精确、高通量的细菌生长分析

本实验的总体目标是以高通量方式精确分析细菌生长。通过该方法，可同时检测多种培养基或不同菌株。该方法有助于回答系统生物学和微生物学领域的关键问题，例如细胞生长的决定因素是什么。

该技术的主要优势在于，它能够使研究人员精确评估细菌细胞生长曲线中的最大生长速率和最大种群密度等全局参数。尽管该方法可用于研究大肠杆菌（E. coli）的生长，也可应用于其他微生物，例如环境细菌的生长测定与筛选。

首先，将五支带有硅胶塞的灭菌玻璃试管、移液管和目标菌株放置于洁净工作台上。打开硅胶塞前，将玻璃试管口部置于本生灯火焰上灼烧。试管打开后，将硅胶塞也短暂过火灭菌，然后轻轻盖回玻璃试管上。

接下来，使用电子移液器和一次性血清移液管，向其中一根玻璃试管中加入 5 毫升 M63，向其余四根试管中各加入 4.5 毫升 M63。使用 p200 吸头挑取一个菌落，并接种到含有 5 毫升 M63 的玻璃试管中。涡旋振荡试管，制成菌悬液。

然后，取0.5毫升该溶液转移至装有4.5毫升M63的四支试管中的一支，将溶液稀释10倍。对剩余试管重复此操作。对玻璃试管管口和硅胶塞进行灭菌后，用硅胶塞盖紧试管。

然后，将五个试管放入已预热至37 °C的摇床培养箱中，以200 rpm振荡培养。培养过夜或10至30小时。培养结束后，用移液器（p1000）向一次性比色皿中加入1,000 μL M63。

将一次性比色皿放入分光光度计中。在600纳米的固定波长下启动程序，测定空白样。将五个玻璃试管从摇床培养箱转移至洁净工作台。

弃去一次性比色皿中的 M63 溶液，使用 p1000 加入 1,000 微升培养物至同一一次性比色皿中，然后测定细胞培养物的光浊度。接着，向一个 1.5 毫升微量离心管中加入 250 微升灭菌的 60% 甘油溶液和 750 微升选定的细胞培养物，通过移液混匀。

将剩余的九个微量离心管放入微管架中，并向每个管中加入100微升已配制的混合液。将储备液置于-80摄氏度超低温冰箱中保存。设置酶标仪时，首先打开软件，在任务管理器中打开实验方案，选择创建新方案。

然后，选择标准程序。打开操作界面并调整设置。打开设定温度，选择并开启培养箱。

然后，将温度设置为 37°C，梯度设置为 0°C。继续下一步之前，请检查预热状态。打开起始动力学程序，运行时间设置为 24 或 48 分钟，然后将间隔设置为 30 分钟或 1 小时。

打开摇板机并设置摇动模式为线性。勾选连续摇动，并将频率设为 567 cpm。接着，打开读数功能，选择吸光度，终点法/动力学法及单色器。

将波长设置为 600。最后，单击验证以确认程序正确，然后单击保存，将其另存为新程序以供将来使用。

为实时记录生长情况，向已灭菌的试剂储液槽中加入约 25 毫升 M63 培养基。然后，向微管中加入 900 微升 M63 培养基，以准备进行连续稀释。接着，向解冻的甘油菌种中加入 900 微升 M63 培养基，并涡旋混匀。

将100微升10倍稀释液转移至另一含有900微升M63的微量离心管中，并涡旋混匀。重复此步骤，直至达到所需稀释倍数。随后，使用八通道移液器向已灭菌的96孔平底微量培养板边缘的孔中各加入200微升M63。

根据参考表格，将每种稀释后的样品各 200 微升加入至微孔板的孔中。为避免因加热和接种效率导致的分布不均，切勿使用微孔板边缘的孔进行样品加载，并将同一样品加入微孔板上不同位置的多个孔中。将 96 孔微孔板放置于酶标仪上。

立即打开读取程序并选择任务管理器中的相应程序。单击“确定”开始测量。最后，将记录保存为新的实验文件，以供数据分析。

此处展示的是在实验开始前制作的参考表格示例。绘制了一个 8 行 × 12 列的 96 孔板示意图，用于标明接种培养样品在 96 孔板上的位置。通过将 OD600 的所有连续数值对代入公式计算生长速率。

通过计算连续五个生长速率的平均值和标准差，来估算最大生长速率。总共60个细胞培养物的生长速率以热图形式显示。颜色从白色到红色的渐变表示生长速率从低到高。

一旦掌握，若操作得当且步骤正确，该技术可在数分钟内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何准备样本并将其加入微孔板，以高通量方式精确测量细菌生长情况。在进行该实验时，重要的是要记住在实验开始前建立参考表格，以避免细胞培养密度过低，并确保细胞在24小时内开始生长。

采用此方法后，还可进行其他操作，例如实验操作的自动化和计算分析，以回答更多问题，如群体扩增的决定因素及其动态规律。该技术一经建立，便为系统生物学和微生物学领域的研究人员开辟了道路，可用于探究细胞生长的基本原理，并优化培养基的组成成分。