Name: 游离的小鼠皮层神经元文化的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: 学习制备小鼠皮层神经元培养物的方法，用于电生理学和钙成像等神经科学研究。该技术适用于研究神经元发育及基因突变影响，为体外实验提供可靠平台。

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培养前的准备工作：
<ul>
<li>配制无菌解剖液（DS）。</li>
<li>配制NBM/B27（含B27添加剂的Neurobasal培养基）。</li>
<li>如需要，对ddH2O进行高压灭菌，并对玻璃盖玻片进行灭菌处理。</li>
<li>用多聚-D-赖氨酸包被组织培养皿或玻璃盖玻片。</li>
</ul>
多聚-D-赖氨酸包被：
在无菌条件下，于培养前一天进行准备。
<ul>
<li>将一份10X多聚赖氨酸（PDL）解冻并置于冰上。</li>
<li>在1 ml PDL中加入9 ml无菌超滤水，充分混匀（配制成1X）。</li>
<li>按以下方式在室温下用1X PDL过夜包被表面：
<ul>
<li>玻璃盖玻片（Bellco Glass, Inc. 货号# 1943-00012）：每张盖玻片75 µl &nbsp;或</li>
<li>24孔培养板：每孔300 µl &nbsp;或</li>
<li>35 mm培养皿：每皿1 ml</li>
</ul>
</li>
<li>用无菌水冲洗5次（使用无菌巴斯德吸管吸取液体）。</li>
<li>去除水分，直至表面完全干燥。</li>
</ul>
培养步骤（在层流罩内的无菌条件下进行）
<ol>
<li>用超级胶水将琼脂块粘附到切片机（Vibraslicer，Campden Instruments Ltd.）的支撑块上。</li>
<li>当使用晚期胚胎阶段（E17-18）的小鼠胎儿时，处死母鼠，取出子宫，并从胎膜中分离出单个胎儿。将胎儿置于无菌培养皿中，按以下步骤继续操作。</li>
<li>将小鼠胎儿或幼鼠断头处死（遵循所在机构动物护理与使用委员会批准的指南）。</li>
<li>去除皮肤和颅骨，将脑组织置于盛有冷解剖液（DS）的60 mm培养皿中的Whatman滤纸圆片上。</li>
<li>使用无菌剃须刀片切除小脑。</li>
<li>用刮铲拾取脑组织，在滤纸上吸去多余液体，然后将脑组织转移至Vibraslicer的支撑块上并固定（尾端朝上，腹侧面向琼脂）。</li>
<li>向切片室中加入冷解剖液（DS），将速度选择器调至8-9档。</li>
<li>从嗅球开始切取200-400 µm厚的脑片。当Vibraslicer刀片进入皮层区域后，开始切取600 µm厚的冠状切片。E17-18期小鼠脑通常可获得3-4个可用切片，而P0期小鼠脑可获得4-5个可用切片。</li>
<li>使用未装吸头的10 ml玻璃巴斯德移液管的反向末端，将脑片转移至标记为DS 2的35 mm培养皿中。</li>
<li>使用从毛细管拉制的玻璃针剥离皮层组织并去除软脑膜。</li>
<li>将皮层组织切成0.5-1 mm长的小块。</li>
<li>将酶解液（ES）通过连接在5 cc注射器上的0.2 µm滤器过滤至35 mm培养皿中。</li>
<li>将皮层组织小块转移至含有过滤后酶解液（ES）的培养皿中。</li>
<li>在37°C条件下孵育30分钟。</li>
</ol>
在此期间：
<ol>
<li>清理超净台、振动切片机和解剖工具。</li>
<li>向一个60 mm培养皿中加入5 ml温热的NBM/B27培养基。</li>
</ol>
孵育 30 分钟后：
<ol>
<li>将组织转移至 10 ml DS 中，静置 1 分钟。</li>
<li>将组织转移至第一管 Hi 中，涡旋混匀，静置 2–3 分钟。</li>
<li>转移至第二管 Hi，重复上述步骤。</li>
<li>转移至第一管 Li，重复上述步骤。</li>
<li>转移至第二管 Li，重复上述步骤。</li>
<li>转移至第三管 Li，重复上述步骤。</li>
