Name: 低丰度胚胎标本的染色质沉淀 (芯片) 协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学习低丰度鸡胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库制备方法，用于生成全基因组表观遗传图谱。该技术有助于研究组蛋白修饰结合特征，揭示发育生物学中转录调控机制。

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作者感谢 Jan Appel 在本方案建立过程中提供的出色技术支持。Rada-Iglesias 实验室的工作得到了 CMMC 机构内资助、德国研究基金会研究资助（RA 2547/1-1、RA 2547/2-1 和 TE 1007/3-1）、科隆大学高级研究员小组资助以及 CECAD 资助的支持。

根据德国动物护理指南，进行鸡胚实验无需获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。根据当地规定，仅对HH44期（18天）及更晚期的鸡胚进行的实验才需要IACUC批准。然而，本研究中使用的所有胚胎均处于较早的胚胎发育阶段（即， HH19（72 小时）
注意：本实验方案的目的是对染色质免疫沉淀（ChIP）实验进行详细描述，以便有效结合定量PCR或下一代测序（即， ChIP-seq）用于研究低丰度胚胎样本中的组蛋白修饰（样本量范围为 5 x 104 - 5 × 105 每次ChIP反应的细胞数）以及不同组织类型（图1）。该方案应适用于研究转录因子和共激活因子的结合特征例如， p300）。然而，由于这些调控蛋白的丰度较低，可能需要更多的细胞数量（5 x 105 - 5 × 106 每次ChIP反应所需的细胞数）。
1. 鸡胚的准备及脊索神经管（SNT）的显微解剖
注意：显微解剖的操作步骤因组织类型和动物模型的不同而有所差异。本节以获取HH19期鸡胚臂丛脊神经节（SNT）切片为例，详细描述所采用的解剖方案。
<ol>
	<li>从当地饲养者处获取受精的白来航鸡鸡蛋，以水平方向置于37 °C、80%湿度条件下孵育3天，以获得HH19期鸡胚。</li>
	<li>根据Hamburger和Hamilton鸡胚发育分期系统17确定胚胎发育阶段。</li>
	<li>所有显微解剖操作均需在低温条件下进行；否则，染色质完整性可能受损。</li>
	<li>分离HH19期胚胎。
	<ol>
		<li>为便于接触胚胎，使用10 mL注射器（配0.90 x 40 mm针头）抽取3 mL蛋清，以降低胚盘位置。</li>
		<li>用精细剪刀在蛋壳上开一小口，加入1 mL Locke溶液（配方见补充材料），以利于去除胚外膜。</li>
		<li>使用1 mL注射器（配0.55 x 25 mm2针头）将10%印度黑墨水/Locke溶液注入胚盘下方，以增强胚胎的可视性。</li>
		<li>使用外科精细剪刀和镊子剪除包围胚胎的胚外膜。</li>
		<li>用带孔勺子将胚胎转移至含有20 mL 1x PBS溶液的4.5 cm培养皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在体视显微镜下，使用精细剪刀和镊子剥离羊膜及残留的胚外膜组织。</li>
	<li>在胚胎臂部水平横切神经管背侧部分（SNT），并向尾侧延伸至胸部区域，以分离SNT（图2）。</li>
	<li>使用镊子去除SNT周围侧方/腹侧的组织（例如，侧板中胚层、外胚层、脊索和主动脉）（图2）。</li>
	<li>将每段分离的鸡SNT组织浸入含有5 mL温热（37 °C）胰蛋白酶（胰蛋白酶/EDTA溶液 1:250）的3.5 cm培养皿中。</li>
	<li>当在体视显微镜下观察到SNT周围非神经组织松动时，终止胰蛋白酶处理。 
	注意：必须严格控制胰蛋白酶消化时间，以避免神经组织过度消化和分散，确保SNT结构完整性。</li>
	<li>胰蛋白酶处理后，手动去除残留的间充质和外胚层组织，制备干净的SNT切片。</li>
	<li>将SNT切片转移至1.5 mL离心管中，并在液氮中速冻。当积累足够数量的SNT切片后（每次ChIP反应需汇集约30个鸡胚的SNT切片），于-80 °C保存。 
