Name: 丰度和收费水平的转移 Rna 在大肠杆菌中的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 学习在大肠杆菌中量化tRNA丰度和氨酰化水平的方法。该技术利用内参细胞实现不同生长状态下RNA水平的精确定量比较，为研究微生物RNA动态与蛋白质合成调控提供可靠工具。

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作者感谢 Marit Warrer 提供出色的技术支持。本工作由丹麦独立研究委员会 | 自然科学 [1323-00343B] 和丹麦国家研究基金会 [DNRF120] 资助。

1. 细菌培养物的制备。
<ol>
	<li>所有培养均在锥形瓶中进行，培养液体积与锥形瓶体积之比最多为1/6。在典型的实验设置中，将培养物在37.0 °C、160 rpm振荡条件下，于吗啉丙磺酸（MOPS）最低培养基中培养，并添加优选的碳源（例如0.2%葡萄糖），在收获RNA前至少连续培养10代18。</li>
	<li>在RNA提取前一天，将目标菌株的过夜培养物按一定比例稀释至MOPS最低培养基中，使其在次日预定时间达到目标OD436。接种所用过夜培养物体积可通过以下公式计算： 
	<img alt="公式1" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq1.jpg" /> 
	注意：此处，ODnew表示培养后期望的OD436值，Vnew表示稀释后培养物的体积，ODold表示被稀释的过夜培养物的OD436值，G表示从稀释时刻（t1）到次日所需时刻（t2）期间培养物生长的代数，其计算方式为：t1与t2之间的时间差（分钟）除以世代时间（分钟）。为确保取样时处于稳态生长，G应≥10；Vold表示需转移至新鲜培养基中的过夜培养物体积。该公式为近似计算，未考虑任何延滞期；而将过夜培养物稀释至新鲜培养基后常可观察到延滞期现象。
	<ol>
		<li>培养条件将根据实验目的有所不同，但为了限制细胞间tRNA水平的变异并提高结果的可重复性，建议在取样前使培养物达到稳态生长19。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 加标细胞的制备
注意：使用表达 selC 基因的大肠杆菌（E. coli）菌株 MAS1074 作为内参菌株，该基因在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导型启动子的控制下编码 tRNAselC。
<ol>
	<li>将MAS1074的过夜培养物用MOPS最低培养基稀释至OD436为0.05，培养基中添加100 µg/mL氨苄青霉素和0.2%葡萄糖。在37 °C、160 rpm振荡条件下培养该菌液。 
	注意：关于替代参考菌株的使用，请参见讨论部分。</li>
	<li>当OD436达到约0.1时，加入IPTG至终浓度为1 mM，以诱导tRNAselC的表达。继续培养菌液至OD436约为0.5（约生长3–4小时），然后将培养瓶转移至冰浴中。在所有用于RNA纯化的样品收获完毕前，始终保持加标细胞培养物处于冰上。</li>
</ol>
3. 实验样品的收获。
<ol>
	<li>将每个样品对应的带盖100 mL锥形瓶（或类似容器）中加入4 mL 10% (w/v) 三氯乙酸（TCA），并置于水浴中预热至37 °C。 
	注意：警告，TCA在加热时会分解，产生包括氯化氢和氯仿在内的有毒且具腐蚀性的气体。TCA水溶液为强酸，与碱剧烈反应，并对多种金属具有腐蚀性。使用该液体时应采取适当防护措施。</li>
	<li>在收集细胞前，立即测定并记录培养物的OD436值。</li>
	<li>为收集细胞，将4 mL培养物转移至含有预热TCA的锥形瓶中。</li>
	<li>用手轻轻旋转锥形瓶5秒以混匀样品。TCA的混合可立即终止所有酶活性，从而保持tRNA的氨酰化水平。 
	注意：若需收集多个样品，应将已收集的样品在冰上保存于TCA中，直至所有样品均收集完毕。</li>
</ol>
4. 添加加标细胞
注意：加标细胞的制备见步骤2。
<ol>
	<li>当完成所有用于 RNA 制备的样品收集后，向每个样品中加入 5% 的 spike-in 细胞（基于 OD 计算）。 
	注意：所需 spike-in 细胞培养物体积通过以下公式计算： 
