Name: 诱导麻痹及视觉系统损伤小鼠 T 细胞特异的视神经脊髓炎抗原水通道蛋白-4 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 了解如何通过过继转移AQP4特异性T细胞诱导中枢神经系统自身免疫性疾病，并使用光学相干断层扫描技术无创监测视网膜损伤。该方法有助于研究视神经脊髓炎中T细胞的作用。

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S.S.Z. 获得了美国国立卫生研究院（RO1 AI073737 和 RO1 NS092835-01）、国家多发性硬化症协会（RG 4768、RG 5179 和 RG 5180）、梅辛基金会以及古西·杰克逊慈善基金会的支持。

所有动物实验均遵循加州大学旧金山分校机构动物护理和使用委员会批准的实验指南进行。8周龄C57BL/6（H-2b）雌性小鼠购自供应商，C57BL/6 AQP4-/-小鼠由A. Verkman提供。
1. 使用 AQP4 肽段对小鼠进行免疫
<ol>
	<li>制备完全弗氏佐剂（CFA）工作液。
	<ol>
		<li>使用研钵和研杵将干燥的结核分枝杆菌（M. tuberculosis，H37Ra）菌体制备物充分研磨成细粉。</li>
		<li>将研磨后的H37Ra加入不完全弗氏佐剂中，终浓度为4 mg/mL。CFA可在4 °C保存最多6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冻干的抗原（Ag）AQP4多肽溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中，终浓度为1 mg/mL。置于4 °C或冰上保存。</li>
	<li>准备由两个带鲁尔锁扣的注射器通过旋塞连接组成的装置，用于盛装CFA/多肽乳剂。
	<ol>
		<li>将一个无活塞的玻璃鲁尔锁扣注射器连接至具有两个雄性鲁尔锁扣接口的三通尼龙旋塞上。通过将旋塞手柄转向注射器方向关闭旋塞。将注射器开口端朝上放置，使其起到试管作用。将其置于试管架中以增加稳定性。</li>
		<li>涡旋混匀CFA工作液和抗原溶液。按1:1体积比将多肽溶液与CFA加入开口的注射器中。每只小鼠需要200 µL的CFA/Ag乳剂（4 × 50 µL）。 
		注意：通常约有1 mL的液体残留在旋塞中，这会减少可用于免疫接种的体积。因此，在计算所需总体积时必须考虑这一损耗。 
		示例：免疫5只小鼠所需总量为：(200 µL/只 × 5只) + 1 mL额外体积 = 共需2 mL CFA/Ag乳剂。</li>
		<li>将玻璃活塞插入注射器，并在固定活塞的同时将注射器倒置，使旋塞朝上。将旋塞手柄切换至未使用的雌性接口。轻轻推动玻璃活塞，排出注射器中的多余空气，使液体充满旋塞的第二个雄性鲁尔锁扣连接口。</li>
		<li>将第二个玻璃注射器（活塞完全插入）连接到旋塞的第二个雄性鲁尔锁扣接口上。此时应形成一个由两个玻璃注射器通过旋塞连接的封闭系统，尽量减少多余空气的存在。</li>
		<li>通过交替推动两个注射器的活塞来回转移液体，持续约2分钟以形成乳剂。将注射器置于冰上冷却约10分钟。重复冷却和混合操作，直至制剂黏度发生明显变化，形成非常黏稠的白色乳剂。将含有乳剂的注射器置于4 °C冰箱中冷藏或始终置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将全部乳剂转移至其中一个玻璃鲁尔锁扣注射器中，取下空的玻璃注射器，替换为1 mL鲁尔锁扣注射器用于注射。用乳剂充满新注射器，从旋塞上取下，并安装针头（25G × 5/8）。</li>
	<li>&#34;进行“水测试&#34;以检测乳剂的一致性。将一滴乳剂挤入盛有少量水的小培养皿中。乳剂不应扩散，表明其适合注射。
	<ol>
		<li>若乳剂在水中扩散，则尚未达到注射要求；需将液体重新转移回玻璃注射器中，继续混合并再次冷却，直至乳剂变得黏稠。</li>
		<li>重复测试乳剂，直至达到理想的一致性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对供体AQP4-/-小鼠皮下（s.c.）注射含AQP4多肽的乳剂。每只小鼠接受4次皮下注射（每次50 µL，共200 µL，含多肽100 µg）。4个注射部位包括下腹部两侧（引流至腹股沟淋巴结[LN]）以及胸部两侧腋窝内侧区域（引流至腋窝淋巴结[LN]）。每只受体小鼠进行过继转移时需使用1–2只免疫后的供体小鼠。</li>
</ol>
2. T细胞培养与促炎性T细胞极化
<ol>
	<li>免疫后10-12天，从小鼠中收集淋巴结（LN）。
	<ol>
		<li>在冰盘中准备装有细胞筛（孔径70 µm）并含有冷的含10%热灭活胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素-100 µg/mL链霉素（青-链霉素，pen-strep）的RPMI培养基（RFPS）的60 mm培养皿。</li>
		<li>通过暴露于CO2处死小鼠，随后进行颈椎脱位。将小鼠浸入70%乙醇中，然后将每只脚掌固定在解剖板上。</li>
		<li>从腹股沟至颈部以及沿每条腿向下做正中皮肤切口。将皮肤从腹膜拉开，并紧绷地固定在板上。解剖腹股沟和腋窝淋巴结，并将其放入盛有RFPS、置于冰上的培养皿中。19</li>
		<li>对于过继转移实验，合并同一免疫组内所有动物的淋巴结。对于Vβ使用情况的流式细胞术分析，应分别保留各只动物的淋巴结。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有淋巴结的细胞筛置于装有RFPS的50 mL离心管上。使用无菌5 mL注射器活塞的平端将淋巴结细胞压过筛网，并用20-30 mL RFPS冲洗，以促进细胞回收。在整个处理过程中，始终将淋巴结细胞置于冰上，直至开始培养。</li>
	<li>以393 x g离心5分钟，洗涤两次。第二次洗涤后，将淋巴结细胞重悬于T细胞培养基（TCM）中。TCM包含RPMI培养基，添加10%热灭活FBS、292 µg/mL L-谷氨酰胺、110 µg/mL丙酮酸钠、55 µM 2-巯基乙醇以及青-链霉素。通常每只供体小鼠使用5 mL TCM。</li>
	<li>计数淋巴结细胞。预期每只免疫小鼠供体可获得约3-6 x 107个淋巴结细胞。预留3-4 x 106个细胞用于增殖实验（见下文第3节）。</li>
	<li>建立用于过继转移的极化培养体系（第6节）。
	<ol>
		<li>在TCM中，以每毫升5 x 106个淋巴结细胞、10 µg/mL抗原（Ag）、20 ng/mL重组小鼠白细胞介素（IL）-23和10 ng/mL重组小鼠IL-6的条件建立Th17极化培养体系。</li>
		<li>或者，对于Th1极化，在TCM中以每毫升5 x 106个淋巴结细胞、10 µg/mL抗原和10 ng/mL重组小鼠IL-12的条件建立培养体系。</li>