	注意：若能从单个或少数几个鸡胚中分离出足够的胚胎组织（即 5 x 105 - 5 x 106 个细胞），则无需冷冻，可直接进入后续步骤。请参见表1中的故障排除指南。 
	注意：警告！液氮温度极低，操作时须佩戴适当的防护装备。</li>
</ol>
2. 将蛋白质交联至DNA：第1天
注意：除非另有说明，所有步骤均需在冰上进行。
<ol>
	<li>向冻存组织中直接加入500 µL含10% FBS和10 µL 1 M Na-丁酸盐的DMEM培养基，或 alternatively 立即加入新鲜解剖的组织中。用1 mL移液器轻轻重悬细胞以实现匀浆。 
	注意：添加Na-丁酸盐为可选步骤，但如果研究组蛋白乙酰化，则建议添加。除DMEM-10% FBS外，样品也可用含0.1% BSA的1× PBS重悬。添加FBS或BSA为可选操作，但有助于在后续离心步骤中形成沉淀。</li>
	<li>向样品中加入13.5 µL 37%甲醛（终浓度为1%甲醛），并在室温下置于旋转仪上旋转15分钟。 
	注意：注意！甲醛具有毒性。</li>
	<li>向管中加入25 µL 2.5 M甘氨酸，并在室温下置于旋转仪上旋转10分钟，以淬灭甲醛反应。</li>
	<li>在台式离心机中以850 × g于4 °C离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用500 µL预冷的新鲜配制洗涤缓冲液（配方见补充材料）洗涤沉淀一次，在850 × g、4 °C条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
</ol>
3. 裂解与超声处理
<ol>
	<li>配制完全裂解缓冲液（LB）（参见 补充材料 配方）并置于冰上冷却。对于1 mL体系，使用950 µL LB培养基、40 µL蛋白酶抑制剂浓缩液（25倍浓度）和10 µL 100% PMSF。</li>
	<li>将沉淀重悬于300 µL完全LB培养基中，用移液器吹打混匀，置于4 °C摇床中孵育10分钟。</li>
	<li>使用以下参数对样品进行超声处理：温度 = 4 °C，总时间 = 7 分钟，“开启”间隔 = 30 秒，“关闭”间隔 = 30 秒，振幅 = 25% 
	注意：每种组织的超声条件均需根据所使用的超声仪进行优化，条件会有所不同。建议使用最低的超声强度，使DNA剪切片段大小在200至600 bp范围内。剪切效果受组织类型、样本量、超声体积、交联条件及设备等因素影响较大。请参阅故障排除指南 表1.</li>
	<li>在4 °C条件下，以16,000 × g离心10分钟，使超声处理后的样品沉淀细胞碎片。</li>
	<li>将裂解液（上清液）转移至新的1.5 mL离心管中。 
	注意：如果起始材料被认为足以进行两次 ChIP 实验，则可向超声处理后的染色质中加入 300 µL 完全 LB 培养基即， 终体积：600 µL。</li>
	<li>每300 µL超声裂解液中加入30 µL 10%辛基酚聚氧乙烯醚（终浓度：1%），用移液器吹打混匀。 
	注意：警告！辛基酚聚氧乙烯醚具有急性毒性（经口、经皮、吸入）。</li>
</ol>
4. 抗体孵育
<ol>
	<li>将330 µL超声处理后的裂解液分装至两个1.5 mL离心管中：300 µL用于染色质免疫沉淀（ChIP），30 µL作为输入对照（占起始材料的10%）。将&#34;30 µL输入对照样品&#34;储存于-20 °C。 
	注意：若从同一样本进行两次ChIP反应，则可将660 µL超声处理后的裂解液分装至三个1.5 mL离心管中（300 µL用于ChIP#1，300 µL用于ChIP#2，60 µL作为输入对照（每份ChIP起始材料的20%））。</li>
	<li>向300 µL超声处理后的染色质分装液中加入3–5 µg抗体，轻轻颠倒混匀。 
	注意：本研究中，每次ChIP反应分别使用针对组蛋白H3在K4位点三甲基化（H3K4me3）、组蛋白H3在K4位点二甲基化（H3K4me2）、组蛋白H3在K27位点三甲基化（H3K27me3）以及组蛋白H3在K27位点三乙酰化（H3K27ac）的特异性抗体。该实验方案的成功完全依赖于所用抗体的质量。抗体应具有高度特异性，并能高效地免疫沉淀目标蛋白。需确定可用于免疫沉淀交联蛋白-DNA复合物的抗体用量。此外，可通过Western blot检测抗体的特异性，以确认其仅识别目标蛋白。若抗体出现多条非特异性条带，则不推荐用于ChIP实验。</li>