<li>将组织转移至含有培养基的 60 mm 培养皿中。</li>
</ol>
在解剖显微镜下：
<ol>
<li>清除组织中的碎片，并通过轻轻吹打经过拉制的玻璃移液管（使用逐渐减小的孔径）来机械解离组织块，以充分分散组织。</li>
<li>将细胞悬液转移至含有剩余NBM+B27的15 ml锥形管中（对于24孔板，总体积为13 ml；对于5–35 mm培养皿，总体积为11 ml）。轻柔混匀，静置以使较大的组织碎片沉降。</li>
<li>将细胞悬液接种至培养板中（24孔板每孔0.5 ml，35 mm培养皿每皿2 ml）。</li>
<li>若使用玻璃盖玻片，每张盖玻片加入80 µl细胞悬液，置于细胞培养箱中孵育1小时，待细胞贴附后，再向培养腔内添加足量的NBM/B27培养基。</li>
<li>将培养物维持在37°C、5% CO2的培养箱中。</li>
</ol>
第二天
24孔板：每孔加入0.5 ml非神经元细胞条件化NBM/B27培养基（cNBM/B27；cNBM/B27培养基的制备方案见下文）
35 mm 培养皿：加入 0.5 ml cNBM/B27 培养基进行替换。
每2-3天将0.5 ml培养基更换为新鲜的cNBM/B27，以维持培养。
尽管培养基不会促进胶质细胞增殖，但如果需要，可在培养第3至第5天用5 µM FDU（5-氟-2'-脱氧尿苷，Sigma F0503）处理培养物，以进一步减少胶质细胞数量。
解剖与培养的准备工作
将解剖工具在70%乙醇中灭菌或进行高压灭菌：
<ul>
<li>剪刀（中号和小号） 抹刀（中号和小号）</li>
<li>镊子（中号和小号） 剃刀刀片</li>
<li>振动切片机刀片 缓冲液浴槽</li>
<li>用于刀片的小型金属楔块 脑组织支撑架</li>
</ul>
其他材料：
<ul>
<li>培养皿（60 mm）</li>
<li>培养皿（35 mm）</li>
<li>滤纸</li>
<li>玻璃移液管，10 ml</li>
<li>无菌一次性移液管，5、10 和 25 ml</li>
<li>注射器滤器，0.2 µm</li>
<li>注射器，5 cc</li>
<li>离心管，15 ml</li>
<li>无菌巴斯德玻璃移液管</li>
<li>多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的培养皿或玻璃盖玻片</li>
</ul>
标记六个15 ml离心管，并按以下步骤进行准备：
试管 #1：酶溶液：
向含有以下成分的 5 ml DS 中加入 50 U 木瓜蛋白酶（Worthington LS 03126）：
<ul>
<li>100 µl L-半胱氨酸（0.8 mg）</li>
<li>7 µl 0.1 N NaOH</li>
<li>50 µl APV（5 mM）</li>
</ul>
将溶液置于室温下静置至澄清。注意，酶溶液最初会呈现“浑浊”状态，使用前需静置至澄清。
&nbsp;
第2管和第3管：Hi酶抑制剂：
3 ml DS + 300 µl BSA/Ti + 30 µl APV (5 mM)。
轻轻混匀以避免产生气泡，然后分成两份，每份 1.5 ml。
&nbsp;
第4至第6管：低酶抑制剂：
8 ml DS + 80 µl BSA/Ti + 80 µl APV (5 mM)。
轻轻混匀以避免产生气泡，分装成三份，每份 2.6 ml。
&nbsp;
将编号为 #2 至 #6 的试管置于冰上。将 #1 号试管（酶溶液）留在室温下。
溶液与分装
<ul>
<li>溶液 A（缓冲盐水）Sigma 配方，重量 500 ml [浓度]</li>
<li>氯化钠 NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mM</li>
<li>氯化钾 KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mM</li>
<li>无水磷酸氢二钠 Na2HPO4 S-0876 142.0 0.24g 0.17mM</li>