		<li>将2 mL极化培养混合物（含1 x 107个细胞）加入12孔板的每个孔中。2-4只供体小鼠的淋巴结细胞可填满一块12孔板。将培养物置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养72小时。</li>
		<li>在培养48小时和72小时时，肉眼观察淋巴结细胞的活化情况。活化的细胞会形成大量细胞簇，T细胞体积增大，形态更加多形性。代谢增强会导致培养基pH值下降，颜色由桃色变为橙色。若pH值过低导致培养基变黄，应加入1 mL新鲜TCM，以防止剩余24小时中细胞发生毒性损伤。</li>
		<li>继续进行第6节的过继转移操作。可通过胞内细胞因子染色（ICS）验证极化效率，方法见第5节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用单只小鼠来源的淋巴结建立培养体系，用于表面Vβ表达的流式细胞术分析（第4节）。
	<ol>
		<li>在TCM中，以每毫升5 x 106个淋巴结细胞和10 µg/mL抗原的条件建立培养体系。</li>
		<li>将2 mL培养物（含1 x 107个细胞）加入12孔板的每个孔中。培养物应在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养10天。随后进行第4节操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 增殖实验
注意：此步骤接第 2.4 节。
<ol>
	<li>准备 3-4 mL LN 细胞悬液于离心管中，细胞浓度为 2 x 106 每毫升 TCM 中的细胞数</li>
	<li>轻轻翻转离心管数次以混匀细胞，然后转移至无菌槽中。</li>
	<li>使用多通道移液器将细胞以每孔100 µL接种至96孔圆底组织培养板中。通常，为4种抗原浓度及无抗原对照设置三个复孔，共接种15孔。</li>
	<li>将Ag以不同浓度（通常为80、20、5、1和0 µg/mL，配制2倍储备液）稀释于TCM中。每种浓度取100 µL，设三个重复，加入后终浓度分别为40、10、2.5、0.5和0 µg/mL。于37 °C孵育约72 h。 
	注意： 步骤3.5至3.7涉及放射性物质。应根据机构和政府 regulations 正确使用、监测和处置放射性物质。</li>
	<li>配制工作液储备溶液 3H-胸腺嘧啶核苷（40 µCi/mL），通过加入1 mCi 3将H-胸苷加入25 mL RPMI中，4 °C保存。取0.5 mL工作液加入无菌槽中。</li>
	<li>加入 25 µL 的 3每孔加入1 µCi的H-胸腺嘧啶脱氧核苷，使用多通道移液器操作。于37 °C继续孵育18小时。</li>
	<li>使用96孔细胞收集器将细胞收集至玻璃纤维滤膜上，并用70%乙醇冲洗。干燥后，将滤膜与5 mL闪烁液一同密封于塑料样品袋中。使用闪烁计数器测定每孔的放射性活性。</li>
</ol>
4. 细胞表面TCR Vβ表达的流式细胞术分析
注意：可从商业途径获得用于检测小鼠 TCR Vβ 2、3、4、5.1 和 5.2、6、7、8.1 和 8.2、8.3、9、10b、11、12、13、14 以及 17a 的抗体。
<ol>
	<li>检测 TCR Vβ 时，通过反复吹打将 T 细胞从培养板上脱离，并将细胞转移至离心管中。</li>
	<li>用含 2% FBS、0.1% 叠氮化钠和 2 mM EDTA 的 FACS 缓冲液（FB）洗涤细胞。</li>
	<li>将细胞以每孔 1 × 105 至 3 × 106 个细胞的密度转移至 V 型底 96 孔板中。若需检测完整的 Vβ 抗体组合，则应将细胞分装至多个孔中（每孔检测一种 Vβ）。</li>
	<li>使用 LIVE/DEAD 活性染料对细胞进行染色，以在流式细胞术分析中排除死细胞。该染料可与坏死细胞暴露的游离胺基发生反应。按照制造商说明进行离心及重悬于活性染料的操作，并在冰上孵育 10–20 分钟。在整个细胞染色过程中，需避光并保持细胞处于冰上。</li>
	<li>孵育后，用 FB 洗涤一次。为检测 TCR Vβ，将细胞重悬于 100 µL FB 中，其中加入 CD4（克隆号 RM4-5）和 TCR Vβ 抗体，稀释比例为 1:100。在冰上孵育 15–60 分钟。</li>
	<li>用 FB 洗涤一次，然后通过加入 200 µL 用 PBS 稀释的 4% 多聚甲醛固定细胞。在冰上孵育 20 分钟。再次用 FB 洗涤后，进行流式细胞术分析。</li>
</ol>
5. 胞内细胞因子产生的流式细胞术分析
<ol>
	<li>进行细胞内细胞因子染色（ICS）时，在ICS前4小时，向T细胞培养物中加入1:1,000稀释的蛋白转运抑制剂试剂（例如GolgiPlug）于TCM中，以防止细胞因子分泌。此时，使用50 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和500 ng/mL离子霉素激活T细胞，以诱导蛋白产生。</li>
	<li>在37 °C培养4小时后，通过反复吹打使细胞从培养板上脱落，并转移至离心管（15或50 mL）中。</li>
	<li>用FB洗涤。将细胞重悬于FB中，并以每孔5 × 105至3 × 106个细胞的密度转移至V型底96孔板中。</li>
	<li>按照上述方法（第4.2节）使用活力染料对细胞进行染色。孵育后，用FB洗涤一次。</li>
	<li>按以下方式加入表面标志物检测抗体：
	<ol>
		<li>为检测表面标志物，将细胞悬浮于100 µL含有1:100稀释的CD4抗体（克隆RM4-5）的FB中。</li>
		<li>可选地，加入1:100稀释的B220抗体（克隆30-F11）和CD11b抗体（克隆M1/70），以分别改善B细胞和单核细胞/巨噬细胞的设门效果。通常，PE-Cy7标记的抗CD4、FITC标记的抗B220以及PerCP-Cy5.5标记的抗CD11b效果良好。抗体/荧光染料偶联物的选择应根据用于分析的流式细胞仪配置而定，且抗体的最佳浓度应通过实验确定。</li>
		<li>在冰上孵育15–60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用FB洗涤平板，并将细胞重悬于200 µL固定/透化溶液中，在冰上孵育20分钟。此步骤可固定细胞并透化细胞膜。</li>
	<li>为在细胞内染色过程中维持细胞膜的通透性，使用Perm/Wash缓冲液（PW）（以1:10稀释10X储备液）代替FB。用200 µL PW洗涤各孔。</li>
	<li>进行ICS时，使用1× PW将干扰素（IFN）-γ和IL-17A的抗体稀释至1:100。一种可行方案是使用APC标记的抗IFN-γ（克隆XMG1.2）和PE标记的抗IL-17A（克隆eBio17B7），效果良好。将细胞重悬于100 µL细胞内抗体混合液中，孵育至少15分钟。也可在4 °C下继续染色过夜。</li>