	<li>将离心管置于4 °C摇床中孵育过夜（12–16小时），使抗体与染色质充分结合。 
	注意：请参阅表1中的故障排除指南。</li>
</ol>
5. 磁珠的制备：第2天
<ol>
	<li>将50 - 100 µL蛋白G/磁珠悬液分装至预冷的1.5 mL微量离心管中，每管用于一次ChIP反应，置于冰上。</li>
	<li>用冷阻断缓冲液（配方见补充材料）在4 °C下洗涤磁珠三次。每次加入500 µL冷阻断缓冲液，通过倒置或轻弹混匀。将离心管放入磁力架中，待磁珠吸附至管壁后，弃去上清液。重复此步骤两次。最后一次洗涤后，使用加样枪头彻底去除残留液体。</li>
</ol>
6. 染色质的免疫沉淀
<ol>
	<li>将300 µL抗体结合的染色质加入经洗涤的磁珠中，轻轻翻转混匀。</li>
	<li>在4 °C下于试管旋转仪上垂直旋转至少4小时，使抗体与磁珠结合。</li>
</ol>
7. 洗涤、洗脱并逆转交联
<ol>
	<li>将 RIPA 洗涤缓冲液（配方见补充材料）置于冰上预冷，将水浴锅设置为 65 °C，并将离心机预冷至 4 °C。</li>
	<li>用 1 mL 冷的 RIPA 洗涤缓冲液洗涤染色质结合磁珠四次，每次洗涤后保持在冰上。具体操作：加入 1 mL 冷的 RIPA 洗涤缓冲液，通过倒置或轻弹管壁混匀。将离心管放入磁力架中，等待磁珠吸附至管壁一侧，弃去上清液后重复操作。 
	注意：RIPA 洗涤缓冲液的洗涤次数可能需要根据样本类型、样本丰度以及所用抗体进行优化。增加洗涤次数可降低背景信号，但也会减少回收的 DNA 总量，可能影响后续的 qPCR 或 ChIP-seq 分析。</li>
	<li>向离心管中加入 1 mL TE/50 mM NaCl 缓冲液，将结合染色质的磁珠转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，然后如上所述使用磁力架去除液体。</li>
	<li>在 4 °C 下以 900 × g 离心 3 分钟，将离心管放回磁力架中，用加样枪尖吸头彻底去除残留的 TE 缓冲液。</li>
	<li>加入 210 µL 洗脱缓冲液（配方见补充材料），室温下轻弹混匀。</li>
	<li>将样品置于 65 °C 金属浴中，震荡孵育 15 分钟以进行洗脱。</li>
	<li>在室温下以 16,000 × g 离心 1 分钟，将离心管放入磁力架中。</li>
	<li>待磁珠完全吸附后，将上清液（约 200 µL）转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>将输入对照样品（30 µL，步骤 4.1 中于 -20 °C 冻存）从 -20 °C 取出，室温解冻，加入 3 倍体积的洗脱缓冲液（90 µL），短暂涡旋混匀。</li>
	<li>将 ChIP 样品和对照样品在 65 °C 孵育过夜（12–16 小时），以逆转交联。</li>
</ol>
8. 消化细胞蛋白和RNA：第3天
<ol>
	<li>在室温下，每管加入1体积的TE缓冲液（以稀释SDS），并颠倒混匀：向120 µL对照样品中加入120 µL TE缓冲液，向200 µL ChIP样品中加入200 µL TE缓冲液。</li>
	<li>加入RNase A至终浓度为0.2 mg/mL，并颠倒混匀：向240 µL对照样品中加入2.4 µL 20 mg/mL RNase A，向400 µL ChIP样品中加入4 µL 20 mg/mL RNase A。</li>
	<li>将离心管置于37 °C水浴中孵育2小时，以消化RNA。</li>
	<li>加入Proteinase K至终浓度为0.2 mg/mL，并颠倒混匀：向240 µL对照样品中加入2.4 µL 20 mg/mL Proteinase K，向400 µL ChIP样品中加入4 µL 20 mg/mL Proteinase K。</li>
	<li>在55 °C水浴中孵育2小时，以消化蛋白质并纯化DNA。</li>
</ol>
9. 染色质免疫共沉淀定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）
注意：按照补充材料中所述进行DNA提取和纯化。