<li>无水磷酸二氢钾 KH2PO4 P-5379 136.09 0.3g 0.22mM</li>
</ul>
称取所有成分，加入400 ml超滤水搅拌至完全溶解，加水定容至500 ml。转移至洁净瓶中，高压灭菌。4°C保存，并标记为“DS溶液A”。
<ul>
<li>溶液B（Hepes）Sigma 配方，分子量 250 ml [浓度]</li>
<li>Hepes Hepes H-3375 283.3 20.97g 9.9mM</li>
</ul>
加入超纯水至200 ml，搅拌至溶解，再加水定容至250 ml。置于洁净瓶中，高压灭菌。4°C保存，并标记为“DS溶液B”。
<ul>
<li>工作液 500 ml [浓度]</li>
<li>超滤水 400 ml</li>
<li>储备液 A 25 ml</li>
<li>储备液 B 14 ml</li>
<li>D-(+)-葡萄糖 Sigma G-8270 3.0 g 33.3 mM</li>
<li>蔗糖 Sigma S-0389 7.5 g 43.8 mM</li>
</ul>
用1N NaOH调节pH至7.4，用超滤水定容至500 ml。倒入洁净的玻璃瓶中，高压灭菌。4°C保存。标记为“解剖液”。
聚-D-赖氨酸制备：
<ol>
<li>用无菌 H2O 配制 10 倍浓度的多聚-D-赖氨酸（PDL；Sigma P-7280）储存液，浓度为 1 mg/ml。</li>
<li>分装成每份 1.0 ml。该溶液可在 -20°C 下保存长达 3 个月。</li>
</ol>
媒体
<ol>
<li>向500 ml NBM瓶（Neurobasal Medium，Gibco 21103-049）中加入10 ml B-27 Supplement（Gibco 17504-044）。</li>
<li>分装为40 ml每份，4°C保存。</li>
</ol>
APV
<ol>
<li>向含有10 mg APV（2-氨基-5-膦酰戊酸，Sigma A-5282）的西林瓶中加入10 ml无菌H2O，并充分混匀。</li>
<li>分装为180 µl每份，于-20°C保存。</li>
</ol>
BSA/Ti
<ol>
<li>将1 g BSA（牛血清白蛋白，Sigma A-7030）和1 g胰蛋白酶抑制剂（Sigma T-9253）溶于10 ml DS中。</li>
<li>用1N NaOH调节pH至7.4。</li>
<li>通过0.2 µm针头滤器过滤除菌。</li>
<li>分装为400 µl每份，于-20°C保存。</li>
</ol>
L-半胱氨酸
在 1.5 mL 离心管中，将 0.6 mg L-半胱氨酸（Sigma C-7755）溶于 200 µl DS 中。
琼脂糖（4%）
<ol>
<li>将 4 g Bacto Agar（Difco 0140-01）溶解于 100 ml 无菌水中。使用前置于 4°C 保存。</li>
<li>微波加热琼脂至融化，倒入 35 mm 培养皿中。静置冷却并使其凝固。</li>
</ol>
木瓜蛋白酶（Worthington LS 03126）
NUNC 培养瓶中的非神经元培养
包被培养瓶（4 个 Nunc 瓶）
<ol>
<li>向3个装有10倍浓缩PDL的试管中各加入9 mL无菌水，配制成1倍浓度PDL。</li>
<li>将30 mL 1倍浓度PDL转移至第一个瓶子中。</li>
<li>轻轻移动瓶子，直至所有生长表面均被覆盖，静置1分钟。</li>
<li>将1倍浓度PDL转移至第二个瓶子中，静置1分钟。</li>
<li>对第三和第四个瓶子重复上述操作。</li>
<li>用150 mL无菌H2O对全部四个瓶子进行两次冲洗。</li>
</ol>
制备酶溶液（ES）：
<ol>
<li>在0.6 ml离心管中称取0.8 mg L-半胱氨酸（Sigma C7755），加入150 µl DS，涡旋振荡至晶体完全溶解。</li>
<li>将5 ml DS转移至15 ml锥形管中，然后加入150 µl L-半胱氨酸。</li>
<li>加入50单位木瓜蛋白酶。（Worthington LS 03126）</li>
