荷面朝上。用指甲油将盖玻片固定在载玻片上，如图3A所示。通常建议用指甲油密封每个基底盖玻片的三个外侧边缘，以防止封片剂渗入基底盖玻片下方。继续操作前，需等待指甲油完全干燥（10–15分钟）。</li>
	<li>将载玻片置于体视显微镜下，用移液器将含有解剖后脑组织的封片剂溶液滴加至两个盖玻片之间的空隙中。为获得更好的对比度，可调节鹅颈灯位置，使其与实验台面平行。</li>
	<li>使用移液器去除载玻片上多余的封片剂，注意避免将脑组织一并吸走。</li>
	<li>用滤纸吸除多余的封片剂，以便在下一步中更精确地定位脑组织。</li>
	<li>在体视显微镜下使用镊子将脑组织以网格状排列置于载玻片上，确保嗅觉叶朝上。</li>
	<li>将一个盖玻片（即&#34;桥接&#34;盖玻片）覆盖在脑组织上方（图3A）。使用指甲油密封桥接盖玻片与&#34;基底&#34;盖玻片相接触的两侧。</li>
	<li>使用P200移液器，缓慢向桥接盖玻片下方的中央空腔中加入新鲜封片剂（图3B）。每次在中央盖玻片的开口边缘滴加一滴，并让封片剂通过毛细作用渗入桥接盖玻片下方。持续操作直至整个空腔被封片剂填满，然后用透明指甲油密封顶部和底部开口。</li>
	<li>待指甲油完全干燥后，立即进行成像，或将其存放在避光、密封的载玻片盒中，于-20 °C保存。</li>
	<li>在一周内，使用激光共聚焦显微镜对脑组织进行成像，选择与所用荧光二抗相匹配的激发激光和滤光片组。通常使用20X&#160;或40X&#160;物镜获取蘑菇体神经元的Z轴层扫图像。视网膜感光神经元的成像可能需要更高的放大倍数。</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述解剖与可视化方法可广泛应用于多种免疫染色和活体成像实验。我们概述了一种通用的免疫染色方案，并重点介绍了一种利用MARCM技术对单个蘑菇体神经元轴突形态进行可视化的方法。此外，这些通用操作步骤也可用于固定或新鲜解剖的成年果蝇大脑中其他脑区的成像48,65。例如，在分析增强子捕获系、报告基因或MiMIC品系的表达模式时，活体成像可能提供更高效的手段66。为避免在未固定组织中对GFP进行活体成像时捕获到细胞死亡产生的假象，应使用1x磷酸盐缓冲液（PBS）或HL3培养基进行脑组织解剖48，将样本置于桥式载玻片上的1x&#160;PBS（或HL3）中，并在15–20分钟内完成成像。成像前还应尽可能彻底清除解剖所得脑组织中的气管，因其可能干扰GFP荧光的观察。
尽管用于评估蘑菇体和感光神经元形态的染色条件已有相对成熟的方法24,61,67，但目标蛋白在这些细胞类型中的定位可能需要大量的排查和优化。特别是抗体稀释度、封闭缓冲液组分浓度以及固定条件等几个关键步骤，均需优化以获得最可重复且可靠的结果。首先，应确定一抗的最佳浓度。尽管商业抗体通常会提供推荐的稀释比例（我们通常也以此浓度作为起始点），但这些数值很少是基于黑腹果蝇（Drosophila）组织通过实验确定的。因此，通过测试高于和低于厂家推荐浓度的一系列一抗稀释度，往往可以获得更特异的染色结果。虽然一抗的稀释度对染色特异性具有显著影响，必须精确确定，但脑组织在含一抗溶液中孵育的时间则可在较宽范围内变动，对最终结果影响较小。例如，我们将解剖的脑组织在4 °C条件下使用Fas2抗体孵育两天、三天甚至四天，均观察到相似的结果。尽管我们建议至少孵育两个晚上，但我们也曾仅孵育一个晚上即获得可重复的染色效果。重要的是，将脑组织在二抗溶液中的孵育时间限制在室温下3小时（或4 °C过夜），有助于减少二抗与脑组织的非特异性结合。
其次，可能需要使用额外的&#34;封闭&#34;试剂以消除非特异性背景信号。可选方案包括将NGS浓度提高至约10%，在封闭液以及一抗/二抗溶液中添加1–10%的牛血清白蛋白（BSA），或在4 °C下用Drosophila胚胎对一抗进行过夜预吸附（参见参考文献68，第2.9节，步骤3）。
