制药行业因不锈钢表面不洁净导致的清洁验证失败
2017年8月11日
在清洁验证过程中，回收率低且结果不稳定的主要原因是缺乏一种能够持续有效清洁试片表面的明确定义的操作程序。本文描述了清洁不锈钢试片的正确方案。
本研究的总体目标是通过应用小分子、治疗性蛋白质和抗体分析清洁方法开发的最佳实践，从不锈钢试片表面获得高且可重复的药物残留回收率。该方法有助于解答制药行业清洁验证领域中的关键问题，例如为何制药生产设备的清洁验证会失败。本研究的主要优势在于，展示了用于分析方法验证的不锈钢试片表面的正确清洁步骤。
开始本实验时，首先在计算出药物的清洁限值后，用所选稀释剂配制药物的样品溶液。用纯化水冲洗不锈钢试片，并用擦拭材料擦拭表面10至15秒，重复两次。然后，用甲醇重复上述冲洗和擦拭步骤，以去除任何残留物。
为了使用原位清洗溶液进行高级清洁，将试片浸入高效液相色谱或HPLC级水中，超声处理两分钟。将试片浸入含0.1%碱性清洁剂的HPLC级水溶液中，超声处理两分钟。再次将试片浸入HPLC级水中，并重复两分钟超声处理。
然后，将它们浸入含有0.1%酸性洗涤剂溶液的HPLC级水中，超声处理两分钟。再用HPLC级水超声处理两分钟以完成清洗。接着，使用双面胶带将不锈钢试片固定在250毫升塑料烧杯底部。
操作过程中应手持烧杯，以便进行加标和拭子取样，并避免发生意外。使用正向置换移液器，将特定体积、特定浓度和剂型的药物以旋涡状模式注入载体表面。待载体表面干燥后，将干燥的拭子浸入含有两毫升稀释液的小瓶中。
将拭子按压在小瓶内壁以去除多余的溶剂。使用湿润拭子的一侧，以均匀且相互重叠的左右往复擦拭动作，牢固擦拭试样表面，直至完成总共50平方厘米的测试区域。使用拭子的同一侧重复擦拭过程。
用拭子对试片的四条边缘各擦拭两次。将试片旋转90度，使用拭子的另一面，同时将擦拭方向也旋转90度。以相同方式使用拭子的这一面重复清洁，确保对试片的四条边缘各擦拭两次。
表面擦拭后，使用剪刀将拭子头剪入溶剂小瓶中。随后，使用第二根拭子重复整个擦拭操作，同时将试样片沿之前选定的同一方向旋转90度。接下来，将含有两根拭子头的小瓶超声处理5分钟。
然后，将小瓶涡旋振荡10秒。最后，将溶液转移至高效液相色谱（HPLC）小瓶中，并标记为工作溶液。为回收样品，通过将每份对照品加标溶液或样品溶液200微升与1,800微升稀释剂混合，制备对照溶液。
根据文本方案使用这些溶液进行色谱分析。基于工作溶液与对照溶液色谱峰下相对面积，计算拭子工作溶液的回收率。对三个样品重复此过程，以计算平均回收率和相对标准偏差。
在对样品片进行清洗之前，无论活性药物成分（API）与辅料的比例、不同实验人员，甚至同一名实验人员在不同日期进行操作，不同加标水平的回收率结果均不一致。大多数回收率结果的相对标准偏差较高。当调整多个不同参数时，回收率中观察到的变异性仍未消除，这些参数包括擦拭技术、稀释液、加标溶剂、加标溶液和稀释液的pH值、加标方法以及提取方法。
每个试片表面的个体回收率与平均回收率之间的差异表明，不同试片表面的平均回收率存在差异，因此，观察到的变异性很可能来源于试片表面之间的差异。在按照本方案所述的试片清洗步骤操作后，回收结果在多次试验之间具有良好的可重复性，试片间的回收率差异极小。本实验中进行的试片清洗使回收率高于90%。此外，每个加标水平的相对标准偏差值均在可接受范围内，且小于清洗前获得的结果。
一旦掌握，若操作得当，清洗试片可在30分钟内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记如何正确地加标和回收，同时避免损失目标分析物。观看本视频后，您应能充分理解如何正确清洁不锈钢表面，以获得高且可重复的残留物回收率。
该技术问世后，为制药行业的研究人员提供了可靠的生产过程清洁数据，开辟了新的途径。
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概述
本研究针对不锈钢试片上药物残留清洁验证中的挑战，提出了一种经过验证的方案，可实现残留物的高回收率和可重复性。
关键研究组成部分
科学领域
- 药品清洁验证
- 分析方法开发
- 表面清洁技术
背景
- 清洁验证在制药行业中至关重要。
- 不一致的清洁程序会导致回收率波动。
- 不锈钢试片常用于验证。
- 正确的清洁方法对于获得准确的分析结果至关重要。
研究目的
- 建立不锈钢试片的可靠清洁方案。
- 提高药品残留物的回收率。
- 解决清洁验证过程中的失败问题。