<li>加入7 µl 0.1 N NaOH。</li>
</ol>
配制 MEM（GIBCO # 11090-081）
<ol>
<li>从500 ml MEM瓶中移除65 ml液体，保留10 ml用于配制葡萄糖溶液。</li>
<li>加入5 ml青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep，Gibco #15070-063）。</li>
<li>加入10 ml 1M葡萄糖溶液（Sigma G-8270）（1.8 g/10 ml MEM）。</li>
<li>加入50 ml胎牛血清（Fetal Bovine Serum，Gibco #16140-071）或小牛血清（Bovine Calf Serum，Omega BC-04）。</li>
<li>充分混匀，分装后于4°C保存。</li>
</ol>
神经基础培养基/B-27 添加剂 (NBM/B27) NBM，500 ml (Gibco #21103-049)；B-27 (50X)，10 ml (Gibco #17504-044)
<ol>
<li>将 B-27 小瓶中的全部内容物加入 NBM 瓶中并混匀。</li>
<li>分装后于 4°C 保存。</li>
</ol>
脑组织解剖
<ol>
<li>解剖前将解剖工具从70%乙醇中取出晾干。</li>
<li>将10 ml DS分别加入3-15 ml离心管中，每管10 ml。</li>
<li>选取P0至P3日龄的小鼠幼崽，每4瓶需要3个脑组织。</li>
<li>向35 mm培养皿中加入冰冷的DS溶液。</li>
<li>断头处死小鼠幼崽，并取出脑组织。</li>
<li>将脑组织放入盛有冰冷DS溶液的培养皿中。</li>
<li>将组织切成小块，大小需足以通过玻璃移液管。</li>
</ol>
酶解离
<ol>
<li>用巴氏吸管尽可能去除培养皿中的 DS。</li>
<li>将 ES 通过 0.2 µm 滤膜和 5 cc 注射器过滤。</li>
<li>将 ES 加入含有组织的培养皿中。</li>
<li>将组织置于 37°C 培养箱（无 CO2）中孵育 30 分钟。</li>
</ol>
组织洗涤
<ol>
<li>用玻璃移液管将组织转移至第一支DS管中，注意尽量减少ES的带入。</li>
<li>在1500 rpm下离心30秒。</li>
<li>转移组织，并重复此步骤两次。</li>
</ol>
吹打
<ol>
<li>将38 ml MEM/FBS加入50 ml离心管中</li>
<li>向35 mm培养皿中加入3 ml MEM/FBS，并将组织转移至该培养皿中。</li>
<li>使用1000 µl移液枪头轻轻吹打，使组织解离。</li>
<li>将细胞悬液转移至含有38 ml MEM/FBS的离心管中，充分混匀。</li>
</ol>
铺板
<ol>
<li>将培养瓶直立放置，以确保每个瓶中的细胞悬液和培养基体积相等。</li>
<li>在每个培养瓶中加入 90 ml MEM/FBS 培养基。</li>
<li>在每个瓶中加入 10 ml 细胞悬液。</li>
<li>标记：非神经元细胞、 initials 和日期。在 37°C、5% CO2 条件下培养。</li>
</ol>
喂养
<ol>
<li>第3天或第4天，用预热的MEM/FBS培养基更换细胞培养液（倒掉全部旧培养基，加入100 ml MEM/FBS）。细胞培养可能需要7–10天达到汇合状态。</li>
<li>第7–10天，更换为NBM/B27培养基。</li>
<li>次日，收集培养上清液，用0.22 µm滤膜过滤。</li>
<li>将滤液分装为每份40 ml，然后用MEM/FBS培养基继续培养细胞。</li>
<li>接下来的2至3天，更换为NBM/B27培养基。</li>
<li>次日，收集&nbsp;并重复上述操作。</li>
<li>持续收集培养上清液约2周时间。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