尽管上述方案推荐使用PTN作为所有固定、洗涤和抗体孵育步骤的缓冲液，但也可使用其他缓冲液（如PLP和PEM，见材料列表）对组织进行固定。 材料表）可能会导致信号强度的显著差异。例如，以往研究表明，当组织使用传统的4%多聚甲醛（溶于PBS）固定时，幼虫成虫盘中的Cyclin E无法被检测到，而使用PLP缓冲液固定时则可清晰观察到（Ken Moberg，个人通讯，及参考文献69）。除了缓冲液成分的改变外，调整组织固定的时长和温度也会显著影响免疫荧光染色效果，必要时可通过实验确定最佳条件。通常情况下，固定时间应足够长，以确保细胞成分充分交联并长期维持整体细胞形态，但又不应过长，以避免过度交联 &#34;掩埋&#34; 蛋白质表位。因此，在初步优化新获得的一抗的染色条件时，我们通常将固定时间限制在约20分钟，并常在较低温度下对组织进行固定。
在任何免疫荧光实验中，应包含多个对照，以检测一抗和二抗的特异性，以及转基因/遗传背景对所观察表型的影响。为了确定所使用的一抗是否特异性识别目标蛋白，应设置缺乏该蛋白的果蝇组织和/或过表达该蛋白的组织作为对照。此外，可加入过量的纯化抗原蛋白，以判断一抗是否识别果蝇脑中的其他表位。最后，当省略一抗时，任何存在的荧光信号均代表所选二抗的非特异性结合水平。
还应包括若干重要的对照实验，以评估遗传背景或转基因的存在对染色强度或神经元形态的影响。例如，图5中MARCM实验所使用的果蝇包含多个转基因（hsFLP、UAS-CD8-GFP、FRT82B、Tub&#62;GAL80以及OK107-GAL4），每一个都应单独分析其对蘑菇体形态的影响。至少应分析同时携带OK107-GAL4和UAS-CD8-GFP的果蝇的蘑菇体形态。此外，通过分析携带hsFLP和FRT82B的果蝇，可能还需要评估热激和Flp重组酶表达对蘑菇体发育的影响。尽管MARCM技术能够显著揭示特定蛋白是否自主调控轴突导向，但为准确得出该结论所需设置的对照数量较多，这可能是该技术的一个小局限。在较简单的实验中，类似的对照原则同样适用。例如，在一个利用GAL4/UAS系统与RNAi转基因结合、在所有神经元中敲低目标蛋白表达的实验中，至少会存在两个转基因：一种泛神经元GAL4驱动子（如elav-GAL4）和UAS-RNAi转基因。除了分析同时携带两个转基因的实验组果蝇外，还应分别研究仅携带其中任一转基因的果蝇中蘑菇体神经元的形态。
最后，为了确定目的蛋白是否在蘑菇体神经元中表达，通常需要使用Fas2抗体对脑组织进行共染色。或者，也可以利用GAL4/UAS系统表达荧光蛋白（如GFP、RFP）或膜结合型CD8-GFP，并与识别目的蛋白的抗体联合使用。由于Fas2仅能识别构成蘑菇体α和β叶的束状轴突，因此使用GAL4驱动的膜结合型CD8-GFP在标记蘑菇体神经元方面尤为有用。
轴突导向缺陷通常不具有完全外显率，即使是相同基因型的脑组织也可能表现出一定程度的变异性。因此，在分析新产生的突变等位基因对蘑菇体或光感受器轴突导向的影响时，应结合使用不同的等位基因和研究方法。文献中的大多数研究采用多种不同策略来探究某个蛋白质是否在调控轴突导向中发挥细胞自主性作用：i）分析纯合无效果蝇（最好使用不同的无效等位基因）中的轴突导向缺陷；ii）分析仅在神经元中缺失目标蛋白的果蝇（通常通过RNAi实现）中的轴突导向缺陷；iii）利用MARCM技术分析轴突导向缺陷；以及iv）进行拯救实验，即在纯合无效果蝇的神经元中重新表达该基因。理想情况下，每种基因型应分析数十个脑组织样本，以评估神经元形态的异常情况。
尽管本文所述方案主要关注固定组织中蛋白质的免疫荧光定位，但该技术的若干未来应用正在被开发用于活体脑组织成像。脑组织解剖后（通常在细胞培养基中进行），可在25 °C下培养数天。ex vivo 培养方法的开发旨在研究多种生物学过程，例如促进损伤后轴突再生的蛋白质活性70,71、细胞内信号传导动态72以及神经元发育73。