注意：按照补充材料中所述方法验证超声处理效率，以确认获得200至500 bp的DNA片段（图3）。
注意：一个关键步骤是确定染色质免疫沉淀（ChIP）是否成功。如果已知目标蛋白在基因组上的结合位点，可设计引物用于定量 PCR（qPCR），以检测这些已知位点在 ChIP 获得的 DNA 中是否相对于预期不会被候选蛋白结合的阴性对照区域出现特异性富集。例如，本研究展示了对 HH14 期鸡胚分离的 SNT 切片进行 H3K4me3（活性启动子组蛋白标记）和 H3K27me3（非活性启动子组蛋白标记）ChIP 后得到的 ChIP-qPCR 结果（图 4A）。
<ol>
	<li>将每对引物（正向与反向）混合于同一离心管中，并使用dH₂O配制浓度均为20 µM的混合引物储备液2O (表2). 
	注意：在进行ChIP-qPCR分析之前，应评估每对引物的扩增效率。</li>
	<li>使用第8.5步获得的ChIP和20%输入对照DNA进行qPCR优化。 
	注意：用于qPCR分析的输入DNA通常需稀释20倍（相当于ChIP反应起始材料的1%）。</li>
	<li>每10 µL PCR反应体系，在PCR管中混合以下组分：DNA主混合液包含2 µL dH2O、2.5 µL SYBR Green混合液和1 µL DNA（来自ChIP或1%输入）；含引物的主混合液包含2.375 µL dH2O、2.5 µL SYBR Green混合液以及0.125 µL正向与反向引物混合液。</li>
	<li>涡旋混匀样品2秒，然后在900 × g下短暂离心1分钟。</li>
	<li>进行实时 PCR（此处所用引物和循环条件的示例如下所示） 表2 和 表3，分别）。 
	注意：ChIP-qPCR 数据分析：ChIP 信号以输入DNA（input）的百分比形式计算。简而言之，当获得每组 qPCR 反应的 Ct 值后，需对输入DNA反应所获得的 Ct 值增加 100 倍稀释因子，即 6.644 个循环（log2(100)）。随后，针对特定目标区域（即， 引物对），ChIP 信号按如下方式计算： 
	校正后输入值 = Ct（Input）- 6.644 
	ChIP 信号 = 100 × 2^(ChIP 样品校正后 Input-Ct 值的平均值)</li>
</ol>
10. ChIP-seq 文库构建；末端修复：第4天
<ol>
	<li>在60 µL洗脱缓冲液中稀释最多100 ng的ChIP-DNA（参见材料表）。</li>
	<li>加入40 μL末端修复混合液，轻轻吹打10次。&#160;</li>
	<li>在热循环仪中30 °C孵育30分钟。</li>
	<li>涡旋振荡磁珠，取160 μL加入含有末端修复混合液的离心管中，吹打10次充分混匀。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠完全吸附至管壁一侧。</li>
	<li>小心倾去上清液。</li>
	<li>保持离心管置于磁力架上，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇（EtOH）。</li>
	<li>室温孵育30秒，弃去上清液。重复一次。</li>
	<li>将离心管继续置于磁力架上室温静置15分钟。待沉淀完全干燥后，将离心管从磁力架上取下。</li>
	<li>用20 μL重悬缓冲液重悬沉淀，轻轻吹打10次以充分混匀。</li>
	<li>室温孵育2分钟。</li>
	<li>将离心管放入磁力架中，等待磁珠吸附至管壁一侧后，将17.5 μL上清液转移至新的离心管中。</li>
</ol>
11. ChIP-seq 文库构建；腺苷酸化3'末端
<ol>
	<li>向新管中加入 12.5 μL A-tailing 混合液&#160; 轻轻吹打混匀10次。将离心管置于PCR仪中，按以下程序孵育：37 °C 30分钟，70 °C 5分钟，然后置于4 °C保存</li>
</ol>
12. ChIP-seq 文库构建；连接接头
<ol>
	<li>加入2.5 μL重悬缓冲液、2.5 μL连接反应混合液和2.5 μL相应的RNA接头索引。轻轻吹打混匀10次，充分混匀。</li>
	<li>在30 °C下于热循环仪中孵育10分钟。</li>
	<li>加入5 μL终止连接缓冲液，充分混匀&#160; 吹打10次。</li>