	<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq2.jpg" /> 
	其中 Vspike 表示所需 spike-in 细胞培养物的体积，Vexp 表示收获的实验细胞培养物体积（不含 TCA），ODexp 表示实验细胞培养物在加入 TCA 时的 OD436，ODspike 表示 spike-in 细胞培养物的 OD436。若多个样品在不同 OD 下收获，则应根据上述公式为每个样品分别调整 spike-in 细胞的添加体积。</li>
	<li>为量化 spike-in 细胞对目标 RNA 种类的贡献，制备一个仅含 spike-in 细胞的样品：将 4 mL spike-in 细胞与 4 mL TCA 混合。该样品的 RNA 制备方法应与其他样品相同。</li>
	<li>可选：另取一个仅含实验样品而不含 spike-in 细胞的培养瓶，用于量化实验样品对 tRNAselC 水平的贡献；在 E. coli K-12 中，tRNAselC 的内源性水平极低。</li>
</ol>
5. RNA 的制备
注意：此处描述的 RNA 制备方案基本遵循 Varshney 等1 所述方法；为避免纯化过程中氨酰化 tRNA 发生脱酰基化，整个纯化过程必须始终保持样品处于酸性 pH 和 0 °C 条件下。使用洁净无菌的离心管或烧瓶盛装样品和溶液，并用超纯水（电阻率为 18.2 MΩ·cm）配制所有溶液。
<ol>
	<li>将每种样品各 8 mL 倒入预冷的离心管中，在 4 °C 条件下以 9,500 × g 离心 10 分钟。彻底去除上清液，并将沉淀重悬于 0.3 mL 冷的 0.3 M 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 10 mM EDTA 中。</li>
	<li>将每份样品转移至预冷的 1.5 mL 微量离心管中，加入 0.3 mL 用相同缓冲液平衡过的苯酚。 
	注意：注意，苯酚会产生有毒气体，且对皮肤具有强腐蚀性。</li>
	<li>每份样品涡旋混合 10 次，每次 15 秒，每次之间至少间隔 1 分钟。在两次涡旋之间将样品保持在 0 °C。利用频繁的暂停检查以确保样品始终保持低温。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 15 分钟。将水相（上层）转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。加入 0.3 mL 冷苯酚，按前述方法涡旋混合 4 次，每次 15 秒。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。将水相转移至新的、预冷的 1.5 mL 微量离心管中，管中预先加入 2.5 倍体积的 96% 乙醇（约 750 µL）。通过在 -20 °C 孵育 1 小时或在 -80 °C 过夜，使 RNA 沉淀析出。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 30 分钟。弃去上清液，小心加入 1 mL 冷的 70% 乙醇，避免扰动 RNA 沉淀。轻轻倒置一次，使乙醇清洗管壁内部。 
	注意：此步骤中沉淀可能难以观察。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 × g 离心 10 分钟。彻底去除上清液，将沉淀在空气中干燥至乙醇完全挥发。通过剧烈涡旋将沉淀重悬于 20 µL 冷的 10 mM 醋酸钠缓冲液（pH 4.5）和 1 mM EDTA 中。 
	注意：切勿过度干燥沉淀，否则将难以重悬。</li>
	<li>可选：通过测量 260 nm 处的吸光度评估 RNA 浓度。</li>
	<li>可选：通过琼脂糖凝胶电泳评估纯化 RNA 的质量20。</li>
	<li>将样品在 -80 °C 保存。 
	注意：本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
6. 化学去酰化对照样品的制备
注意：为了在Northern印迹上区分氨基酰化tRNA与去酰化tRNA的条带，可通过碱性处理制备化学去酰化的等分试样。对于大多数实验目的，每张Northern印迹准备一个去酰化样品即可。
<ol>