	<li>用200 µL PW洗涤各孔，然后重悬于FB中用于流式细胞术分析。</li>
	<li>同时，准备一份未染色样本（不含抗体的FB中细胞），用于优化检测器电压；并为每种单独的荧光染料准备单染样本（即仅用一种抗体/荧光染料染色的细胞或补偿微珠），以确定补偿溢出值。</li>
	<li>使用流式细胞仪采集≥10,000个细胞（事件），设门于活细胞（LIVE/DEAD阴性）CD4+细胞。为确保T细胞设门准确，排除B220+和CD11b+细胞（分别为B细胞和单核细胞/巨噬细胞）。在CD4+ T细胞亚群中，确定表达IFN-γ（Th1谱系）或IL-17A（Th17谱系）的细胞百分比。</li>
</ol>
6. 过继性转移致病性AQP4特异性T细胞
注意：此步骤接续第 2.5 节：T 细胞培养与促炎性 T 细胞极化。
<ol>
	<li>用移液器反复吹打12孔板中的细胞，使其脱离，收集至50 mL离心管中。注射前保持冰上放置。</li>
	<li>计数细胞，用预冷的PBS洗涤两次，并用PBS配制成浓度为1 × 108 个细胞/mL的悬液。通常在1小时内完成注射。</li>
	<li>注射时轻轻涡旋混匀细胞，转移至1 mL注射器中。每只小鼠经尾静脉静脉注射（i.v.）200 µL细胞悬液（含2 × 107 个细胞）。</li>
	<li>每只受体小鼠在当天及两天后，分别腹腔注射（i.p.）用200 µL PBS稀释的200 ng B. pertussis 毒素。每日观察小鼠临床疾病症状。</li>
</ol>
7. ATCA的临床评估
<ol>
	<li>每天观察受体小鼠是否出现中枢神经系统自身免疫的临床症状。通常情况下，小鼠在过继转移AQP4特异性T细胞后5-8天会出现中枢神经系统自身免疫的症状。小鼠将表现出神经系统功能障碍的临床症状。建议对未处理的正常小鼠进行评估，以明确小鼠正常的生理能力。</li>
	<li>评估小鼠尾张力的丧失情况。轻轻抓住小鼠尾根部并将其垂直提起。若尾巴持续下垂，则定义为尾张力丧失（评分为1分）。尾张力丧失通常是临床疾病的首发体征。</li>
	<li>通过将小鼠仰卧放置于平坦表面来测试其翻正反射。翻正动作缓慢提示躯干共济失调（评分为2分）。未处理的小鼠会强烈抵抗被置于仰卧位，因此任何翻正动作的迟缓均应记为功能障碍。通常需重复测试3-4次以确认该反射情况。</li>
	<li>评估小鼠姿势与行走能力。小鼠开始出现姿势改变，表现为行走时臀部下垂或拖地（评分为2.5分）。病情进一步发展可导致单肢瘫痪（一个后肢完全瘫痪，评分为3.0分）和截瘫（双侧后肢完全瘫痪，评分为3.5分）。中度四肢轻瘫（四肢均无力）会导致前进行动极为缓慢（评分为4分）。重度四肢轻瘫则几乎无法向前移动（评分为4.5分）。最终，严重疾病状态下小鼠可能进入濒死状态或死亡（评分为5分）。</li>
	<li>对于丧失摄取液体或固体食物能力的小鼠，腹腔注射1 mL生理盐水配制的5%葡萄糖溶液。&#160;也可使用液体凝胶杯、高热量凝胶或培根软食进行营养补充，以缓解脱水和饥饿。对濒死小鼠实施安乐死。</li>
</ol>
8. 组织制备与组织学
<ol>
	<li>用 100 mg/kg 的氯胺酮和 10 mg/kg 的赛拉嗪麻醉小鼠，然后将每只脚掌固定在解剖板上。</li>
	<li>打开胸腔，暴露心脏。切开肝脏以允许血液流出。将蝴蝶针连接到微型可调速泵的管路上，分别使用独立的容器盛装 PBS 和 10% 甲醛。将针头插入心脏左心室，先用 5 mL PBS 灌注，随后用 25 mL 10% 甲醛灌注。</li>
	<li>取下头部，然后取出眼睛。眼睛和视网膜的处理方法如前所述20。横切眼眶，在鼻部插入剪刀，沿两侧从前向后剪开颅骨。
	<ol>
		<li>取下颅骨，暴露视神经，剪断视交叉，并将其置于两个泡沫垫之间的包埋盒中。</li>
		<li>先浸入 10% 甲醛（24 小时），然后转入 50% 乙醇（24 小时），最后转移至 70% 乙醇中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取出脑组织和脊髓并置于 10% 甲醛中。将脑组织连续冠状面切片；脊髓则先进行矢状面切片（约取半侧），再进行连续冠状面切片（每只小鼠约取 20 个横截面）。</li>
	<li>按常规方法处理中枢神经系统样本，进行石蜡包埋。对 8 µm 厚的切片进行苏木精-伊红染色（视神经）或Luxol 快蓝-苏木精-伊红染色（脑和脊髓）。</li>
	<li>评估视神经是否存在神经内部及周围脑膜的炎症（视神经炎），或主要位于周围脑膜的炎症（视神经周围炎）。</li>
	<li>对每只小鼠的脑和脊髓样本，计数脑膜和实质内的炎性病灶（&#62;10 个聚集的单核细胞）。</li>
</ol>
9. 体内 光学相干断层扫描（OCT）视网膜成像
注意：小鼠的谱域OCT视网膜成像使用商用设备进行（例如，采用 Spectralis 联合 TruTrack 眼球追踪系统以实现稳定的眼球定位并减少运动伪影。
<ol>
	<li>成像前5分钟，使用1%托吡卡胺&#160;（每眼一滴）散大瞳孔，并将待成像小鼠放入麻醉诱导舱中，持续通入2升/分钟的1.5%异氟烷。打开加热垫，并准备好麻醉后恢复笼。</li>
	<li>将小鼠放置在成像圆柱体上，并相应调整麻醉气体流向。使用0.3%羟丙基甲基纤维素保护眼睛，以保持眼球湿润并确保折射连续性。在待检查的眼睛上放置定制的接触镜。</li>
	<li>根据红外眼底图像引导，将激光对准眼睛，确保光束中心位于视神经乳头。通过垂直和水平OCT扫描确认视网膜与激光垂直。</li>
	<li>在高分辨率模式下进行25次B扫描，并基于30次平均A扫描进行光栅化。</li>
	<li>完成双眼成像后，取下接触镜并涂抹眼用凝胶。将小鼠留在温暖的恢复笼中。</li>
</ol>
10. OCT 的处理与分析
<ol>
	<li>使用模块化成像软件进行自动分割。
	<ol>
		<li>手动校正对应于内界膜（ILM）和内丛状层（IPL）的分割区域，这两个层代表了内层视网膜（IRL）的边界21。</li>
		<li>确认视网膜神经纤维层（RNFL）和神经节细胞层（GCL）位于内层视网膜（IRL）边界之内，且无重叠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用早期治疗糖尿病视网膜病变研究（ETDRS）2 的网格系统，以视盘为中心，分别设置直径为1 mm、2 mm和3 mm的同心圆区域，计算内层视网膜（IRL）厚度，并导出至电子表格文件。软件通过计算每个网格扇区的平均值来确定各视网膜层的厚度，因此对应视神经乳头的中央区域被排除在外。</li>
	<li>分析各时间点组间的统计学差异。对每只小鼠的双眼数据进行分析，采用具有可交换相关矩阵的广义估计方程，并对同一受试个体双眼之间的相关性进行校正21。</li>
</ol>