使用的方法
- 用选定的稀释剂制备药物样品溶液。
- 计算特定药物的清洁限度。
- 用水冲洗不锈钢试片。
- 用布擦拭表面 10 至 15 秒。
- 用甲醇重复冲洗和擦拭以去除残留物。
主要结果
- 所述方法可有效清洁不锈钢表面。
- 实现了对制药残留物的高回收率且结果具有良好的重现性。
- 该方案解决了清洁验证中的关键问题。
- 有助于更深入地理解制药环境中的清洁过程。
结论
- 实施正确的清洁程序可提高回收率。
- 本研究为未来的清洁验证研究提供了框架。
- 适当的清洁方法对于分析方法验证至关重要。
常见问题
行业应用价值
由于不锈钢表面残留物回收率不稳定，导致清洁验证结果不一致，这在药品生产中构成重大风险，可能导致清洁验证出现假阴性结果，进而影响产品安全性。本研究确定表面清洁不充分是造成回收率变异的主要来源，并提出了一种标准化的在线清洁（CIP）方案，该方案可确保对分子量不超过50,000 Da的小分子和大分子生物药物均实现高（>90%）且可重复的回收率。通过为分析用试片建立可靠的清洁程序，该方法支持对清洁工艺进行准确评估，有助于基于数据制定设备清洁决策，并降低交叉污染的风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：确保残留回收数据反映的是分析物的真实存在，而非由表面差异引起的变异性，从而支持在早期筛选中对化合物行为的准确解读。
- 操作价值：提供可重复的样品片制备步骤，最大限度减少不同分析人员之间以及同一天内残留回收测量的变异性。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：能够稳定回收小分子药物（<1,000 Da）和大分子生物分子（高达 50,000 Da），适用于多种模式筛选项目的统一应用。
- 操作价值：在就地清洗（CIP）后实现低相对标准偏差（Srel ≤4%），确保高通量残留分析的检测精度与可靠性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过提供标准化的表面制备方法，减少将回收率差异错误归因于制剂或生物因素的情况，支持分析结果从发现阶段向临床前阶段的转化。
- 操作价值：通过明确定义且可重复的试片清洗程序，促进不同研究间清洁验证数据的可比性。
流程与工作流整合
该方法作为关键的预处理步骤，整合到发现与开发工作流程中，用于在化合物加标之后、拭子回收及色谱分析之前对验证检测进行清洁处理，确保所测得的回收率反映的是真实的残留水平，而非因表面清洁不充分所导致的人为假象。
- 发现生物学：消除回收数据中的表面相关噪声，使研究人员能够在早期研发阶段专注于解读化合物黏附性或制剂效应的真实情况。
- 筛选：通过提供一致且高回收率的表面，确保分析方法的就绪状态，支持对具有不同理化性质的化合物进行可靠的评估。
- 分析：生成变异度低的定量回收测量结果（Srel ≤4%），从而准确比较不同清洗条件及制剂影响。
- 转化研究：通过在各项研究中标准化关键变量——表面清洁度，保持从早期研发到临床前阶段清洗验证数据的连续性。
- 企业级复用：建立一种可重复使用、标准化的不锈钢试片制备流程，可在多个实验室和项目中推广应用，减少方法偏差，提升数据完整性。
运营与企业影响
- 科学价值：通过区分真实的残留物水平与表面引起的变异性，提高清洁验证的预测置信度，减少清洁工艺评估中的机理模糊性。
- 操作价值：通过定义明确、基于超声处理的在位清洗（CIP）程序，增强清洁验证分析的标准性和可重复性，最大限度降低依赖操作人员的变异。
- 战略价值：提供可靠的清洁数据，支持在制剂和工艺开发中做出更优的“通过/不通过”决策，从而降低后期生物制品和污染风险。
- 产品组合影响：基于可论证、低变异性的清洁验证结果，实现对药物候选物和生产工艺的风险调整型优先级排序。
实施注意事项
- 需要经过正确的拭子采样技术、超声时间控制和溶液操作处理方面的培训，以确保清洁和回收步骤的一致性执行。
- 依赖于高纯水（HPLC级）、超声波清洗仪、碱性和酸性清洗剂溶液以及正排量移液器，以实现准确的加标操作。
- 为保持不同实验室和班次间结果的可重复性，需在不同团队间对清洁时间、溶液浓度和拭子采样模式进行标准化。
- 当将该方案应用于不同试片几何形状或材料时，需考虑适应性调整；尽管该方法已针对分析验证中常用的不锈钢表面完成验证。
- 实际限制包括清洁后需小心操作以避免再次污染，以及加标前必须将试片完全干燥，以防止稀释效应。