尽管 果蝇 神经系统虽比人类和啮齿类的小，但其复杂性为深入理解脊椎动物的神经系统提供了强大而易于研究的模型。在许多情况下，脊椎动物和果蝇的基因组编码出极为相似的蛋白质，这些蛋白质决定了神经系统发育的机制。事实上，许多在脊椎动物神经元发育中必需的基因在果蝇中均有直系同源基因，包括参与调控图式形成、神经发生和轴突导向等信号通路的基因1,2,3,4,5例如，netrin 是哺乳动物轴突导向所必需的一种配体 D. melanogaster6,7,8。虽然净素最初是从鸡胚胎脑组织中分离得到的6，后续研究揭示了净素（netrin）在胚胎中枢神经系统（CNS）发育过程中具有保守的功能 果蝇8. 其他研究已在胚胎中使用遗传筛选 果蝇 中枢神经系统以鉴定在轴突导向过程中所需的保守配体和受体 黑腹果蝇 和脊椎动物9.
尽管果蝇胚胎中枢神经系统（CNS）在过去被广泛用于鉴定轴突导向所需的配体、受体及细胞内信号蛋白8,9，但近期研究进一步探讨了这些蛋白如何在发育后期阶段调控路径选择。具体而言，对蕈形体（MB）和视网膜光感受器神经元发育的研究（图1）揭示了调控路径导向、突触形成、轴突修剪以及神经元发育其他多个方面的分子机制10,11,12,13,14,15,16,17。光感受器神经元将果蝇视网膜与脑内称为视神经叶（lamina）和髓质（medulla）的区域相连，对向大脑传递视觉信息至关重要（综述见18,19）；而蕈形体神经元位于果蝇脑中央，是学习与记忆所必需的20,21。光感受器神经元和蕈形体的内在神经元（称为Kenyon细胞）均利用进化上保守的可扩散性因子和依赖接触的轴突导向机制，以定位其突触后靶标。除了可在成体果蝇中观察外，光感受器神经元和MB神经元还可通过抗体或报告基因在幼虫和蛹期直接可视化22,23,24,25。能够在不同发育时间点便捷地观察这两类神经元，使其成为研究神经元发育多个方面的理想模型。
除了作为研究正常神经系统发育机制的模型外，近期研究还表明，果蝇也可作为多种人类疾病的精确模型，包括脆性X综合征（Fragile X Syndrome, FXS）26、智力障碍（Intellectual Disability, ID）27,28,29,30,31以及其他疾病32。例如，为了研究ZC3H14的分子功能（该基因最近被发现与人类智力障碍相关），我们利用果蝇ZC3H14同源基因Nab2的无效等位基因构建了智力障碍的果蝇模型30。缺乏Nab2的果蝇表现出严重的记忆障碍以及延长的多聚腺苷酸尾（poly(A) tail），重现了在人类患者或源自患者的细胞系中观察到的现象33,34。更重要的是，缺乏Nab2的果蝇在成年个体的蘑菇体中也表现出严重的脑形态学缺陷34，这与缺乏脆性X综合征相关基因FMR1的果蝇所表现出的缺陷相似35。因此，果蝇可作为研究正常脑发育及其相关疾病的重要模式生物。
最后，高通量行为监测方法的可及性，结合大量可用的遗传工具，使Drosophila成为识别控制复杂行为（如学习与记忆、睡眠、求偶、口渴等）的脑区的首选模式生物36,37,38,39。在果蝇遗传学家的&#34;工具箱&#34;中，一个尤为有用的工具是GAL4/UAS系统（图2）。该系统40,41利用Gal4转录激活因子的组织特异性表达，来增强上游激活序列（UAS）下游基因或转基因的表达。对该系统的改进使得研究人员能够精确控制特定神经元的兴奋性42,43，过表达或敲低特定目的基因44,45，在活体中分析实时钙动力学in vivo46，以及表达报告基因以标记神经元谱系41。将GAL4/UAS系统与有丝分裂重组相结合，还促成了可抑制细胞标记的嵌合体分析（MARCM）系统的建立12,47。MARCM已被广泛应用于单神经元示踪，以鉴定轴突导向所需的细胞信号组分12,47。尽管这些及其他技术已为神经系统功能所需的细胞机制提供了诸多宝贵见解，但大多数技术要求首先解剖Drosophila脑；为保持脑的正确形态及脑区之间的连接模式，需谨慎地取出脑组织。以下实验方案以蘑菇体和感光神经元为例，指导您完成成年Drosophila脑的解剖及免疫荧光染色。