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S.A. Sagan、A. Cruz-Herranz、C.M. Spencer、P.P. Ho、L. Steinman、A.J. Green 和 R.A. Sobel 无任何利益冲突披露。S.S. Zamvil 是《神经病学、神经免疫学与神经炎症》（Neurology, Neuroimmunology and Neuroinflammation）的副主编，并担任国际神经免疫学学会顾问委员会成员。他曾任《临床研究杂志》（Journal of Clinical Investigation）、《免疫学杂志》（The Journal of Immunology）和《神经学科学杂志》（The Journal of Neurological Sciences）的编委会成员，并曾是美国国立卫生研究院（NIH）临床神经免疫学与脑肿瘤（CNBT）研究组的创始成员，以及美国国家多发性硬化症学会（NMSS）的成员。他曾担任 Biogen-Idec、EMD-Serono、Genzyme、Novartis、Roche/Genentech 和 Teva Pharmaceuticals, Inc. 的顾问并获得酬金，并曾或正在 Lilly、BioMS、Teva 和 Opexa Therapeutics 的数据安全监查委员会任职。目前，Zamvil 博士的研究工作获得来自 NIH、NMSS、Maisin 基金会、Biogen 和 Celgene 的资助。

AQP4于2005年被确定为NMO IgG的主要靶点3随后，人们认识到建立一种以AQP4为靶点的中枢神经系统自身免疫动物模型具有重要意义。这种模型可用于研究AQP4特异性的T细胞和B细胞在中枢神经系统自身免疫发生过程中的作用，并可用于测试视神经脊髓炎（NMO）的候选治疗药物。尽管早在2010年已有研究首次报道在野生型小鼠中鉴定出AQP4特异性T细胞表位13，针对这些表位的T细胞未引起临床或组织学疾病14,17无法基于对AQP4的免疫反应建立中枢神经系统自身免疫模型的问题一直是个谜，直到2015年Jones, 等25 发现水通道蛋白4（AQP4）p135-153致敏的供体T细胞来源于AQP4-/- 小鼠能够诱导野生型小鼠出现中枢神经系统自身免疫的临床及组织学表现。值得注意的是，AQP4 p135-153 被预测可结合 MHC II（I-Ab具有高亲和力17. 预测仅有一个其他 AQP4 氨基酸序列（201-220）可结合 I-Ab 具有相似的高亲和力。事实上，我们观察到 AQP4 p135-153 和 p201-220 均能在 AQP4 中引发强烈的增殖反应-/-，但非野生型小鼠。在此，我们展示了如何从AQP4小鼠中分离并扩增具有脑炎诱导性的、针对AQP4 p135-153和p201-220的Th17 T细胞-/- 小鼠。当将供体AQP4反应性Th17细胞转移至野生型受体小鼠时，可诱导产生瘫痪，伴随脊髓和视神经中单核细胞浸润。在AQP4抗体阳性NMOSD患者中，传入性视觉系统损伤已有明确报道。26在此，我们观察到由靶向AQP4和靶向MOG的Th17细胞诱导的视神经炎症存在差异。AQP4特异性Th17细胞主要引起视神经周围炎，而MOG特异性Th17细胞则导致严重的视神经炎。我们还描述了利用连续光学相干断层扫描（OCT）监测AQP4特异性和MOG特异性T细胞诱导的视神经炎症的技术方法。其他研究者现可应用本文所述方案，推动其针对ATCA致病机制的深入研究。
可以轻松避免本方案中的三个潜在陷阱。首先，ATCA的过继转移需要使用来自AQP4免疫小鼠的AQP4特异性T细胞。-/- 供体小鼠。具体而言，供体野生型AQP4 p135-153特异性T细胞未在受体野生型小鼠中引发ATCA。其次，进行一项 &#34;水测试&#34; 在AQP4免疫前，加入一滴肽/CFA乳剂-/- 小鼠（实验方案步骤1.5）。乳剂若适合皮下注射，则不应在水中分散。若乳剂在水中发生分散，应再次混合乳剂，重新冷藏后重复水测试。最后，活化的供体中枢神经系统（CNS）抗原特异性T细胞比静息T细胞更高效地诱导CNS自身免疫反应。在收获供体T细胞进行过继转移前，应使用光学显微镜对细胞培养物进行直观检查。快速增殖的细胞可能形成易于识别的细胞簇。此外，当培养物中含有大量活化T细胞时，由于pH值降低，培养基颜色可能由粉红色变为橙色甚至黄色。也可通过细胞增殖情况评估供体水通道蛋白4（AQP4）致敏的淋巴结T细胞的活化状态。 3H-胸腺嘧啶核苷掺入，如方案步骤3所述。
我们发现两种致病性 AQP4 T 细胞表位（1）预测可高亲和力结合 MHC II 类分子，且（2）可在 AQP4-/- 小鼠中引发强烈的增殖反应，但在野生型（WT）小鼠中则不能，这提示靶向这些表位的 T 细胞通常受到胸腺阴性选择的控制17。在 AQP4-/- 小鼠中识别 AQP4 p135-153 和 p201-220 表位所使用的 TCR 库具有独特性（图 2），这也与由胸腺髓质上皮细胞介导的克隆删除机制相一致。其他耐受机制也可能在正常情况下抑制针对 AQP4 的免疫应答。继我们最初的报道17之后，另一研究团队也证实 AQP4 p201-220 包含一个致脑炎性 T 细胞决定簇27。当用 AQP4-/- CD4+ T 细胞重建 α/β（TCRα-/-）T 细胞缺陷小鼠后，能够诱导出致脑炎性的 AQP4 特异性 T 细胞应答，但无法诱导 AQP4 特异性体液应答，这表明在野生型小鼠中，AQP4 特异性 B 细胞应答与 AQP4 特异性 T 细胞应答类似，也受到阴性选择的调控。事实上，在仅由 AQP4 特异性 T 细胞诱导的 ATCA 模型中，野生型小鼠并未出现脊髓轴突和视网膜神经节细胞（RGCs）的丢失，而这种损伤可能需要致病性 AQP4 特异性抗体的参与。显然，随着我们对正常调控 AQP4 特异性 T 细胞和 B 细胞免疫的耐受机制了解的深入，针对 AQP4 的中枢神经系统自身免疫小鼠模型将持续发展和完善。
其他针对AQP4的中枢神经系统自身免疫模型也正在开发中6,16,28,29,30。每种模型可能在研究与视神经脊髓炎（NMO）发病机制相关的特定方面时具有各自的优势。已在野生型大鼠中鉴定出AQP4特异性T细胞6,16,29。这些AQP4特异性T细胞可引起中枢神经系统自身免疫的组织学改变，但与小鼠中的观察结果类似，野生型大鼠的AQP4特异性T细胞不会引发明显的临床疾病症状。因此，在野生型小鼠中限制T细胞和B细胞产生AQP4特异性免疫反应的耐受机制在大鼠中同样发挥作用。尽管如此，不应低估利用小鼠模型研究疾病发病机制相关机制的强大能力。大量基因敲除、转基因和报告基因小鼠资源可被有效利用。还应认识到，自身免疫领域的多项基础性发现均是通过小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型实现的。例如，T细胞克隆可针对自身抗原介导自身免疫性疾病31,32、T细胞共刺激在自身免疫中的作用33以及Th17细胞分化发育通路的发现34，最初均是通过小鼠EAE模型首次描述的。利用我们所建立的小鼠ATCA模型，现在可以在体内研究致病性AQP4特异性免疫反应的发生与调控过程，这将为理解NMO的发病机制提供重要的科学依据。

