成人果蝇脑内蘑菇体和感光神经元的解剖和荧光染色

该果蝇脑解剖方案的总体目标是从成年果蝇中获得完整的大脑，这些大脑可用于广泛的应用，例如免疫荧光、GFP 标记的蛋白质定位和离体培养实验。这种方法可以帮助我们回答发育生物学和神经科学领域的关键问题，例如特定蛋白质和信号通路的作用以及在大脑发育过程中建立神经元连接模式。这项技术的主要优点是，一旦掌握，它就提供了一种快速有效的方法，用于免疫学识别成人大脑特定区域的形态缺陷。

这个程序可能很难学习，因为从苍蝇头上取下外骨骼需要大量的小心和练习。你的动作必须缓慢而谨慎，解剖者的手臂必须得到很好的支撑才能保持稳定。在实际解剖感兴趣的基因型以进行实际实验之前，先先对红眼苍蝇和白眼果蝇进行练习是个好主意。

为了进行解剖，将感兴趣的麻醉果蝇放在冷金属垫上或放在冰上的培养皿中。或者，使用会排放二氧化碳的飞垫。接下来，在解剖皿的中心放置少量 PTN，形成一个 PTN 气泡。

然后，在体视显微镜下，在均匀照明下用 PTN 气泡填充视野。现在，纵苍蝇，使它们腹部朝上，并通过腹部将一只苍蝇转移到 PTN。将动物完全浸入 PTN 中，并在浸入 PTN 中进行整个解剖。

用第二对镊子抓住喙并将头部从身体上拉出。偶尔，喙会被移除，但头部会保持附着在身体上。如果发生这种情况，请抓住一个视网膜的内侧边缘并施加侧向力以移除头部。

丢弃腹部和胸部。在此步骤中，将磁头保持在 PTN 中至关重要。显然无法使用这种方法分析从中枢脑到 VNC 的连接。

接下来，在角质层中央孔的边缘抓住左视网膜的内侧边缘，慢慢地将镊子直接拉开，以防止视叶撕裂，视叶是被白色细长气管覆盖的不透明结构。随着视网膜解离，张力会略有降低。为了防止大脑撕裂，抓住每只眼睛的内侧边缘并非常缓慢地将镊子拉开至关重要。

移动太快会导致大脑形态改变或脑组织损伤。如图所示，用每对镊子抓住角质层，然后非常缓慢地将它们向相反的方向拉动。如果作正确，角质层应与脑组织分离，保持大脑完整。

此步骤需要非常锋利的镊子。接下来，小心地一块一块地去除周围的角质层。在去除顽固附着的角质层时，它可以通过抓住剩余的 VNC 来帮助保护大脑，以避免压碎大脑。

最后，使用 P200 移液器将解剖的大脑转移到装有 PTN 的板的孔中，用于固定和免疫染色。在显微镜下，使用 P200 移液器将 10 至 15 个相同基因型的解剖脑转移到装有 4% 多聚甲醛（在 PTN 中稀释）的 0.5 毫升微量离心管中。然后，在室温下缓慢摇动大脑孵育 20 分钟。

固定后，让大脑沉降到管的底部，然后取出固定剂。接下来，进行两次快速洗涤，每次洗涤 500 μL PTN。一旦大脑在管中沉淀下来，就交换 PTN。

接下来，在室温下用 PTN 进行 3 次长时间洗涤，轻轻搅拌。在这些洗涤之后，大脑可以在 PTN 中在 4 摄氏度下储存过夜。去除最后一次 PTN 洗涤液后，在室温下将大脑在 0.5 mL 封闭溶液中孵育至少 30 分钟，并轻轻搅拌。

去除封闭溶液后，加入在封闭溶液中稀释的一抗，并在 4 摄氏度下轻轻搅拌大脑孵育两天。使用 5 次洗涤 PTN 洗涤方案去除一抗。然后，涂抹二抗。

让这些抗体在室温下与组织孵育 3 小时，同时通过摇动避光。在二抗溶液中孵育大脑后，应用 PTN 洗涤方案。每次洗涤后用箔纸覆盖样品，最后去除尽可能多的缓冲液。

接下来，加入 75 μL 荧光抗褪色封固剂，将脑和培养基流入和流出移液器吸头一次。然后可以用箔纸包裹管子并在 4 摄氏度下储存几天，但理想情况下，直接进行安装。要安装大脑，请构建一个桥滑梯。

将两个基盖相距约 1 厘米放置在带正电的载玻片上。确保带正电的一面朝上。然后，用指甲油将盖玻片粘在载玻片上，让抛光剂完全干燥后再继续。

接下来，将载玻片置于立体显微镜下，将大脑和培养基移液到盖玻片之间的空间中。请务必调整照明以改善大脑的可视化。接下来，从载玻片中吸出额外的封固剂，小心避开大脑。

然后，吸走剩余的多余封固剂。这将使大脑能够更精确地定位。现在，使用镊子将大脑定向成网格状，它们的触角叶朝上。

然后，将盖玻片放在大脑上，并使用指甲油密封附着在基盖玻片上的顶盖玻片的边缘。现在，用新的封片剂逐滴加载中心腔，通过毛细管作用将介质吸入盖玻片下方。填充空腔后，使用透明指甲油将其完全密封。

所描述的方法可用于可视化成人大脑内的几乎任何结构，包括蘑菇体。大脑的这个区域是学习和记忆所必需的。使用识别肌束菌素 2 蛋白的抗体可以很容易地观察蘑菇体。

这种蛋白质在 α 和 β 叶以及位于中央的椭球体中高度表达。该技术允许识别蘑菇体神经元正确轴突导向所需的多个细胞过程。这些过程的破坏会导致多种突变表型，例如跨大脑中线区域的轴突投射不适当和 α 叶缺失。

这些突变表型通常是不完全渗透的，因此需要检查多个大脑。为了检查蛋白质在轴突寻路中的自主作用，Markham 技术还可用于在非荧光野生型背景下可视化单个 GFP 阳性突变体或野生型神经元的轴突导向决策。此处描述的方法允许对成年果蝇大脑的虚拟区域进行可靠且可重复的可视化。

在这里，我们专注于蘑菇体神经元。在该协议的文本版本中，我们还演示了视叶的可视化。其他研究使用类似的技术来可视化 pars intercerbrílis、clock 神经元和 antennal lobe projection 神经元等。

一旦掌握，如果作得当，每个大脑都可以在 3 到 5 分钟内解剖。在尝试此程序时，请务必记住将手臂稳定在显微镜附近。缓慢移动并一次去除一小块角质层也很重要。

移动过快可能会对下面的脑组织造成不必要的损伤。除了将解剖的大脑用于基于免疫荧光的显微镜实验外，脑组织还可以用于其他实验。