<table><tbody><tr><td>5-氟-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基 (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基-5-磷酰戊酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，1N 溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>细菌培养用琼脂</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>无菌 0.2 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片，No1，12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>最低必需培养基 (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>含 Earle&amp;rsquo;s 盐，不含 L-谷氨酰胺，用于非神经元细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>用于非神经元细胞培养</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>非神经元细胞培养所需</td></tr><tr><td>Nunclon &quot;三联培养瓶&quot; 组织培养瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>用于非神经元细胞培养。在制备 &quot;条件化 Neurobasal 培养基/B27&quot; 时非常方便，但也可使用其他组织培养瓶或培养皿替代。</td></tr><tr><td>玻璃底 &quot;成像培养皿&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>玻璃底 35 mm 培养皿，适用于倒置显微镜系统下的钙离子或钠离子成像，但价格较高！</td></tr></tbody></table>

分离小鼠皮层神经元培养物的制备

关键词：小鼠, 皮层神经元, 原代培养, 神经元分离, 细胞培养

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

本视频将指导您完成从小鼠晚期胚胎及早期出生后脑组织中制备皮层神经元培养物的全过程。此类培养物可用于多种实验应用，包括免疫细胞化学、生物化学分析、电生理记录、钙离子与钠离子成像，以及蛋白质和/或RNA的提取。此外，这些培养体系还可为研究携带晚期胚胎期或出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供平台。该实验流程相对简便，但需具备一定的组织培养技术经验；若准备充分，整个操作通常不超过两至三小时。在分离过程中仔细去除丘脑-皮层纤维束，有助于减少非神经元细胞的污染。在酶消化步骤后，应轻柔吹打皮层组织碎片以提高神经元细胞的得率。此步骤至关重要，因其可避免对细胞造成不必要的机械损伤，并防止神经元过早死亡。由于这些培养物在无胶质细胞饲养层的条件下维持，因而还可获得神经元高度富集的培养体系，具有额外优势。

关键词：皮层神经元培养，小鼠脑组织，晚期胚胎期，出生后早期，免疫细胞化学，生物化学，电生理学，钙成像，钠成像，蛋白质提取，RNA提取，基因突变，神经元发育，酶消化，吹打解离，非神经元细胞，胶质细胞饲养层

本视频展示了一种从晚期胚胎和早期出生后小鼠大脑皮层制备神经元培养物的方法。这些培养物可用于免疫细胞化学、生物化学、电生理学、钙离子和钠离子成像，为研究携带出生后致死性基因突变的转基因动物的神经元发育提供了平台。