视神经脊髓炎（Neuromyelitis optica，NMO）是一种中枢神经系统（CNS）自身免疫性炎性脱髓鞘疾病，可导致反复发作的瘫痪和视力丧失，最终造成永久性神经功能障碍1。目前认为NMO主要是一种体液性自身免疫性疾病2，因其与靶向星形胶质细胞上高表达的水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP4）的抗体（Igs）相关3,4。然而，中枢神经系统炎症是AQP4 Ig进入CNS的前提条件5,6。因此，仅通过转移抗AQP4 Ig尚无法建立NMO动物模型。已有研究发现：（1）NMO患者体内致病性的AQP4特异性Ig属于IgG1亚类1,2，而IgG1是一种依赖T细胞的Ig亚型7；（2）在NMO病变组织中可检测到T细胞的存在8,9；（3）NMO与某些MHC II类基因相关（例如HLA-DR17（DRB1*0301））10；（4）NMO患者体内存在扩增的促炎性AQP4反应性、DR限制性Th17细胞11,12。上述证据均表明AQP4特异性T细胞在NMO发病机制中发挥关键作用。因此，建立动物模型以明确AQP4特异性T细胞如何参与NMO发病过程具有重要意义。
几年前，在野生型（WT）小鼠13,14和大鼠15中已鉴定出多个AQP4 T细胞表位。尽管观察到AQP4反应性T细胞可在未经处理的受体大鼠中诱导视脊髓炎症15,16，但并未观察到明显的中枢神经系统疾病临床症状。类似地，用包含AQP4 T细胞表位的肽段直接免疫野生型小鼠14,17，或转移靶向这些表位的促炎性T细胞17，均未引起中枢神经系统自身免疫的临床症状或组织学证据。
最近观察到，用AQP4肽段（p）135-153或p201-220免疫C57BL/6 AQP4缺陷型（AQP4-/-）小鼠可诱导强烈的CD4+ T细胞反应，这两种肽段被预测可高亲和力结合MHC II类分子（I-Ab）1817。相比之下，这两种肽段在野生型（WT）小鼠中仅引起较弱的增殖反应。此外，来自AQP4-/-小鼠的T细胞识别这些表位所使用的T细胞受体（TCR）库具有独特性。综合这些发现表明，T细胞对AQP4的识别受到胸腺阴性选择的调控。来自AQP4-/-供体小鼠的AQP4 p135-153或p201-220特异性Th17细胞可在近100%的未经处理的野生型受体小鼠中诱导瘫痪；该过程伴随视神经脊髓区域T细胞、B细胞和单核细胞的浸润。连续进行的视神经脊髓光学相干断层扫描（OCT）显示视觉系统受累呈动态变化。经历T细胞介导的靶向AQP4中枢神经系统自身免疫（ATCA）的小鼠可从瘫痪和视觉系统损伤中恢复。与由髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）p35-55特异性T细胞诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）不同——后者导致持续的临床疾病——仅由T细胞诱导的ATCA并不伴随轴突丢失或视网膜神经节细胞（RGCs）数量减少。我们的研究结果明确表明，存在多个致病性的AQP4 T细胞表位。这一新型ATCA模型有助于研究调控致病性AQP4特异性T细胞发育的机制，揭示这些细胞如何引发中枢神经系统炎症，以及它们如何与AQP4特异性B细胞和抗体协同促进视神经脊髓炎谱系疾病（NMO）的发病过程。
在本报告中，我们描述了用于诱导和评估T细胞介导的ATCA的实验方案。首先介绍用于免疫接种、T细胞培养及Th17极化以生成致病性AQP4特异性T细胞的技术，通过流式细胞术分析确认T细胞极化效果，并进行T细胞过继转移。随后，我们阐述了评估受体小鼠临床表现和组织病理学病变的方法，以及利用连续光学相干断层扫描（OCT）监测视觉系统损伤的技术。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;span class=&quot;字体8&quot;&gt;M. tuberculosis &lt;/span&gt;&lt;/em&gt;&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;H37Ra&lt;/span&gt;</td><td>BD Difco</td><td>231141</td><td>干燥，死亡 &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;字体8&quot;&gt;M. tuberculosis&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>不完全弗氏佐剂</td><td>BD Difco</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>AQP4肽p135-153</td><td>Genemed</td><td>定制合成</td><td>肽序列：LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td></tr><tr><td>AQP4肽p201-220</td><td>Genemed</td><td>定制合成</td><td>肽序列：HLFAINYTGASMNPARSFGP</td></tr><tr><td>MOG 肽 p35-55</td><td>Genemed / Auspep</td><td>定制合成</td><td>肽序列：MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>Kimble</td><td>420163-4503</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 胎牛血清（经鉴定）</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-23</td><td>R&amp;amp;D Systems (BioTechne)</td><td>1887-ML</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-6</td><td>R&amp;amp;D Systems (BioTechne)</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-12</td><td>R&amp;amp;D Systems (BioTechne)</td><td>419-ML</td><td></td></tr><tr><td>胸苷 [甲基-&lt;span class=&quot;font12&quot;&gt;&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;H]&lt;/span&gt;</td><td>PerkinElmer</td><td>NET027</td><td></td></tr><tr><td>玻璃纤维滤膜</td><td>PerkinElmer</td><td>1450-421</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠抗体</td><td>eBioscience（Affymetrix）</td><td>[各种]</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 TCR V&amp;beta; 筛选面板</td><td>BD Biosciences</td><td>557004</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定死细胞染色试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>[各种]</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（16%）</td><td>电子显微镜科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>含GolgiPlug的固定/透化溶液试剂盒</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin（钙盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素来自 &lt;em&gt;&lt;span class=&quot;字体8&quot;&gt;百日咳杆菌&lt;/span&gt;&lt;/em&gt;</td><td>List 生物学实验室</td><td>181</td><td></td></tr><tr><td>10% 甲醛</td><td>VWR</td><td>89370-094</td><td></td></tr><tr><td>可变流速蠕动泵</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td></td></tr><tr><td>泡沫活检垫，矩形</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-221</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（Isothesia，异氟醚，USP）</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>050033</td><td>NDC：11695-0500-2</td></tr><tr><td>托吡卡胺眼用溶液，USP（1%）</td><td>Akorn</td><td></td><td>NDC：17478-102-12</td></tr><tr><td>Spectralis 诊断成像平台</td><td>海德堡工程</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