<table><tbody><tr><td>显微解剖镊子</td><td>Ted Pella</td><td>505-NM</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 培养皿</td><td>Living Systems Instrumentation</td><td>DD-50-S-BLK</td><td>可从 amazon.com 购买</td></tr><tr><td>Fas2 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>1D4</td><td></td></tr><tr><td>Chaoptin 抗体</td><td>发育研究杂交瘤库（Developmental Studies Hybridoma Bank）</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Aves Lab</td><td>GFP-1010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 山羊抗小鼠二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 山羊抗鸡二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa647 山羊抗小鼠二抗</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21236</td><td></td></tr><tr><td>20% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscope Services</td><td>RT15713</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 载玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>99-910-01</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>12-553-454</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠缓冲液（一碱）</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钠缓冲液（二碱）</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ml</td><td></td></tr><tr><td>指甲油</td><td>Electron Microscope Services (EMS)</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica S6D 配 KL300 LED 光源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>9 孔板（点样板）</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>振荡器/摇床</td><td>Fisher</td><td>22-363-152 或 88-861-041</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Fisher</td><td>50-366-794</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe 纸巾</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;潜在固定缓冲液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTN 缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.1 M NaPhosphate，pH 7.2，0.1% Triton-X-100。通常配制 0.5 L 的 0.1 M NaPhosphate 缓冲液，并根据需要每次分装 50 ml</td></tr><tr><td>PLP 缓冲液</td><td></td><td></td><td>2% 多聚甲醛，0.01 M NaIO₄，0.075 M 赖氨酸，0.037 M NaPO₄，pH 7.2。将 0.36 g 赖氨酸溶解于 10 ml H₂O 中，加入 7.5 ml 0.1 M NaH₂PO₄（pH 7.2）和 2.5 ml 0.1 M Na₂HPO₄，置于冰上。使用前立即混合：取 15 ml 上述缓冲赖氨酸溶液，加入 50 mg NaIO₄（高碘酸钠）+ 2 ml 20% 高纯度多聚甲醛（EMS）+ 3 ml H₂O</td></tr><tr><td>PEM 缓冲液</td><td></td><td></td><td>0.1 M PIPES（pH 7.0），2 mM MgSO₄，1 mM EGTA。该缓冲液可方便地配制成 2× 储存液，并与 8% 多聚甲醛（PFA）混合，得到终浓度为 4% PFA 的溶液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;来自布卢明顿（Bloomington）的果蝇品系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>elav (c155)-GAL4</td><td></td><td>BL458</td><td>泛神经元 GAL4 驱动子</td></tr><tr><td>w*;;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 854</td><td>所有蘑菇体神经元的 GAL4 驱动子（OK107-GAL4 插入位于第 4 号染色体）</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4</td><td></td><td>BL 7362</td><td>α 和 β 叶的 GAL4 驱动子（位于第 2 号染色体）</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); c739-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64305</td><td>α 和 β 叶的 GAL4 驱动子，同时含有 UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; 201Y-GAL4</td><td></td><td>BL 4440</td><td>主要驱动蘑菇体 γ 叶的 GAL4（位于第 2 号染色体）</td></tr><tr><td>y(1), w(67c23); 201Y-GAL4, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 64296</td><td>蘑菇体 γ 叶的 GAL4 驱动子，同时含有 UAS-CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP; FRTG13, Tub&gt;Gal80/CyO</td><td></td><td>BL 5145</td><td>MARCM 品系，含有位于第 2 号染色体的 FRT 位点和 GAL80</td></tr><tr><td>w*, elav (c155)-GAL4, hsFLP, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL5146</td><td>MARCM 品系，含有 hsFLP、泛神经元 GAL4 和位于 X 染色体的 CD8-GFP</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;;FRT82B, Tub&gt;GAL80/TM3, Sb(1);OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44408</td><td>用于翻转第 3 号染色体的 MARCM 品系</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP;FRT40A, Tub&gt;GAL80;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL44406</td><td>用于翻转第 2 号染色体的 MARCM 品系</td></tr><tr><td>w*, hsFLP, tub&gt;GAL80, FRT19A; UAS-CD8-GFP/CyO;;OK107-GAL4</td><td></td><td>BL 44407</td><td>用于翻转 X 染色体的 MARCM 品系</td></tr><tr><td>y(1), w*; UAS-CD8-GFP/CyO</td><td></td><td>BL 5137</td><td>GFP 标记细胞膜（CD8 是一种跨膜蛋白）</td></tr><tr><td>y(1), w*; FRTG13, UAS-CD8-GFP</td><td></td><td>BL 5139</td><td>MARCM 品系，含有位于第 2 号染色体的 FRT 位点和 CD8-GFP</td></tr><tr><td>y(1), w*, hsFLP, UAS-CD8-GFP; Pin(1)/CyO</td><td></td><td>BL 28832</td><td>MARCM 品系，含有位于 X 染色体的 hsFLP 和 CD8-GFP</td></tr><tr><td>w*; FRTG13, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5140</td><td>MARCM 品系，含有位于第 2 号染色体的 FRT 位点和 GAL80</td></tr><tr><td>y(1), w*;; FRT82B, Tub&gt;GAL80</td><td></td><td>BL 5135</td><td>MARCM 品系，含有位于第 3 号染色体的 FRT 位点和 GAL80</td></tr></tbody></table>

