诱导特异性针对视神经脊髓炎自身抗原水通道蛋白-4的T细胞在小鼠中引发瘫痪和视觉系统损伤

本方案的总体目标是通过过继性转移水通道蛋白4（aquaporin 4，简称AQP4）特异性T细胞，诱导中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，并监测其对中枢神经系统及动态视觉系统造成的影响。该方法将有助于解答关于AQP4特异性T细胞在视神经脊髓炎以及其他炎性视觉障碍疾病中作用的关键问题。光学相干断层扫描（optical coherence tomography）的主要优势在于能够以非侵入性方式对视网膜损伤进行纵向监测。

演示该操作的是本实验室的研究助理 Sharon Sagan 以及 RE Greens 实验室的博士后研究员 Andreas Cruz Harans。首先，将一个带有两个雄性鲁尔锁扣接头的三通尼龙旋塞阀连接到无活塞的玻璃鲁尔锁扣注射器上。将旋塞阀的开关拨向注射器方向以关闭旋塞阀，并将注射器竖直放置，开口端朝上。

涡旋后，向注射器中加入等体积的多肽和完全弗氏佐剂溶液，重新将玻璃活塞插入注射器中。固定活塞位置，将注射器倒置，使旋塞朝上，然后将旋塞手柄切换至未使用的雌性接头。小心下压活塞，以排出注射器中的多余空气。

溶液将充满三通阀的第二个雄性鲁尔锁接头。然后将第二个玻璃注射器（活塞完全插入）连接到该雄性鲁尔锁接头上。为形成乳液，交替推动两个注射器的活塞，使溶液在两个注射器之间转移约两分钟，并将溶液冷却约10分钟，直至观察到溶液黏度发生明显变化。

当形成非常粘稠的白色乳状液时，将全部溶液转移至其中一个注射器中，并将空的注射器替换为一个新的1毫米鲁尔锁注射器。用乳状液填充该新注射器。取下注射器与旋塞阀的连接，安装一根25号规格的针头。

为检测乳剂的一致性，可将其一滴挤入盛有少量水的小皿中进行水试。若乳剂不扩散，则可用于注射。随后，将每只供体 AQP4 基因敲除小鼠在下腹部两侧以及腋窝内侧的胸壁两侧各皮下注射一次。

免疫后10至12天，沿中线从腹股沟至颈部以及沿每条后肢对第一只小鼠进行皮肤切口。将皮肤从腹膜剥离，并牢固固定于解剖板上。随后取下腹股沟和腋窝淋巴结，将组织置于含有完全培养基的培养皿中的细胞筛中。

收集完所有淋巴结后，将细胞筛置于冰上装有新鲜完全培养基的50毫升锥形管中，用无菌5毫升注射器活塞的平端将淋巴结细胞压过滤网。用20至30毫升完全培养基冲洗滤网以促进细胞回收，随后进行两次离心洗涤。第二次离心后，将沉淀重悬于T细胞培养基中进行计数。

向细胞中加入适当浓度的抗原、重组小鼠白细胞介素-23（recombinant mouse interleukin-23）和重组小鼠IL-6，将每孔2毫升的细胞悬液加入12孔板的各孔中，每孔含有上述Th17极化混合液。随后将培养板置于含5% CO₂的37°C加湿培养箱中培养72小时。在极化第三天，将各孔中的培养物反复吹打数次以充分解离极化细胞，并将细胞悬液收集至预冷的50毫升锥形管中，置于冰上进行细胞计数。

在 PBS 中清洗两次后，用 PBS 将细胞稀释至浓度为每毫升 1 × 10⁸ 个细胞，并通过轻柔旋转混匀细胞悬液。在细胞收集后一小时内，将细胞转移至 1 毫升注射器中，并通过尾静脉向每只受体动物静脉注射 200 微升细胞悬液。随后，在注射后立即以及两天后，分别向每只小鼠腹腔注射 200 纳克百日咳毒素（B pertussis toxin），该毒素已用 200 微升 PBS 稀释。

对于受体动物的活体视网膜光学相干断层扫描成像，在成像前5分钟，每只眼睛滴加一滴1%托吡卡胺以散大瞳孔，并打开加热垫。将小鼠放置在成像圆筒上，并相应调整麻醉气体流量。使用0.3%羟丙基甲基纤维素保护眼睛，以保持眼球湿润并确保折射连续性，然后将定制的接触镜片置于待检查的眼睛上。

在红外眼底图像引导下，将激光对准覆盖镜头的眼部，注意使光束对准视神经乳头中心。以高分辨率模式进行 25 次 B 扫描，并对 30 次平均 A 扫描图像进行栅格化处理。完成双眼成像后，取下接触镜头，换用眼科凝胶，将小鼠放入温暖的恢复笼中。

使用模块化成像软件分析所获取的图像以实现自动分割时，首先手动校正对应于内界膜和内丛状层的分割区域，以准确表示内层视网膜的边界。随后验证视网膜神经纤维层和神经节细胞层是否位于内层视网膜边界之内，且彼此无重叠。在AQP4基因敲除小鼠中，与野生型T细胞反应相比，含有致病性T细胞表位的AQP4肽段经皮下免疫后，可诱导引流淋巴结中强烈的T细胞增殖反应。

对单个Vβ表达的流式细胞术分析表明，针对包含致病性T细胞表位的水通道蛋白4（AQP4）肽段的T细胞利用独特的TCR库，并表现出选择性过度增殖，提示针对这些决定簇的致病性T细胞应答通常受到胸腺阴性选择的调控。在接受极化T细胞注射后约六至九天，几乎所有受体小鼠均出现中枢神经系统自身免疫性疾病的临床症状，包括尾部无力和后肢瘫痪。其中，Th17极化的AQP4特异性T细胞所诱导的临床疾病比Th1极化的AQP4特异性T细胞更为严重。

例如，该小鼠在接受经 Th17 极化、靶向 AQP4 肽段的特异性 T 细胞注射后，出现完全性后肢瘫痪。由 AQP4 肽段特异性 Th17 细胞诱导的临床疾病还伴随单核细胞浸润中枢神经系统实质和脑膜，以及视神经炎症；后者进一步表现为视网膜内层肿胀和增厚，随着小鼠疾病恢复，该现象可回归至基线水平。观看本视频后，您应能够充分掌握如何诱导和监测靶向 AQP4 的自身免疫反应，从而为进一步研究 T 细胞在视神经脊髓炎中的作用机制提供支持。