诱导特异性针对视神经脊髓炎自身抗原水通道蛋白-4的t细胞在小鼠中引发瘫痪和视觉系统损伤

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

尽管已知水通道蛋白-4（AQP4）特异性T细胞和抗体参与视神经脊髓炎（NMO）的发病过程——一种累及人类中枢神经系统（CNS）的自身免疫性脱髓鞘疾病，但构建一种同时具备临床表现和组织学特征的靶向AQP4的CNS自身免疫动物模型仍具挑战性。野生型（WT）小鼠经AQP4多肽免疫后可诱导T细胞增殖，但这些T细胞无法将疾病传递给未经处理的受体小鼠。近期，在AQP4缺陷型（AQP4-/-）小鼠中研究针对AQP4的免疫应答时，新鉴定出两个AQP4 T细胞表位：多肽（p）135-153和p201-220，提示对这些表位的T细胞反应通常受到胸腺阴性选择的调控。经p135-153或p201-220致敏的AQP4-/- Th17极化T细胞可导致受体WT小鼠出现瘫痪，且伴随以脊髓和视神经软脑膜为主的炎症。视神经周围的炎症以及内层视网膜（IRL）的受累可通过连续光学相干断层扫描（OCT）观察到相应改变。本文阐述了构建这一新型靶向AQP4的中枢神经系统自身免疫（ATCA）体内模型所采用的方法，该模型可用于研究致病性AQP4特异性T细胞发育的机制，以及它们在NMO发病过程中如何与B细胞协同作用。