	<li>涡旋磁珠，并向样品中加入42.5 μL。用移液器充分混匀。&#160; 重复10次。室温孵育15分钟。</li>
	<li>将试管放入磁力架中，等待磁珠吸附至管壁一侧，然后弃去上清液</li>
	<li>将离心管保持在磁力架上，加入200 μL新鲜配制的80% EtOH。</li>
	<li>室温孵育30秒，弃上清液。重复一次。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，让样品晾干15分钟。</li>
	<li>从磁力架上取下离心管，将沉淀重悬于52.5 μL重悬缓冲液中。用移液器吹打10次，充分混匀。室温孵育2分钟，将离心管放入磁力架中，静置至磁珠完全吸附至管壁一侧。将50 μL澄清上清转移至新的离心管中。</li>
	<li>涡旋磁珠，取50 μL加入样品中，用移液器充分混匀。&#160; 10 次。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>将试管放入磁力架中，等待磁珠吸附至管壁一侧后，弃去上清液。</li>
	<li>将离心管保持在磁力架上，加入200 μL新配制的80% EtOH。</li>
	<li>室温孵育30秒，弃上清液。重复一次。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上，让样品空气干燥15分钟。</li>
	<li>从磁力架上取下离心管，加入27.5 μL重悬缓冲液重悬沉淀。用移液器吹打10次，充分混匀。</li>
	<li>室温孵育2分钟，将离心管放入磁力架中，静置至磁珠完全吸附至管壁一侧。吸取25 μL上清液转移至新离心管中。</li>
</ol>
13. ChIP-seq 文库构建；DNA 片段扩增
<ol>
	<li>取12.5 µL模板置于0.2 mL PCR管中，加入2.5 μL PCR引物混合液和10 μL增强型PCR混合液。&#160;用移液器上下吹打10次充分混匀。将PCR管放入热循环仪中，采用表4所述反应条件进行扩增。</li>
	<li>涡旋振荡磁珠，取25 μL加入样品中。用移液器吹打混匀&#160;10次，室温孵育15分钟。</li>
	<li>将PCR管置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁一侧后，小心倾去上清液。</li>
	<li>保持PCR管置于磁力架上，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇（EtOH），室温孵育30秒后弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>保持PCR管在磁力架上，让样品在空气中干燥15分钟。从磁力架上取下PCR管，将沉淀重悬于32.5 μL重悬缓冲液中，用移液器吹打10次充分混匀。</li>
	<li>将PCR管或PCR板在室温下孵育2分钟，随后置于磁力架上，待磁珠吸附至管壁一侧后，转移30 μL上清液至新的PCR管中。</li>
</ol>
14. ChIP-seq 文库构建；文库验证
注意：文库的验证使用 DNA 和 RNA 质量控制系统进行。制备梯度：取 1 µL 基因组 DNA Ladder 加入第一个管/孔中，再加入 3 µL 上样缓冲液。
<ol>
	<li>样品制备：取1 µL文库样品（10 - 100 ng/µL）与3 µL上样缓冲液于离心管中混匀。短暂离心后，最大速度涡旋振荡5秒。再次离心使样品沉降至管底。</li>
	<li>将样品加载至质控系统中。</li>
	<li>运行完成后，将对比度调至最大值以分析结果，确保样品中无引物二聚体存在（图5）；引物二聚体在约135 bp处呈现条带。若出现任何微弱条带，需进行第二次纯化：加入洗脱缓冲液（见材料表）至终体积50 µL，并加入47.5 µL混合磁珠。若样品浓度过低（&#60;2 nM），则使用步骤12.16中剩余的12.5 µL样品进行PCR扩增（步骤13.1），循环数由15次增加至18次。</li>
	<li>使用市售试剂盒通过qPCR对文库进行单独定量。 
	注意：文库混合物可使用测序仪按照单端50 nt（1 x 50 nt）测序方案进行测序，目标为每个样品获得3000万条读长（30 M reads/sample）。</li>
</ol>