	<li>将RNA样品置于冰上解冻。取4 µL RNA样品加入新离心管中，加入46 µL Tris-HCl（pH 9.0），在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>加入15 µL 0.3 M乙酸钠（pH 4.5），随后加入125 µL 96%乙醇。在-20 °C沉淀RNA 1小时。</li>
	<li>在4 °C下以20,000 × g离心30分钟。彻底去除上清液，将沉淀重悬于4 µL预冷的含10 mM乙酸钠（pH 4.5）和1 mM EDTA的溶液中。 
	注意：若将样品保存于-80 °C，本步骤可暂停。</li>
</ol>
7. 凝胶电泳和Northern印迹
<ol>
	<li>将4 µL样品（未经处理或化学去酰基化处理）与6 µL上样缓冲液（0.1 M 醋酸钠（pH 5.0）、8 M 尿素、0.05% 溴酚蓝和0.05% 二甲苯氰醇）混合。 
	注意：请务必包括仅含外源添加细胞的样品、化学去酰基化处理的样品（以及未添加外源细胞的样品，如已制备）。</li>
	<li>将样品上样至厚度为0.4 mm、含8 M尿素的6.5%聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺:双丙烯酰胺 = 19:1），电泳缓冲液为0.1 M醋酸钠缓冲液（pH 5.0）。使用60 cm长的凝胶以实现tRNA种类的良好分离。</li>
	<li>在4 °C条件下，以10 V/cm的电压进行RNA电泳，直至溴酚蓝迁移至凝胶底部（约20小时）。</li>
	<li>用于转膜的区域为从二甲苯氰醇染料位置向下20 cm至溴酚蓝染料之间的区域（两种染料之间的距离应为25–30 cm）。小心分离两块玻璃板，使凝胶保留在其中一块上。将一片滤纸裁剪至所需转膜区域的大小，并覆盖在凝胶用于转膜的部分上方。将未被滤纸覆盖的凝胶部分切除并丢弃。&#160; 利用滤纸小心地将凝胶片段从玻璃板上揭下。 
	注意：大尺寸凝胶非常脆弱，请小心操作。</li>
	<li>将一张带正电荷的尼龙膜（例如Hybond N+膜）覆盖在凝胶上，使用40 mM Tris-醋酸（pH 8.1）、2 mM EDTA作为转移缓冲液，在20 V电压下电转90分钟。</li>
	<li>使用紫外光（0.12 J/cm2）将RNA交联固定于膜上。 
	注意：此时膜可在室温下保存，本实验方案可在此处暂停。</li>
</ol>
8. 探针的设计与验证
注意：Northern 印迹探针的精心设计与验证对于获得可靠结果并避免与其他 RNA 分子发生非特异性杂交至关重要。
<ol>
	<li>使用短的合成寡核苷酸作为探针。设计探针序列时，应使其与目标 tRNA 序列中最独特的区域互补——这通常是反密码子环。 
	注意：可在基因组 tRNA 数据库（Genomic tRNA Database, GtRNAdb）21 中找到多种生物预测的 tRNA 序列列表。</li>
	<li>调整序列长度，使其预测的熔解温度在 55–65 °C 之间。</li>
	<li>将选定的序列针对实验所用细菌菌株的基因组序列进行 BLAST（基本局部比对搜索工具）比对，以验证该序列对目标 tRNA 具有特异性，具体方法见文献22。 
	注意：表 1 列出了针对 E. coli K12 多种不同 tRNA 的建议探针序列。若探针对目标 tRNA 具有特异性，则 Northern 印迹中仅可见两条条带（带电荷与不带电荷的 tRNA），而去酰化样品泳道中仅可见一条条带（不带电荷的 tRNA）。若出现两条以上条带，或需进一步验证探针特异性，请参见讨论部分。</li>
</ol>
9. Northern 印迹杂交
注意：在以下步骤中，将依次使用与目标特定 tRNA 互补的探针杂交膜，包括一个针对参考 tRNAselC 的特异性探针。
<ol>
	<li>将膜放入杂交管中，加入6 mL杂交溶液（0.9 M NaCl，0.05 M NaH2PO4（pH 7.7），5 mM EDTA，0.5% (w/v) SDS，100 mg/mL剪切并变性的鲱鱼精子DNA，以及5x Denhardt's溶液（100x Denhardt's溶液=2%牛血清白蛋白，2%聚乙烯吡咯烷酮40，以及2% Ficoll））。</li>
	<li>在42 °C下旋转孵育1小时进行预杂交。加入30 pmol用32P标记的5'端放射性寡核苷酸探针（制备方法参见Sambrook et al.23）。
	 