在本实验方案中，我们使用了来自 C57BL/6 AQP4-/- 小鼠的供体 T 细胞。用含有致病性 T 细胞表位的 AQP4 p135-153 或 p201-220 对这些小鼠进行皮下免疫后，在引流淋巴结中诱导出强烈的 T 细胞增殖反应（图 1），而这两个肽段在野生型（WT）小鼠中诱导的 T 细胞增殖反应则弱得多。相比之下，使用含有非致病性 AQP4 T 细胞决定簇的 AQP4 p91-11013 或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽段 MOG p35-55（一种可激活引发实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的 T 细胞的髓鞘肽段）22,23,24 进行免疫时，AQP4-/- 小鼠与 WT 小鼠产生的 T 细胞增殖反应幅度相似。通过流式细胞术对单个 Vβ 或 Vβ 家族进行染色以分析 TCR 的使用情况，结果表明，AQP4-/- 小鼠中针对 p135-153 和 p201-220 的特异性 T 细胞使用了独特的 TCR 库。AQP4 p135-153 和 p201-220 在 AQP4-/- 小鼠中选择性地出现高增殖现象，以及其独特的 TCR 使用模式（图 2），提示针对这些决定簇的致病性 T 细胞反应通常受到胸腺阴性选择的调控，这凸显了在本方案中使用 AQP4-/- 供体 T 细胞的重要性。
在进行过继转移以诱导ATCA之前，将来自AQP4肽致敏小鼠的淋巴结细胞在体外分别于Th17或Th1极化条件下培养三天。通过胞内细胞因子染色（ICS）并结合流式细胞术检测，确认供体CD4+ T细胞的极化程度（图3）。将2 × 107个供体AQP4肽特异性T细胞经尾静脉注射至 naive 受体小鼠。约六天后，几乎所有受体小鼠均出现中枢神经系统自身免疫性疾病的临床症状，包括尾部无力和后肢瘫痪（图4）。与Th1极化的AQP4特异性T细胞相比，Th17极化的AQP4特异性T细胞诱导出更严重的临床疾病。接受Th17型AQP4肽特异性T细胞并发展为完全性后肢瘫痪（截瘫）的代表性小鼠见视频1。与MOG特异性Th17细胞诱导产生EAE的小鼠不同，接受AQP4特异性Th17细胞的小鼠其临床症状随后有所恢复。与MOG p35-55特异性Th17细胞诱导的EAE类似，AQP4 p135-153特异性或p201-220特异性Th17细胞诱导的临床疾病也伴随单核细胞在中枢神经系统实质和脑膜中的浸润（图5）。在AQP4特异性Th17细胞诱导的中枢神经系统自身免疫中，脑膜中的病灶较实质中更为丰富。
通过组织学评估和系列光学相干断层扫描（OCT）证实了视神经受累。AQP4特异性与MOG特异性的Th17细胞均诱导了视神经炎症，其特征为单核细胞浸润。AQP4特异性Th17细胞引起视神经周围炎，而MOG特异性Th17细胞则诱导严重的视神经炎（图5）。通过系列OCT检测发现，由AQP4特异性或MOG特异性Th17细胞诱导的临床疾病中，视神经炎症表现为视神经肿胀及内层视网膜（IRL）厚度增加（图6）。在AQP4特异性Th17细胞诱导的中枢神经系统自身免疫病中，随着小鼠临床症状的恢复，IRL厚度恢复至基线水平。相反，由MOG特异性Th17细胞诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）持续存在，对应于IRL变薄，且如我们先前所证实17，与视网膜神经节细胞的丢失相关。
<img alt="AQP4抗原反应图；增殖与抗原；比较分析；图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：AQP4 p135-153 和 p201-220 在 AQP4-/- 小鼠中诱导强烈的T细胞增殖，但在野生型小鼠中不诱导。 小鼠通过皮下注射用完全弗氏佐剂（CFA）中指定的多肽进行免疫。11天后，取出淋巴结，并用无抗原或多肽进行培养，多肽即为免疫所用多肽。通过3H-胸苷掺入法测定增殖（平均值 ± 标准误，代表5次实验）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示AQP4和MOG肽反应中CD4+ T细胞Vβ使用的柱状图；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：来自AQP4-/-小鼠的AQP4特异性T细胞使用独特的TCR库。AQP4-/-小鼠和野生型（WT）小鼠用指定的肽段进行免疫。11天后，取出淋巴结并用免疫所用肽段进行体外培养。收集细胞，通过流式细胞术分析TCR Vβ的使用情况（均值 ± 标准误，n = 5）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞因子产生（IL-17A、IFN-γ）的流式细胞术散点图，来自Th1、Th17及未极化细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：供体AQP4特异性T细胞的促炎性极化。 使用AQP4 p135-153或p201-220肽免疫后第11天，收集淋巴结细胞，并在非极化条件、Th1极化条件或Th17极化条件下，用免疫所用肽段进行体外培养。分别通过胞内细胞因子染色（ICS）和流式细胞术检测Th17或Th1极化情况，分析IL-17或IFN-γ的表达。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="AQP4 p135-220 与 MOG p35-55 转移后的临床评分曲线；Th1 与 Th17 比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：经Th17极化的AQP4特异性T细胞在野生型受体小鼠中诱导瘫痪。野生型受体小鼠接受了来自AQP4-/-小鼠的2 × 107个供体Th17极化的AQP4 p135-153或p201-220特异性T细胞。Th17极化的MOG特异性T细胞作为阳性对照。结果代表8次独立实验（n = 5/组）。* p &lt;0.05，** p &lt;0.01，*** p &lt;0.001。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脊髓和视神经的组织学；野生型、AQP4、MOG；免疫反应比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：AQP4特异性Th17细胞在野生型小鼠中诱导视脊髓炎症。受体小鼠接受来自AQP4-/-小鼠的2 × 107个供体Th17细胞，这些细胞经AQP4 p135-153或p201-220肽段致敏，或MOG p35-55特异性Th17细胞，并于10天后处死。制备脊髓和视神经组织，采用H&amp;E和LFB染色分别评估炎症和脱髓鞘的证据。结果代表每组5只小鼠的典型情况。比例尺 = 50 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IRL 厚度与移植后天数的关系图，包含 AQP4、MOG 和未处理组；数据分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图 6：由 AQP4 特异性 Th17 细胞诱导的视神经炎症可通过纵向视网膜 OCT 进行监测。野生型受体小鼠在第 0 天接受 2 × 107 个供体来源的、经 Th17 极化的 AQP4 p201-220 特异性或 MOG p35-55 特异性 T 细胞。在第 0 天（T 细胞给药前）以及第 4、7、8、9、10、11、14 和 21 天通过 OCT 进行检测。测量 IRL 厚度（均值 ± 标准误）。统计学分析表示与未处理对照组的比较。结果代表 3 次独立实验（每组 5 只小鼠）。* p &lt;0.05，** p &lt;0.01，*** p &lt;0.001。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种通过将水通道蛋白-4（AQP4）特异性T细胞从AQP4-/-小鼠转移至野生型（WT）小鼠，以诱导瘫痪和视神经脊髓炎症的实验方案。此外，我们还展示了如何利用连续光学相干断层扫描来监测视觉系统功能障碍。