成年黑腹果蝇（drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

神经系统发育涉及一系列有序的事件，这些事件由多种信号通路和调控网络协同控制。参与这些通路的许多蛋白质在哺乳动物与其他真核生物（如果蝇）之间具有进化上的保守性。 黑腹果蝇，表明这些生物在发育过程中存在类似的组织原则。重要的是， 果蝇 已广泛用于鉴定调控哺乳动物多种过程的细胞和分子机制，这些过程包括神经发生、分化、轴突导向以及突触形成。果蝇也已成功用于模拟多种人类神经发育性疾病。本文描述了一种针对成年果蝇大脑中蛋白质进行逐步显微解剖、固定及免疫荧光定位的实验方案 黑腹果蝇 大脑。本方案聚焦于两类示例性神经元群体：蘑菇体神经元和视网膜感光细胞，并包含可选步骤，利用带有可抑制细胞标记的镶嵌分析技术（Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker, MARCM）对单个蘑菇体神经元进行示踪。文中展示了来自野生型和突变型大脑的示例数据，并简要描述了用于评估轴突导向缺陷的评分标准。尽管本方案重点介绍了两种广泛使用的抗体，用于研究蘑菇体和感光细胞神经元的形态，其他 果蝇 也可利用本方案研究其他脑区及其内蛋白质的定位。

本方案描述了成年个体的解剖与免疫染色方法 黑腹果蝇 脑组织。具体而言，本方案重点介绍了使用 果蝇 以蘑菇体和光感受器神经元为例，这些神经元亚群可被准确用于揭示神经元发育多个方面的普遍规律。