本视频将指导您完成从小鼠晚期胚胎及早期出生后脑组织中制备皮层神经元培养物的操作流程。这些培养物……

大家好，我叫Hilgenberg。我在加利福尼亚州尔湾市的大学解剖学与神经生物学系工作。今天我将向大家介绍我们如何从小鼠制备皮层神经元培养物。这些是用于制备神经元的出生后天数小鼠。我们通常将这些培养物用于电生理学实验，或用于蛋白质和RNA的制备。我们也可采用相同的培养方法进行钙成像或钠成像。这些培养物的优点在于，它们实际上是银行家协议（banker protocol）的一种改进，但我们是在无胶质细胞饲养层的条件下培养这些细胞，这使得操作更加方便，而且培养物中神经元的含量通常远高于胶质细胞。现在我们开始吧，我将向您展示如何制备这些神经元。好了，现在我们已经可以取出脑组织，开始进行实际的解剖操作了。但在进行之前，需要强调的是，用于接种这些细胞的盖玻片必须经过包被处理。我们通常在室温下使用浓度为0.1毫克/毫升的多聚赖氨酸溶液对盖玻片进行包被，孵育过夜。第二天，我们移除多聚赖氨酸溶液，并将盖玻片连续清洗三次。根据您的实验需求，可以使用大培养皿或小培养皿，也可以使用玻璃盖玻片。好的，这是生物安全柜的标准配置，我已简要说明您需要准备哪些溶液，以及在脑组织的分离或解剖，以及后续实际切片过程中会用到哪些有用的仪器。此处我们所使用的是冰冷的解剖溶液。通常情况下，脑组织要放在冰上。我们需要使用振动切片机对脑组织进行切片。我有一个小船形槽，里面装有用于解剖的溶液，脑组织被固定在其中，然后进行切片。我有多种用于取出脑组织的工具。我使用一块螺旋钻板，其规格为4%螺旋钻，用来固定脑组织。我们需要一个注射器、几个无菌滤器、Rotman 纸皿、各种尺寸的培养皿。这是我的小鼠吹管工具。这里还有我拉制的玻璃毛细管。这些是玻璃毛细管，我将其用作解剖工具，同时也用于拾取脑组织碎片并进行反复操作。我们的酶溶液中含有解离溶液，其中包含 L-半胱氨酸，用于激活木瓜蛋白酶，以及 0.1 N 氢氧化钠，用于调节 pH 值。加入pepane后，溶液会变得略微不透明，需要等待溶液澄清后，才能用于酶解组织。现在我们基本已准备好开始实验操作。纤维切割器（fibro Slicer）已经准备就绪。我已插入刀片以切开我的脑组织，同时也将装有缓冲液并用于支撑脑组织的容器放置到位。现在，我准备将琼脂糖凝胶块（AGA）安装到支撑板上，该支撑板也将用于固定脑组织。此琼脂糖凝胶块已经固化，浓度为4% AGA，接下来我将从此类区域直接进行切割。在两侧基本上只需切出一个矩形的钻孔。然后我使用刮刀将这一部分从钻孔块中取出。现在，我将把该钻孔部件粘接到支撑板上，使钻孔的平面朝前。因此，这是用于粘贴脑组织的支撑物，并通过此螺旋钻固定位置。这样在进行切片时，脑组织不会向后移动。现在我们已准备好取出脑组织。通常我们使用出生当天（P0）或出生后第一天（P1）的小鼠。好了，这是已断头的小鼠头部，我将快速去除头皮。首先，我会剪断此处以及另一侧的肌肉层。然后我用剪刀进行操作，特别注意剪刀的内侧不要损伤脑组织，并在两侧沿颅骨周围进行剪切。现在我们可以小心地取出软骨，我将使用我的小型ULA，以这种方式移除脑组织。然后将此脑组织放入我已盛有切片溶液的培养皿中，培养皿底部放置了一张沃特曼滤纸。接下来，我希望切割脑组织的基部，以便获得一个平整坚实的区域，便于将其固定在切片托上。因此，我会在支撑板上滴一滴非常少量的胶水。现在，我将用解剖刀铲起我的脑组织，并使用弯头镊子来协助操作。我需要做的是，基本去除在解剖液中残留的多余液体，然后将脑组织固定在螺杆支撑装置上。现在我们准备将脑组织转移到缓冲浴中。因此，我在该小容器中加入解剖液，并将支撑脑组织的支架放入其中。脑组织已安装就位，其面向刀片的一侧朝下。好的，现在脑组织已经固定好，我将使用纤维切片器，尝试找到脑的起始位置，将脑组织向刀片方向移动。我刚刚切除了部分嗅球。现在我将刀片向下移动约 600 µm，再进行一次切割，这一刀应正好穿过皮层。皮层已经切下，并顺着刀片向上移动。现在我将刀片再向下移动600微米，进行第二部分的切片。此过程必须连续、平稳地完成，不能中断，这一点非常重要。当取出刀片时，停止使用光纤切割器。现在将使用一根用反了的玻璃移液管，我实际上是用其后端，将此皮层切片向上移动并转移至一个干净的培养皿中。我继续切取脑组织，每次推进600微米，直到收集到约五到六片P零或P一阶段小鼠的脑片，直至到达大脑皮层的末端。现在，我们可以准备将皮层从脑的其余部分分离出来。好的，我正在使用这些拉制的玻璃移液管，其尖端锋利程度堪比解剖工具。我通常从获取的第一个部分开始操作，也就是最小的嗅球区域，需要将其移除。同时，我还尝试去除这个标本上的脑膜。再次，去除该组织的嗅球部分，将其从脑膜上剥离下来。有时会遇到难以分离的组织块，此时可直接跳过，保留那些易于分离的优质组织。我通常从一端开始，逐段推进操作。