诱导特异性针对视神经脊髓炎自身抗原水通道蛋白-4的T细胞在小鼠中引发瘫痪和视觉系统损伤

尽管已知水通道蛋白-4（AQP4）特异性T细胞和抗体参与视神经脊髓炎（NMO）的发病机制，但人类……

本方案的总体目标是通过过继性转移水通道蛋白4（aquaporin 4，简称AQP4）特异性T细胞，诱导中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，并监测其对中枢神经系统及动态视觉系统造成的影响。该方法将有助于解答关于AQP4特异性T细胞在视神经脊髓炎以及其他炎性视觉障碍疾病中作用的关键问题。光学相干断层扫描（optical coherence tomography）的主要优势在于能够以非侵入性方式对视网膜损伤进行纵向监测。演示该操作的是本实验室的研究助理 Sharon Sagan 以及 RE Greens 实验室的博士后研究员 Andreas Cruz Harans。首先，将一个带有两个雄性鲁尔锁扣接头的三通尼龙旋塞阀连接到无活塞的玻璃鲁尔锁扣注射器上。将旋塞阀的开关拨向注射器方向以关闭旋塞阀，并将注射器竖直放置，开口端朝上。涡旋后，向注射器中加入等体积的多肽和完全弗氏佐剂溶液，重新将玻璃活塞插入注射器中。固定活塞位置，将注射器倒置，使旋塞朝上，然后将旋塞手柄切换至未使用的雌性接头。小心下压活塞，以排出注射器中的多余空气。溶液将充满三通阀的第二个雄性鲁尔锁接头。然后将第二个玻璃注射器（活塞完全插入）连接到该雄性鲁尔锁接头上。为形成乳液，交替推动两个注射器的活塞，使溶液在两个注射器之间转移约两分钟，并将溶液冷却约10分钟，直至观察到溶液黏度发生明显变化。当形成非常粘稠的白色乳状液时，将全部溶液转移至其中一个注射器中，并将空的注射器替换为一个新的1毫米鲁尔锁注射器。用乳状液填充该新注射器。取下注射器与旋塞阀的连接，安装一根25号规格的针头。为检测乳剂的一致性，可将其一滴挤入盛有少量水的小皿中进行水试。若乳剂不扩散，则可用于注射。随后，将每只供体 AQP4 基因敲除小鼠在下腹部两侧以及腋窝内侧的胸壁两侧各皮下注射一次。免疫后10至12天，沿中线从腹股沟至颈部以及沿每条后肢对第一只小鼠进行皮肤切口。将皮肤从腹膜剥离，并牢固固定于解剖板上。随后取下腹股沟和腋窝淋巴结，将组织置于含有完全培养基的培养皿中的细胞筛中。收集完所有淋巴结后，将细胞筛置于冰上装有新鲜完全培养基的50毫升锥形管中，用无菌5毫升注射器活塞的平端将淋巴结细胞压过滤网。用20至30毫升完全培养基冲洗滤网以促进细胞回收，随后进行两次离心洗涤。第二次离心后，将沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数。向细胞中加入适当浓度的抗原、重组小鼠白细胞介素-23（recombinant mouse interleukin-23）和重组小鼠IL-6，将每孔2毫升的细胞悬液加入12孔板的各孔中，每孔含有上述Th17极化混合液。随后将培养板置于含5% CO₂的37°C加湿培养箱中培养72小时。在极化第三天，将各孔中的培养物反复吹打数次以充分解离极化细胞，并将细胞悬液收集至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上进行细胞计数。在 PBS 中清洗两次后，用 PBS 将细胞稀释至浓度为每毫升 1 × 10⁸ 个细胞，并通过轻柔旋转混匀细胞悬液。在细胞收集后一小时内，将细胞转移至 1 毫升注射器中，并通过尾静脉向每只受体动物静脉注射 200 微升细胞悬液。随后，在注射后立即以及两天后，分别向每只小鼠腹腔注射 200 纳克百日咳毒素（B pertussis toxin），该毒素已用 200 微升 PBS 稀释。对于受体动物的活体视网膜光学相干断层扫描成像，在成像前5分钟，每只眼睛滴加一滴1%托吡卡胺以散大瞳孔，并打开加热垫。将小鼠放置在成像圆筒上，并相应调整麻醉气体流量。使用0.3%羟丙基甲基纤维素保护眼睛，以保持眼球湿润并确保折射连续性，然后将定制的接触镜片置于待检查的眼睛上。在红外眼底图像引导下，将激光对准覆盖镜头的眼部，注意使光束对准视神经乳头中心。以高分辨率模式进行 25 次 B 扫描，并对 30 次平均 A 扫描图像进行栅格化处理。完成双眼成像后，取下接触镜头，换用眼科凝胶，将小鼠放入温暖的恢复笼中。使用模块化成像软件分析所获取的图像以实现自动分割时，首先手动校正对应于内界膜和内丛状层的分割区域，以准确表示内层视网膜的边界。随后验证视网膜神经纤维层和神经节细胞层是否位于内层视网膜边界之内，且彼此无重叠。在AQP4基因敲除小鼠中，与野生型T细胞反应相比，含有致病性T细胞表位的AQP4肽段经皮下免疫后，可诱导引流淋巴结中强烈的T细胞增殖反应。对单个Vβ表达的流式细胞术分析表明，针对包含致病性T细胞表位的水通道蛋白4（AQP4）肽段的T细胞利用独特的TCR库，并表现出选择性过度增殖，提示针对这些决定簇的致病性T细胞应答通常受到胸腺阴性选择的调控。在接受极化T细胞注射后约六至九天，几乎所有受体小鼠均出现中枢神经系统自身免疫性疾病的临床症状，包括尾部无力和后肢瘫痪。其中，Th17极化的AQP4特异性T细胞所诱导的临床疾病比Th1极化的AQP4特异性T细胞更为严重。例如，该小鼠在接受经 Th17 极化、靶向 AQP4 肽段的特异性 T 细胞注射后，出现完全性后肢瘫痪。由 AQP4 肽段特异性 Th17 细胞诱导的临床疾病还伴随单核细胞浸润中枢神经系统实质和脑膜，以及视神经炎症；后者进一步表现为视网膜内层肿胀和增厚，随着小鼠疾病恢复，该现象可回归至基线水平。观看本视频后，您应能够充分掌握如何诱导和监测靶向 AQP4 的自身免疫反应，从而为进一步研究 T 细胞在视神经脊髓炎中的作用机制提供支持。

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本视频展示了通过注射百日咳毒素以及含有模拟髓鞘肽段和佐剂的接种物，在小鼠模型中评估运动功能障碍的过程，随后进行跑台实验以评估运动功能，并评价因免疫激活和脱髓鞘所导致的神经损伤。...

评估实验性自身免疫性神经炎小鼠模型中的运动功能

我们介绍了一种在成年小鼠暴露的脊髓上植入并维持玻璃窗的方法，用于研究实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些玻璃窗可长期提供对脊髓的光学通路，从而在活体动物中利用双光子显微镜在亚细胞水平上监测细胞动态。...

在实验性自身免疫性脑脊髓炎成年小鼠中植入玻璃脊髓窗

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。...

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

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诱导C57BL/6小鼠实验性自身免疫性神经炎以进行功能与神经病理学评估的简易方法

基于细胞的检测方法是一种广泛用于检测血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G的常用技术。该方法可应用于视神经脊髓炎谱系障碍的临床诊断和科学研究。...

基于细胞法检测人血清抗水通道蛋白-4免疫球蛋白G

本实验方案描述了在小鼠模型中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎，并通过临床评分系统监测疾病进程。通过小鼠股骨显微计算机断层扫描分析和开放旷场实验，对实验性自身免疫性脑脊髓炎相关症状进行全面评估，以系统分析疾病发展过程。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及多种评估指标

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种多发性硬化症（MS）的动物模型，与人类疾病相似，均具有强烈的体液自身免疫反应。本文报道一种简单且灵活的ELISA实验方案，用于定量检测EAE免疫小鼠血清中的自身抗体。...

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型中自身反应性抗体的定量分析

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