	注意：警告，32P释放的高能β射线可能对皮肤和眼睛造成显著辐射危害。使用32P时应采取适当防护措施。放射性废物应按照相关机构的安全规程进行处理。</li>
	<li>将探针与膜在42 °C下旋转孵育过夜。使用一次性10 mL移液器移除探针。
	 
	注意：若将探针储存于冷冻条件下，可重复使用。</li>
	<li>在杂交管中，用50 mL室温的0.3 M NaCl、30 mM柠檬酸钠、0.1% (w/v) SDS溶液短暂清洗膜。
	 
	注意：第一次洗涤液中含有大量未结合的探针，必须按高放射性物质处理。</li>
	<li>重复步骤9.4一次，然后将膜转移至带盖的平底塑料容器或托盘中。用洗涤液（0.3 M NaCl，30 mM柠檬酸钠，0.1% (w/v) SDS）覆盖膜，并在室温下孵育30分钟。</li>
	<li>更换洗涤液，并持续洗涤直至获得满意的信噪比（通常需更换洗涤液3–4次）。使用盖革-米勒计数管检测膜上无信号区域的放射性，与探针特异性结合tRNA的区域进行比较，以评估信噪比的变化。</li>
	<li>为确保在曝光后能够从膜上剥离探针，请务必（重要）在剥离前防止膜干燥。将膜放入薄塑料袋中，或用保鲜膜紧密包裹，并用胶带密封或热封使其密闭。将密封后的膜置于磷屏成像屏上。
	 
	注意：磷屏成像屏所需的曝光时间取决于探针的比活性、所检测RNA的量以及探针的杂交效率，可能差异很大，从几分钟到数天不等。根据经验，通过盖革-米勒计数管检测膜上辐射强度可较好地估计所需曝光时间。为实现可靠定量，应避免屏幕过度曝光。</li>
	<li>使用激光扫描仪扫描磷屏成像屏，并将文件保存为“.gel”格式。
	 
	注意：可靠的定量需要较高的信噪比。检测tRNA时应出现两条带：一条为氨基酰化tRNA（迁移较慢），另一条为去酰化tRNA（迁移较快）。参见图2。</li>
</ol>
10. 膜的剥离
注意：在对另一条 tRNA 进行探针杂交之前，必须通过剥离膜以去除先前的探针。
<ol>
	<li>加入足量的洗脱缓冲液（15 mM NaCl，1.5 mM 柠檬酸钠，0.1% (w/v) SDS），以覆盖膜，将缓冲液倒在膜上。室温孵育 15 分钟。</li>
	<li>重复步骤 10.1，直至使用盖革-米勒计数管无法检测到放射性信号；此时膜可按照第 9 节所述步骤重新杂交。</li>
</ol>
11. tRNA 及其荷载水平的定量分析
<ol>
	<li>将.gel文件载入成像软件中（参见 材料清单）。沿每个样品泳道绘制一条垂直线，使其横跨泳道的大部分宽度，但排除条带边缘信号可能不均匀的区域，如图所示 图3A.</li>
	<li>通过单击可视化各泳道的计数结果 &#34;分析&#34; -&#62; &#34;创建图表&#34;手动定义每道中代表带电荷tRNA和无电荷tRNA的两个峰，如图所示 图3B.</li>
	<li>单击以获取每个峰的计数值 &#34;分析&#34; -&#62; &#34;面积报告&#34;，记录两个峰各自的峰面积。</li>
	<li>当印迹已完成tRNA的探针杂交后selC 以及至少一种目标tRNA，将目标tRNA的水平归一化至tRNAselC.
	<ol>
		<li>计算每个泳道中来自加标细胞的 tRNA 比例，并使用以下公式从该泳道的总信号中减去： 
		<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56212/56212eq3.jpg" /> 
		注意：此处， 样本tRNA = 膜上单个泳道检测目标 tRNA 所获得的信号； 样本selC = 使用相同膜上相同泳道检测tRNA所获得的信号selC; 参考文献tRNA = 同一膜上仅含有加标细胞RNA的泳道在检测目标tRNA时获得的信号； 参考文献selC = 同一膜上仅含有 spike-in 细胞 RNA 的泳道在检测 tRNA 时获得的信号selC.</li>
		<li>为进行归一化，将每条泳道校正后的tRNA值除以tRNAselC 同一泳道的信号。 
		注意：对tRNA的贡献selC 采样细胞的信号可忽略不计（参见 图2，泳道标记为 &#34;-selC&#34;).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将代表荷载tRNA的峰信号强度除以两个峰（荷载 + 未荷载）信号强度的总和，计算每条泳道的tRNA荷载水平。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了如何同时测定特定 E. coli tRNA 的荷载水平，并比较不同样品中这些 tRNA 的相对含量。本方案的关键点包括：1）以保持细胞内 tRNA 荷载水平的方式处理样品；2）对 tRNA 量进行归一化处理，以确保不同样品间 tRNA 相对水平的可靠比较；3）确保所选探针对目标 tRNA 的特异性。以下将分别阐述这些要点。
tRNA 纯化
E. coli 的 tRNA 通过一种温和的方法进行纯化，该方法经过优化，可保留其细胞内的荷载水平。根据我们的经验，该方案主要提取长度短于 150 nt 的 RNA，因此 tRNA 在纯化的 RNA 中占较大比例。正因如此，不建议使用本方案纯化 E. coli 的总 RNA。本文所述方案也适用于其他 RNA（如小 RNA（sRNA））的检测与定量，无需进一步修改。由于该 RNA 提取方案富集短 RNA 序列，即使待研究的 sRNA 表达水平较低，该方法仍可有效应用。
通过外源添加细胞...