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

神经系统发育涉及一系列有序的事件，这些事件由多种信号通路和调控网络协同调控。许多……

本果蝇脑解剖方案的总体目标是从成年果蝇中获取完整的脑组织，可用于多种实验应用，例如免疫荧光、GFP标记蛋白的定位以及离体培养实验。该方法有助于回答发育生物学和神经科学领域的关键问题，例如特定蛋白质和信号通路的功能，以及在脑发育过程中神经元连接模式的建立。该技术的主要优势在于，一旦掌握，即可快速高效地通过免疫学方法鉴定成年果蝇脑特定区域的形态学缺陷。该操作步骤可能较难掌握，因为从果蝇头部去除外骨骼需要极大的细心和练习。操作时动作必须缓慢而有条不紊，同时应妥善支撑解剖器械的臂部以保持稳定。建议先用红眼果蝇进行练习，再用白眼果蝇练习，最后再对实验中感兴趣的基因型果蝇进行实际解剖。进行解剖前，将需要的已麻醉果蝇置于冰冷的金属板上，或放在冰上的培养皿中。或者，也可使用能释放二氧化碳的果蝇麻醉垫。接着，在解剖皿中央加入少量 PTN，形成一个 PTN 气泡。然后，在体视显微镜下，于均匀照明条件下用PTN气泡充满视野。接着操作果蝇使其腹部朝上，并用镊子夹住其腹部将其转移至PTN中。将果蝇完全浸没于PTN内，并在整个解剖过程中始终保持其浸没在PTN中。用另一把镊子夹住吻部，将头部从身体上拉下。有时吻部被移除后，头部仍附着在身体上。若发生此情况，夹住一侧视网膜的内侧边缘，施加侧向力以去除头部。弃去腹部和胸部。此步骤中必须将头部保留在PTN中。无法利用该方法分析中枢脑与腹神经索之间的连接。接下来，用镊子夹住左侧视网膜在头壳中央孔边缘处的内侧边缘，缓慢地将镊子直接向两侧拉开，以防止撕裂被白色丝状气管覆盖的不透明结构——视叶。当视网膜逐渐分离时，张力会略有下降。为防止脑组织撕裂，关键是要夹住每只眼的内侧边缘，并极其缓慢地将镊子分开。移动过快可能导致脑形态改变或脑组织损伤。如图所示，用每把镊子夹住头壳，并极缓慢地向相反方向拉开。若操作正确，头壳应与脑组织分离，而脑组织保持完整。需要使用非常锋利的镊子进行此步骤。接下来，仔细地将周围附着的角质层逐片移除。在去除顽固附着的角质层时，可通过夹住残留的腹神经索来固定脑组织，以避免压碎脑组织。最后，使用 P200 移液器将解剖得到的脑组织转移至含有 PTN 的孔板中，用于固定和免疫染色。在显微镜下，使用 P200 移液器将 10 到 15 个相同基因型的解剖脑组织转移至一个装有 4% 用 PTN 稀释的多聚甲醛的 0.5 毫升微量离心管中。随后，在室温下缓慢振荡孵育 20 分钟。固定后，让脑组织沉降至管底，然后移除固定液。接着用500 µL PTN溶液快速洗涤两次，每次洗涤在脑组织沉降至管底后立即更换PTN溶液。接下来，在室温下用 PTN 轻柔振荡进行三次长时间洗涤。洗涤后，脑组织可在 PTN 中于 4 摄氏度下保存过夜。除去最后一次 PTN 洗涤液后，将脑组织在 0.5 毫升封闭液中于室温下孵育至少 30 分钟，并保持轻柔振荡。除去封闭液后，加入用封闭液稀释的一抗，并在4°C条件下轻轻振荡孵育脑组织两天。使用五次PTN洗涤程序去除一抗，然后加入二抗。将这些抗体与组织在室温下避光振荡孵育三小时。在脑组织与二抗溶液孵育后，进行PTN洗涤步骤。每次洗涤后用铝箔包裹样品，并尽可能彻底去除缓冲液。接下来，加入 75 µL 荧光抗淬灭封片介质，将脑组织和介质在移液枪头中吸入和推出仅一次。样品管可用铝箔包裹后于 4 °C 保存数天，但最好立即进行封片。为封片脑组织，需构建一个桥式载玻片。将两张载玻片放置在带正电的载片上，间距约为1厘米。确保带正电的一面朝上。然后用指皮油将盖玻片粘附在载片上，并在继续操作前让指皮油完全干燥。接下来，将载玻片置于体视显微镜下，用移液器将脑组织和培养基转移到盖玻片之间的空隙中。务必调整照明条件以改善脑组织的观察效果。随后，小心吸除载玻片上多余的封片介质，注意避免触碰脑组织。然后，用吸水纸吸去残留的封片剂。这有助于更精确地定位脑组织。现在，使用镊子将脑组织按网格状排列，使其嗅觉叶朝上。然后，将盖玻片覆盖在脑组织上，并使用透明指甲油密封顶部盖玻片与底部盖玻片相连的边缘。接着，向中心腔室逐滴加入新鲜封片剂，使封片剂通过毛细作用渗入盖玻片下方。当腔室完全充满后，用透明指甲油彻底密封。所述方法可用于可视化成年大脑中的几乎所有结构，包括蘑菇体。该脑区对学习和记忆至关重要。可使用识别束蛋白2（fasciculin 2蛋白）的抗体，对蘑菇体进行清晰的可视化观察。该蛋白在α叶和β叶以及位于中央的椭球体中高表达。该技术有助于鉴定出多种对蘑菇体神经元轴突导向至关重要的细胞过程。这些过程的破坏会导致多种突变表型，例如轴突在脑中线区域异常投射以及α叶缺失。这些突变表型通常外显不完全，因此需要检测多个大脑样本。为了研究某蛋白在轴突导向过程中所起的自主性作用，也可采用Markham技术，在无荧光的野生型背景下，观察单个表达GFP的突变型或野生型神经元的轴突导向决策。本文所述方法可实现对成年黑腹果蝇（Drosophila）脑部几乎所有区域的可靠且可重复的可视化观察。本文中，我们重点关注了蘑菇体神经元。在本实验方案的文字版本中，我们还展示了视叶的可视化方法。其他研究已采用类似技术实现了对间脑 pars intercerebralis、生物钟神经元以及触角叶投射神经元等多种神经结构的可视化。一旦掌握技巧，若操作得当，每只大脑可在 3 至 5 分钟内完成解剖。进行此操作时，需注意将手臂靠近显微镜以保持稳定，同时应缓慢移动，每次仅移除一小块头壳组织。移动过快可能会对下方脑组织造成不必要的损伤。除了将解剖得到的脑组织用于基于免疫荧光显微镜的实验外，脑组织还可用于其他实验。