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<li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nat Biotech. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li>
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</ol>

作者无任何需披露的相互竞争的经济利益。

利用ChIP-seq对组蛋白修饰进行表观基因组学分析，可用于在不同细胞背景下改进脊椎动物基因组的功能注释4,5,18这些表观基因组谱可用于识别增强子元件，以及定义增强子的调控状态（即， 活性、启动或预备状态），并在不同的生物学或病理学背景下定义主要的细胞身份调控因子（例如， 宽泛的H3K4me3启动子区域和超级增强子6,7,9,10,11,19然而，由于ChIP实验本身存在局限性，通常需要数百万个细胞，大多数组蛋白修饰谱的生成...

组蛋白翻译后修饰直接参与多种染色质依赖性过程，包括转录、复制和DNA修复1,2,3。此外，不同的组蛋白修饰与基因表达呈正相关（例如，H3K4me3 和 H3K27ac）或负相关（例如，H3K9me3 和 H3K27me3），可分别被广泛定义为激活型或抑制型组蛋白标记2,3。因此，全基因组组蛋白修饰图谱（也称为表观基因组图谱）已成为功能注释脊椎动物基因组的强大且通用的工具4,5。例如，可根据特定染色质特征（例如，活性增强子：H3K4me1 和 H3K27ac）识别远端调控序列（如增强子），从而将其与近端启动子区域（例如，活性启动子：H3K4me3）区分开来6,7,8。另一方面，具有重要细胞身份调控功能的基因通常位于广阔的染色质结构域中，这些结构域根据其下方基因的转录活性或非活性状态，分别被H3K4me3或H3K27me3标记9,10。类似地，主要细胞身份基因的表达似乎经常受到多个在空间上成簇分布的增强子（即，超级增强子）的调控，这些增强子可被识别为广泛的H3K27ac标记结构域11。
目前，组蛋白修饰图谱的绘制主要采用 ChIP-seq 技术，与之前的 ChIP-chip（与微阵列芯片结合的染色质免疫沉淀）等方法相比，该技术具有更高的分辨率、更少的假象、更低的背景噪声、更广的覆盖范围以及更低的成本12然而，利用ChIP-seq技术生成表观基因组图谱存在固有的局限性，主要与在目标样本中成功开展ChIP实验的能力相关。传统的ChIP实验方案通常需要数百万个细胞，这限制了该方法在 体外 易于分离的细胞系或细胞 体内 (例如， 血细胞）。近年来，已有多种适用于少量细胞的改良ChIP方案被报道13,14,15,16然而，这些方案专门设计用于与下一代测序（next-generation sequencing,即， ChIP-seq）分析，且通常采用 特设的 文库构建方法13,14,15,16.
在此，我们描述了一种染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案，可用于在低至中等细胞数量（5 x 104 - 5 × 105 细胞）在特定基因位点（即， ChIP-qPCR）或全基因组范围（即， ChIP-seq图1）当与 ChIP-seq 技术联用时，我们的 ChIP 方案可与标准文库构建方法结合使用，从而使多个实验室均可广泛采用。10该方案已被用于研究多种组蛋白修饰 例如， H3K4me3、H3K27me3 和 H3K27ac）在不同鸡胚组织中的分布例如， 脊髓神经管（SNT）、额鼻突和外胚层）。然而，我们预计该方法可广泛适用于其他生物体，其中仅能获取少量具有生物学和/或临床意义的样本。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA 粉末</td><td>Carl Roth</td><td>3737.3</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 8.0</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.2</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-24</td><td></td></tr><tr><td>N-月桂酰肌氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>61743-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Applichem</td><td>A3724,0250</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Carl Roth</td><td>3739.2</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ml</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>Protein G/磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>1004D</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>252549-1L</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase</td><td>Peqlab</td><td>12-RA-03</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46.35 E</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLB2659V</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green 混合液</td><td>biozym</td><td>617004</td><td></td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>1 Kb DNA 标准分子量标记</td><td>Thermofisher</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>橙色 G</td><td>Sigma Alrich</td><td>03756-25</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>辛基酚聚氧乙烯醚（Triton X-100）</td><td>Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM（Dulbecco&amp;acute;s 改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td></td></tr><tr><td>凝胶加样枪头 Multiflex</td><td>A.Hartenstein</td><td>GS21</td><td></td></tr><tr><td>qPCR 板</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>384 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>721,985,202</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1,000 &amp;micro;L 滤芯枪头</td><td>Sarstedt</td><td>70,762,211</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &amp;micro;L 滤芯枪头</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,213</td><td></td></tr><tr><td>2 - 200 &amp;micro;L 滤芯枪头</td><td>Sarstedt</td><td>70,760,211</td><td></td></tr><tr><td>0.5 - 10 &amp;micro;L 滤芯枪头</td><td>Sarstedt</td><td>701,116,210</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39155</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39159</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me2 抗体</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>末端修复混合液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>顺磁性磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>重悬缓冲液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>A 尾添加混合液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>连接混合液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>RNA 接头索引</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td></td></tr><tr><td>终止连接缓冲液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物混合液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>增强型 PCR 混合液</td><td>Illumina</td><td>FC-121-4001</td><td></td></tr><tr><td>基因组 DNA 标准分子量标记</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>洗脱缓冲液</td><td>Agilent</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>文库定量试剂盒</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4835 &amp;ndash; 07960204001</td><td></td></tr><tr><td>受精白壳鸡胚蛋</td><td>LSL Rhein Main</td><td>KN: 15968</td><td></td></tr><tr><td>注射针头（Neoject）</td><td>A.Hartenstein</td><td>10001</td><td></td></tr><tr><td>注射器（Ecoject 10 mL）</td><td>Dispomed witt oHG</td><td>21010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Hermle</td><td>Z 216 MK</td><td></td></tr><tr><td>恒温振荡器</td><td>ITABIS</td><td>MKR13</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Active Motive</td><td>EpiShear 探头式超声破碎仪</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Diagenode</td><td>Bioruptor Plus</td><td></td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>可调体积移液器（5 &amp;ndash;1,000 &amp;mu;L）</td><td>Eppendorf</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>计时器</td><td>Sigma</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Thermo Fisher</td><td>DynaMag-2 12321D</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Heathrow Scientific</td><td>Sprout</td><td></td></tr><tr><td>混合器</td><td>LMS</td><td>VTX 3000L</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量 PCR 仪</td><td>Roche</td><td>Light Cycler；序列号 5662</td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Applied Biosystems</td><td>Gene Amp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>DNA 和 RNA 质量控制系统</td><td>Agilent</td><td>Agilent 4200 TapeStation 系统</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>5-Inox-H</td><td></td></tr><tr><td>带孔勺</td><td>World precision instruments</td><td>501997</td><td></td></tr></tbody></table>