下文介绍一种通过Northern印迹法定量特定tRNA并测定其荷载水平的方法。该方法基于Varshney et al.1 首次建立的技术。通过将细胞收集至三氯乙酸（TCA）中，并在整个RNA纯化过程中将样品保持在0 °C，可保留tRNA与氨基酸之间的酯键2,3,4。由于共价结合的氨基酸导致迁移速率降低，氨基酰化tRNA在凝胶电泳和Northern印迹中可与其非酰化形式区分开来5。此外，我们还提供了一种通过添加过表达稀有tRNAselC 的外源对照细胞来标准化tRNA定量的实验方案4。
tRNA 是细菌细胞中含量最丰富的分子之一，也是翻译机制中至关重要的组成部分。tRNA 能够结合氨基酸，并将其转运至正在翻译的核糖体上。氨基酸与 tRNA 的结合（即氨酰化或荷载）由氨酰-tRNA 合成酶催化完成。不同荷载 tRNA 的相对丰度对于确保蛋白质合成的保真度至关重要，因为当某一信使 RNA（mRNA）密码子对应的同源荷载 tRNA 表达不足时，近同源 tRNA 错误地将其氨基酸递送至核糖体上正在延伸的多肽链的可能性就会增加6。荷载 tRNA 的重要性还体现在大肠杆菌（E. coli）细胞对 tRNA 荷载水平严重下降所引发的广泛应答——即严谨反应。在严谨反应过程中，细胞会降低 tRNA、核糖体 RNA 以及大多数 mRNA 的合成，转而优先转录与氨基酸生物合成和应激生存相关的特定 mRNA，同时细胞生长速率显著下降7。此外，我们及他人的近期研究表明，当存在限制翻译的应激条件时，E. coli 会主动降解其大部分 tRNA4,8，这提示调控 tRNA 水平可能在应对此类应激中发挥重要作用。因此，对 tRNA 丰度及其荷载水平进行可靠测定，将成为全面理解细菌应激反应的重要工具。
E.coli 常被用于表达重组蛋白，但由于不同物种间密码子使用存在差异，常会出现表达水平不理想的问题9。通过额外表达翻译重组mRNA所需的tRNA，可克服这一问题10。对这些菌株中tRNA荷载水平的测定，可为故障排查提供指导，并有助于优化蛋白表达。
该方法还可用于检测&#34;错充电&#34;，即被非对应氨基酸氨酰化的tRNA分子。不同氨基酸的氨酰化可能导致tRNA在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率略有差异1,11。在某些情况下，该方法还可用于区分其他方面相同但修饰模式不同的tRNA3。
另一种用于研究tRNA荷载水平的成熟生化方法是过碘酸氧化法。该方法基于以下观察结果：氨基酰化tRNA可免受过碘酸氧化，而非荷载状态的tRNA则不能。经过过碘酸氧化处理后，通过测定tRNA的再荷载情况来估算所提取RNA的荷载水平。然而，已有研究表明该处理过程会影响多种tRNA的再荷载，从而导致一定误差12。本文所介绍的方法可直接从纯化的RNA中测量荷载水平，从而避免了化学或酶促反应可能引入的偏差。该方法的一个局限性在于每次只能检测一种tRNA，因此尽管同一张Northern印迹膜可以经剥离后重新杂交检测多种tRNA，但要获取多种tRNA的数据仍较为耗时且操作繁琐。
一种可靠的样本间归一化方法在旨在比较不同样本中某分子相对含量的研究中至关重要。本文介绍一种针对RNA的归一化方法，其中取少量等分试样 E. coli 过表达稀有tRNA的细胞selC 在RNA纯化之前，将 spike-in 加入所有实验样品中。该方法不仅在检测tRNA时有用，而且在实验设计中无法确保所有样品内源性RNA的细胞浓度一致时，可用于任何RNA种类的相对定量。例如，某种RNA的水平 &#34;管家基因&#34; 核糖体RNA（rRNA）常作为内源性参照，用于比较不同样本间另一种RNA的相对含量13但如果参考RNA的细胞浓度在不同样本间存在差异，则这种方法用处不大；例如在应激反应期间采样时，核糖体RNA就可能出现这种情况。15,16,17 或进入稳定期时17在RNA纯化前向实验样品中加入外源 spike-in 细胞，可提供一种独立于取样设置的可靠且准确的标准化方法。另一种标准化方法是在RNA纯化后向实验样品中加入一种或多种外源 spike-in RNA。然而，该方法无法校正样品间RNA回收效率的差异。
使用 E. coli 过表达参考RNA的细胞作为加标细胞（参见 图1在一项实验中 E. coli 其缺点是会导致添加少量外源性物质 E. coli 向样品中加入总RNA。我们通过平行分析仅含spike-in细胞的样品来校正此添加量（参见Northern印迹） 图2, 标记的泳道 &#34;selC&#34;）。本方案是为 E. coli K-12，但可能适用于大多数细菌种类。