dissection-immunofluorescent-staining-mushroom-body-photoreceptor

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

成人果蝇脑内蘑菇体和感光神经元的解剖和荧光染色

本文中，我们演示了如何从三龄黑腹果蝇幼虫中解剖出中枢神经系统。...

黑腹果蝇幼虫中枢神经系统的解剖

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。...

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

果蝇（Drosophila）视网膜是一种晶体状的晶格结构，由少数几种以固定模式生成的细胞类型组成1。其适用于复杂的遗传学分析，可用于研究复杂的发育程序。本实验方案描述了在三个不同发育阶段进行视网膜解剖及免疫组织化学的方法，重点聚焦于光感受器细胞的分化过程。...

幼虫、蛹及成虫 Drosophila 视网膜的解剖与免疫组织化学

本视频介绍了一种将成年果蝇完整大脑在桥式盖玻片下进行封片的方法，并展示了对免疫荧光染色的大脑样本执行该操作的实验流程。...

成年样本的制备 果蝇 大脑：用于共聚焦成像的切片制备方法

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Drosophila 成虫脑解剖：果蝇神经生物学中的一种方法

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黑腹果蝇Drosophila melanogaster幼虫盘的解剖与免疫染色

一种简单的单步解剖方案用于成年个体整体装片制备 果蝇 大脑

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直接冷冻切片 果蝇 用于增强脑组织荧光染色与免疫染色的头部装置

学习成年果蝇大脑解剖与免疫荧光染色技术，用于研究蘑菇体和感光神经元的发育与连接模式。该方法可快速识别神经形态缺陷，为神经科学研究提供可靠工具。

成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）大脑中蘑菇体与光感受器神经元的解剖及免疫荧光染色

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