通过子代检测改变斑马鱼致死性骨骼突变显

这种育种策略的总体目标是向上或向下纵突变体外显率。这种选择性育种方法可以更全面地了解突变表型。通过生成高外显率和低外显率突变菌株，可以了解突变的整个表型系列。

大多数斑马鱼在突变体隐性致死的地方鳞片，因此纯合突变体在直接繁殖之前就死亡了。因此，我们采用了经典的后代测试选择性育种策略，我们在这里进行了演示。我们在尝试延时记录异位骨细胞发育时首次拥有此方法的项目。

令人沮丧的是，额外的骨细胞经常出现在其中，因此我们开始通过选择性育种来改变突变的渗透剂。虽然我们在带有突变线的斑马鱼秤上执行这种方法，但它也可以应用于其他斑马鱼突变表型，也可能应用于其他生物体。根据文本方案制备未选择的起始斑马鱼原液后，按如下方式进行 KASP 基因分型。

将斑马鱼尾组织放入 96 孔板孔中的 50 μL 裂解缓冲液中。每孔添加 10 微升每毫升 10 毫克蛋白酶 k，并在 55 摄氏度的热循环仪中消化组织样品 2 至 5 小时。然后是 20 分钟 94 摄氏度的灭活步骤。

消化后冷藏裂解产物。使用分光光度计定量基因组 DNA。然后，使用分子生物学级水稀释基因组模板，使每个反应包含大约 20 至 30 ng 的样品。

冰上为每个样品添加 0.14 微升 KASP 引物混合物和 5 微升 KASP 预混液，放入 1.5 毫升微量离心管中并充分混合。然后，短暂离心以收集试管底部的内容物。将 5 微升引物预混液移液到适用于正在使用的实时 PCR 机的 96 孔光学 PCR 板的孔中。

然后，将 5 微升稀释的 DNA 模板样品移液到每个孔中，并用移液管吸出以混合。在板上放置光学透明薄膜密封，确保薄膜完全密封在每个孔上。以 600 x G 短暂离心板以收集底部的内容物并去除混合物中的气泡。

执行主要 KASP 反应后，查看分析计算机生成的结果散点图。将鉴定出的杂合子动物一起安置在主水系统上。动物从鳍夹中恢复后，设置成对交叉，使用分隔器确保胚胎同步。

收集胚胎，并将亲本对隔离在繁殖笼中。监测孤立的成鱼，以便将攻击性鱼分开或提供掩护。为了在第 5 天或第 6 天饲养胚胎，当鱼鳔在 75% 的离合器中充气时，使用玻璃移液器收集表型野生型动物。

将表型野生型放在苗圃中，记录哪些亲本产生了它们。根据文本方案麻醉未充气鱼鳔的幼虫后，使用宽口径玻璃巴斯德移液器将动物收集到 1.5 毫升微量离心管中。从每个试管中取出胚胎水，并用 1x PBS 中的一毫升 2% 多聚甲醛替换。

摇动管子一小时以固定动物。在此和所有后续摇摆步骤中定期跟踪管子，以确保没有幼虫卡在管子的侧面或结块在管子底部。使用玻璃移液管从试管中取出固定剂。

然后加入 1 毫升 50% 乙醇。再摇动样品 10 分钟。通过在每毫升 Alcian 预混料中加入 20 微升 0.5% 茜素红来制备新鲜的染色溶液。

取出 50% 乙醇，向每管中加入 1 毫升染色液。然后，摇动管子过夜。在根据文本方案漂白胚胎后的几天内，对渗透剂染色的突变后代进行评分。

在此示例中，我们对主题骨骼的任何出现进行评分。对于下一代，选择两个高渗透剂和两个低渗透剂系列。为每个父代对指定一个 sub stock 标识符，例如，family 4.01、02 等。

在所有标签上标明 或 inbred 世代编号也很有帮助。主系统上的家庭父母对与几条混合性别伴侣鱼。伴侣鱼可以是任何具有永久明显区别特征的斑马鱼线，例如色素沉着或鳍结构改变。

用来自突变兄弟姐妹的渗透剂标记含有来自选定家系的野生型兄弟姐妹幼虫的水箱，并像正常一样将鱼饲养到成年。通过后代测试进行选择性育种，应该在几代内产生整体渗透剂的向下和向上的变化。在这些例子中，应用于 mef2ca b1086 突变体，在致命的纯合突变体中，选择鳃盖和鳃尾鳍之间的主题骨的高或低渗透。

在成功的铸造过程中，计算机程序应识别与基因类型相对应的样品的类型分组，并且在执行足够的循环后，NTC 应位于小区原点附近。如此处所示，成功的阿尔新蓝、茜素红染色剂将具有不透明或微弱的鲜艳染色的骨骼和软骨元素。软骨元件的边界应清晰，并且可辨别单个逆生细胞。

太浓的阿尔新蓝无法从其他组织中分离出来，因此无法进行分析。从斑马鱼线维护中实施这项技术可能会在几代人中改变渗透剂。遵循此程序，其他方法（如 NC2 杂交和延时成像研究）可能会产生更一致的结果。

我们使用这种技术来探索表型变异的遗传性。看完这个视频后，你应该对如何选择性地培育突变菌株以改变外显率有一个很好的了解，即使突变是致命的。