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（chip）实验方案

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛应用的技术，用于绘制翻译后修饰组蛋白、组蛋白变体、转录因子或染色质修饰酶在特定基因座或全基因组范围内的定位。将ChIP实验与下一代测序（next-generation sequencing, NGS）相结合，即， 染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）是一种强大的方法，可用于全局揭示基因调控网络，并改进基因组的功能注释，尤其是非编码调控序列的功能注释。常规的ChIP实验方案通常需要大量细胞材料，因而限制了该方法在稀有细胞类型或小型组织活检样本中的应用。为了使ChIP实验能够适用于通常可获取的生物样本量 体内 在早期脊椎动物胚胎发育过程中，本文介绍了一种简化的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案，通过减少完成检测所需的步骤，以最大限度降低样品损失。该ChIP方案已成功应用于多种鸡胚胎及成年小鼠组织中不同组蛋白修饰的研究，所需细胞数量较少至中等（5 x 104 - 5 × 105 细胞）。重要的是，该方案可与采用标准文库构建方法的ChIP-seq技术兼容，从而可在高度相关的胚胎组织中获得全基因组范围的表观基因组图谱。

为展示本ChIP方案的性能，我们利用HH19鸡胚的 pooled SNT切片、HH22鸡胚的上颌突以及HH3期鸡胚组织开展了ChIP-seq实验，以研究多种组蛋白修饰的结合图谱即， H3K4me2、H3K27ac、H3K4me3 和 H3K27me3）。在获得ChIP DNA后，通过对应输入DNA的琼脂糖凝胶电泳评估超声破碎效率（图3）。随后，利用染色质免疫沉淀（ChIP）和输入（input）DNA 进行 ChIP-qPCR 分析，以检测目标组蛋白修饰预期结合或非结合位点的富集情况图 4A）。在所示的示例中 图 4A在HH19期SNT切片中，通过ChIP-qPCR检测了SOX17和SOX2基因启动子区域周围的H3K27me3和H3K4me3富集水平，这两个基因在SNT中分别为失活和活化状态。正如预期，SOX2启动子区域被H3K4me3显著标记，而未被H3K27me3标记；SOX...

本文介绍了一种染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库构建方案，用于从稀有鸡胚样本中生成全基因组表观基因组谱图。

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

染色质免疫沉淀（ChIP）是一种广泛使用的技术，用于绘制翻译后修饰组蛋白、组蛋白变体、……的定位图谱。

本实验的总体目标是利用稀有胚胎样本，研究不同组蛋白修饰的结合特征，从而改进对脊椎动物基因组的功能注释。该方法有助于回答发育生物学领域中的关键问题，例如，哪些是决定特定胚胎组织身份的关键增强子和基因。该技术的主要优势在于所需样本量少，并且既可用于局部特异性分析，也可用于全基因组范围的分析。尽管该方法可用于研究胚胎组织中的转录调控或细胞异质性，但也同样适用于其他系统，例如专利样品。为获得本实验所需的 HH19 期鸡胚胎，将受精的白来航鸡卵以水平方向置于 37 摄氏度、80% 湿度条件下孵育三天。开始分离 HH19 期胚胎时，使用 10 毫升注射器抽取 3 毫升蛋清，以降低胚盘位置，便于操作。为了去除胚外膜，使用精细剪刀在眼睛处剪开一个小口。加入1毫升固定液。借助弯针，加入0.5毫升印度墨水。使用精细的手术剪和镊子剪除包围胚胎的胚外膜。然后，用带孔的勺子将胚胎转移至含有 20 毫升 PBS 溶液的 4.5 厘米培养皿中。在冰上、体视显微镜下操作，使用精细的手术剪和镊子解剖并弃去羊膜及残留的胚外膜组织。随后，在胚胎的臂部水平处横切脊髓神经管或SNT节段。将解剖向尾侧延伸至胸段区域，以分离SNT。最后，使用镊子去除位于SNT侧方和腹侧周围的组织。分离SNT后，将每一段SNT浸入含有37摄氏度温热胰蛋白酶的3.5厘米培养皿中。在体视显微镜下观察到SNT周围非神经组织松解后，将样本转移至冰冷的1×PBS中。为终止胰蛋白酶消化，将样本转移至另一含有冰冷DMEM（含10% FBS）的新培养皿中。使用镊子手动去除SNT中残留的间充质和外胚层组织。将处理干净的SNT组织段转移至1.5毫升离心管中，并在液氮中速冻。随后，按照文本方案中的步骤匀浆组织。加入13.5 µL的37%甲醛，在室温下于旋转仪上孵育15分钟。为淬灭甲醛，向管中加入25 µL的2.5 M甘氨酸，在室温下于旋转仪上继续孵育10分钟。离心管子，然后根据文本方案洗涤沉淀物。交联后，用移液器将沉淀重悬于300微升冰上预冷的完整裂解缓冲液中。将样品置于4摄氏度的摇床上孵育10分钟。接着，在4摄氏度条件下对样品进行超声处理。超声处理后，将样品在 4 摄氏度下以 16,000 × g 离心 10 分钟。将上清液或裂解液转移至新的 1.5 毫升离心管中，并弃去细胞碎片沉淀。根据文本方案中的说明稀释裂解液。然后，将每个样品保留少量等分试样作为输入对照，并在 -20 摄氏度下冷冻保存。根据文本方案，将剩余样品与适当的抗体共同孵育，用于染色质沉淀或染色质免疫沉淀（ChIP）。接着，将 300 µL 抗体结合的染色质加入预先洗涤的磁珠中。将试管倒置以混匀样品。为使抗体与磁珠结合，将试管置于试管旋转仪上，在4°C下垂直旋转，至少旋转四小时。为洗涤染色质结合的磁珠，向置于冰上的试管中加入一毫升冰冻的RIPA洗涤缓冲液，并通过倒置或轻弹试管进