重要的是要清除脑膜，同时在观察这些切片时，有时需要将它们翻转过来，以便更清楚地看到含有大量非神经元细胞的纤维束位置，而这些非神经元细胞正是本实验制备过程中需要尽量避免的。好的，在这个切片中，你可以清楚地看到皮质层下方的这条纤维束。因此，我将针头刺入皮质层末端与该纤维束之间的区域，而我所指出的正是含有大多数非神经元细胞的纤维束，这正是我们在本实验制备中需要避开的部分。因此我沿着这条线进行切割，尽量将纤维束留在后面。这一步是将组织切成小块。好的，现在我正通过连接在注射器上的0.2微米滤器对酶溶液进行灭菌。然后我将消化液直接加入到我的皮质组织块中，就像这样。确保有足够的液体浸没所有皮质组织块，随后将这些组织块放入37°C的培养箱中孵育30分钟，这一步可显著松解组织结构。因此，这些皮质组织块已在培养箱中孵育了30分钟。与此同时，我预热了一些含有 B 27 添加剂的神经基础培养基，这些细胞最终将被放入该培养基中。我还准备了一些溶液，第一个是解剖液。因此使用的是普通解剖液。随后将其转移至含有BSA作为清除剂和PV以阻断NMDA受体组分的高浓度胰蛋白酶抑制剂溶液中。接着再经过三次含有低浓度胰蛋白酶抑制剂、BSA和PV的洗涤步骤。现在我将把这些组织从丙烷溶液中取出，并转移至含有DS解剖液的锥形管中。这些细胞团块将仅依靠重力向下沉降，可能需要一到两分钟才能全部沉降到离心管的锥形部分。然后我将再次轻轻拾取它们，并转移至含有高浓度胰蛋白酶抑制剂的溶液中。同样，我们需要等待这些细胞团块再次沉降到管底。再用高浓度胰蛋白酶抑制剂溶液洗涤一次，然后将这些细胞团块转入低浓度胰蛋白酶抑制剂溶液中洗涤。在最后一次低酶抑制剂洗涤后，我将把细胞转移至预热的神经基础培养基中，并开始通过吹打玻璃毛细管（内径逐渐减小）进行机械性解离。现在我将吹打细胞以及组织团块。但在进行之前，我将先移除此处可见的所有碎片。例如，有从细胞中泄漏出的蛋白质和DNA，它们形成类似棉絮状的物质，附着在组织团块上。你需要先去除这些物质，因为它们会堵塞移液枪头，并且在将组织强行通过更小直径的孔时造成阻碍。然后，我将折断一些玻璃毛细管，以获得合适尺寸的开口，便于细胞进出。这根移液管很好，可以看到它的开口圆润光滑，没有任何锋利的边缘。我将把组织放入移液管中。移液管中间装有一个0.2微米的滤膜，现在我将组织在玻璃毛细管中反复移动。第一步操作应该会比较顺利，因为组织团块的大小并不比移液管口大太多。您需要做的就是将组织充分松散。然后使用稍小一点的移液枪头继续操作。我希望能有一个光滑、圆润的移液枪头。这看起来很好。同样，所有团块会一次性被移入和移出移液管。因此，组织现在非常柔软且已松散，如果你将这些团块重新悬浮于培养基中，细胞基本上就会自行脱落出来。现在，我将把所有解离的细胞转移到一个新的15毫升锥形管中，并再次将管子冷藏两到三次，每次轻轻上下颠倒，以进一步分散仍存在的较大细胞团块。然后，我们需要静置一到两分钟，使管中残留的大块组织沉降到管底。此外，如果你使用的玻璃毛细管有碎屑脱落，这些玻璃碎片也应在此过程中沉降到管底。然后我们可以取此溶液的等分试样，接种到完全涂有层粘连蛋白的盖玻片或培养皿上。我将80微升样品接种到这块预先涂有聚赖氨酸的玻璃盖玻片上，会形成一个良好的液滴凸面。细胞最终会沉降并黏附在玻璃盖玻片上。大约一小时后，细胞已经沉降，我将非常轻柔地向整个培养皿中加入更多培养基。可以像这样轻轻晃动一下。然后将这些细胞放入37摄氏度的培养箱中，明天我将用条件培养基对其进行换液。好了，这些是皮质细胞，它们的培养时间略少于一天。这些细胞是昨天接种的，你可以看到其中含有大量神经元，所有细胞都具有丰富的神经突起，同时其中也存在一些细胞碎片。这些是未能存活的细胞，将在接下来的几次换液过程中被洗去。死亡的细胞表现为体积很小、细胞膜呈皱褶状的圆形细胞。我刚刚向您展示了如何制备这些解离的皮层培养物。需要注意的是，当您从脑片中移除皮层组织时，应将其与丘脑皮层纤维束分离，因为后者含有大量非神经元细胞。此外，在解离细胞时切勿过度吹打，否则会基本杀死此前已分离获得的大部分细胞。因此，请轻柔处理组织切片，您将获得理想的培养效果。祝您的实验顺利成功。

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生物学

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学习制备小鼠皮层神经元培养物的方法，用于电生理学和钙成像等神经科学研究。该技术适用于研究神经元发育及基因突变影响，为体外实验提供可靠平台。

分离小鼠皮层神经元培养物的制备关键词：小鼠, 皮层神经元, 原代培养, 神经元分离, 细胞培养

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