低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

本实验的总体目标是利用稀有胚胎样本，研究不同组蛋白修饰的结合特征，从而改进对脊椎动物基因组的功能注释。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如，哪些是决定特定胚胎组织身份的关键增强子和基因。该技术的主要优势在于所需样本量少，并且既可用于局部特异性分析，也可用于全基因组范围的分析。

尽管该方法可用于研究胚胎组织中的转录调控或细胞异质性，但也同样适用于其他系统，例如专利样品。为获得本实验所需的 HH19 期鸡胚胎，将受精的白来航鸡卵以水平方向置于 37 摄氏度、80% 湿度条件下孵育三天。开始分离 HH19 期胚胎时，使用 10 毫升注射器抽取 3 毫升蛋清，以降低胚盘位置，便于操作。

为了去除胚外膜，使用精细剪刀在眼睛处剪开一个小口。加入1毫升固定液。借助弯针，加入0.5毫升印度墨水。

使用精细的手术剪和镊子剪除包围胚胎的胚外膜。然后，用带孔的勺子将胚胎转移至含有 20 毫升 PBS 溶液的 4.5 厘米培养皿中。在冰上、体视显微镜下操作，使用精细的手术剪和镊子解剖并弃去羊膜及残留的胚外膜组织。

随后，在胚胎的臂部水平处横切脊髓神经管或SNT节段。将解剖向尾侧延伸至胸段区域，以分离SNT。最后，使用镊子去除位于SNT侧方和腹侧周围的组织。

分离SNT后，将每一段SNT浸入含有37摄氏度温热胰蛋白酶的3.5厘米培养皿中。在体视显微镜下观察到SNT周围非神经组织松解后，将样本转移至冰冷的1×PBS中。为终止胰蛋白酶消化，将样本转移至另一含有冰冷DMEM（含10% FBS）的新培养皿中。

使用镊子手动去除SNT中残留的间充质和外胚层组织。将处理干净的SNT组织段转移至1.5毫升离心管中，并在液氮中速冻。随后，按照文本方案中的步骤匀浆组织。

加入13.5 µL的37%甲醛，在室温下于旋转仪上孵育15分钟。为淬灭甲醛，向管中加入25 µL的2.5 M甘氨酸，在室温下于旋转仪上继续孵育10分钟。离心管子，然后根据文本方案洗涤沉淀物。

交联后，用移液器将沉淀重悬于300微升冰上预冷的完整裂解缓冲液中。将样品置于4摄氏度的摇床上孵育10分钟。接着，在4摄氏度条件下对样品进行超声处理。

超声处理后，将样品在 4 摄氏度下以 16,000 × g 离心 10 分钟。将上清液或裂解液转移至新的 1.5 毫升离心管中，并弃去细胞碎片沉淀。根据文本方案中的说明稀释裂解液。

然后，将每个样品保留少量等分试样作为输入对照，并在 -20 摄氏度下冷冻保存。根据文本方案，将剩余样品与适当的抗体共同孵育，用于染色质沉淀或染色质免疫沉淀（ChIP）。接着，将 300 µL 抗体结合的染色质加入预先洗涤的磁珠中。

将试管倒置以混匀样品。为使抗体与磁珠结合，将试管置于试管旋转仪上，在4°C下垂直旋转，至少旋转四小时。为洗涤染色质结合的磁珠，向置于冰上的试管中加入一毫升冰冻的RIPA洗涤缓冲液，并通过倒置或轻弹试管进行混匀。

将离心管放入室温下的磁力架中，待磁珠吸附至管壁一侧后，弃去上清液，并重复此洗涤步骤三次。向管中加入1毫升含50毫摩尔氯化钠的TE缓冲液，随后将该溶液中结合有染色质的磁珠转移至新的1.5毫升微量离心管中。

将离心管放入磁力架中，待磁珠完全沉淀后，倒出上清液。接着，在预冷的离心机中，以900 × g、4°C离心3分钟。将磁珠再次置于磁力架中沉淀后，使用加样枪头彻底移除残留的TE缓冲液。

在室温下操作，向珠子中加入 210 微升洗脱缓冲液，并通过轻弹管壁重新悬浮。将离心管置于预热至 65 摄氏度的金属浴中，振荡孵育 15 分钟。孵育结束后，在室温下以 16,000 × g 离心 1 分钟。

当磁珠在磁力架上沉淀后，将上清液转移至新的微量离心管中。将先前在20摄氏度冷冻保存的输入对照样品置于室温下解冻。向样品中加入90 µL洗脱缓冲液，短暂涡旋混匀。

为逆转交联，将ChIP样品和对照样品在65摄氏度下孵育过夜。在室温下操作，每管加入一倍体积的TE缓冲液，颠倒混匀。为消化RNA，在对照和ChIP样品中加入RNase A，使其终浓度为0.2毫克/毫升，颠倒试管以混匀。

将试管置于预热至37摄氏度的金属浴中孵育2小时。为消化蛋白质以进行后续DNA纯化，向试管中加入蛋白酶K，使其终浓度为0.2毫克/毫升，并轻轻颠倒试管以混匀。随后将试管置于预热至55摄氏度的金属浴中孵育2小时。

根据补充材料提取并纯化DNA。该DNA现在可用于定量PCR和染色质免疫沉淀测序文库的制备。通过输入对照样本的琼脂糖凝胶电泳检测超声处理效率，以确认染色质免疫沉淀实验是否成功。

在此示例中，使用鸡脊髓神经管（SNT）切片，经过11个超声破碎循环，获得大小在200至500个碱基对之间的理想片段。通过定量PCR分析染色质片段化后的DNA，以检测在鸡SNT中处于活跃和非活跃状态的基因启动子区域周围激活性和抑制性组蛋白修饰的富集水平。这表明，仅需使用少量样品即可通过定量评估染色质片段质量，而不会大量消耗DNA，从而保留更多材料用于后续分析。

在依次完成芯片-测序文库的制备后，展示了鸡SNT中H3K27三甲基化和H3K4三甲基化芯片-测序数据所对应的代表性飞蝗样本。在其他鸡胚组织中，例如上颌突起和HH3期胚胎，也成功获得了类似的芯片-测序图谱。这表明本文所介绍的芯片技术可用于从有限量的不同胚胎组织中生成表观基因组图谱。

采用该方案生成胚胎组织中的组蛋白修饰谱时，需要注意的是，信号来源于该组织中存在的所有不同类型细胞。遵循本方案并使用更多的起始生物材料，应可进一步研究其他参与转录调控的蛋白质的结合谱，例如转录因子、共激活因子或RNA聚合酶2亚基。一旦建立，这些方案将使发育生物学或医学遗传学领域的研究人员能够改进对脊椎动物基因组功能改变的研究，并深入理解肌生成、进化及人类疾病的分子基础。