chromatin-immunoprecipitation-chip-protocol-for-low-abundance

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

低丰度胚胎标本的染色质沉淀 (芯片) 协议

ESC的分化伴随着染色质结构和组成的细胞类型特异性变化。检测这些变化可为定义干细胞特性及细胞分化的机制提供重要见解。染色质免疫沉淀（ChIP）是一种有价值的手段，可用于解析干细胞分化背后的分子机制。...

人类胚胎干细胞的染色质免疫沉淀

我们展示了一种染色质免疫沉淀（ChIP）方法，用于鉴定小鼠胚胎组织中组织特异性基因表达启动期间或之后，组织特异性基因上的因子相互作用。该方案在正常胚胎发育过程中研究组织特异性基因激活时具有广泛的适用性。...

利用小鼠早期胚胎对组织特异性基因进行染色质免疫沉淀实验

我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。...

使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP...

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

染色质调控因子和染色质状态如何影响基因组的问题 在体 对于理解发育中胚胎早期细胞命运决定机制至关重要。本文概述了在全基因组水平上研究染色质特征最常用的方法——ChIP-Seq。 非洲爪蟾...

通过ChIP-Seq获得的Xenopus胚胎中染色质调控因子和状态的全基因组快照

基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。...

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

我们提出了一种有效且可重复的方法，用于从胚胎期和出生后脑组织中分离和培养神经前体细胞，以进行组蛋白3第79位赖氨酸二甲基化（H3K79me2）的染色质免疫沉淀（ChIP）——该组蛋白修饰位于组蛋白3的球状结构域内。...

神经前体细胞的分离与培养及组蛋白3赖氨酸79二甲基化标记的染色质免疫沉淀

本文介绍了进行 ChIP-Seq 和 CARIP-Seq 的方法，包括用于下一代测序的文库构建，以在胚胎干细胞中生成全基因组表观遗传学和染色质相关 RNA...

CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

本文介绍了一种高效染色质免疫沉淀（ChIP）后接高通量DNA测序（ChIP-seq）的实验方案，适用于从小鼠分离的棕色脂肪组织（BAT）样本。该方案可用于全基因组范围内组蛋白修饰的定位分析，以及非组蛋白目标蛋白的全基因组定位研究。 体内.

小鼠棕色脂肪组织的染色质免疫沉淀

染色质免疫沉淀（ChIP）是研究基因调控分子机制的有力工具。然而，该方法在通过机械剪切获得可重复的染色质片段化方面存在困难。在此，我们提供一种利用酶解消化的ChIP检测的改进方案。...

使用微球菌核酸酶在哺乳动物细胞中进行染色质免疫沉淀实验

本方案重点介绍从速冻组织中制备染色质的方法，适用于交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）后续进行定量PCR分析（X-ChIP-qPCR）或高通量测序（X-ChIP-seq）。...

从冷冻嵌合肝组织中提取染色质用于染色质免疫沉淀分析

学习低丰度鸡胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）及ChIP-seq文库制备方法，用于生成全基因组表观遗传图谱。该技术有助于研究组蛋白修饰结合特征，揭示发育生物学中转录调控机制。

低丰度胚胎样本的染色质免疫沉淀（ChIP）实验方案

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