<table><tbody><tr><td>尿素</td><td>Merck</td><td>57-13-6</td><td>纯度 &gt;99%</td></tr><tr><td>聚丙烯酰胺</td><td>Serva</td><td>79-06-7</td><td></td></tr><tr><td>双丙烯酰胺（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺）</td><td>BIO-RAD</td><td>161-0201</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸（TCA）</td><td>Sigma</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>Merck</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鲱鱼精子DNA</td><td>Sigma</td><td>100403-24-5</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P32 &amp;gamma;ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA寡核苷酸（探针）</td><td>TAG Copenhagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybond N&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;膜</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>交联剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电转印仪</td><td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 扫描仪</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>杂交炉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖革-&amp;uuml;勒计数管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷屏成像仪屏幕</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>杂交管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml 离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

escherichia coli中转运rna丰度及其荷载水平的定量分析

Quantification of the Abundance and Charging Levels of Transfer RNAs in Escherichia coli

转运RNA（tRNA）是任何生物体中翻译机制的重要组成部分。tRNA能够结合并将氨基酸转运至正在翻译的核糖体。不同tRNA的相对含量，以及氨基酰化tRNA占总tRNA的比例（称为充电水平），是决定翻译准确性和速度的重要因素。因此，在研究蛋白质合成时（例如在各种应激条件下），tRNA的丰度和充电水平是需要测量的重要变量。本文介绍一种从大肠杆菌（Escherichia coli）中提取tRNA并直接测定特定tRNA种类相对丰度和绝对充电水平的方法。tRNA的提取方式可保持tRNA与其氨基酸之间的不稳定化学键。随后对RNA进行凝胶电泳和Northern印迹，从而实现带电荷与不带电荷tRNA的分离。通过加入内参细胞进行归一化，可比较不同样品中特定tRNA的水平。在RNA纯化前，我们在每个样品中加入5%过表达稀有tRNAselC的大肠杆菌（E. coli）细胞。然后将样品中目标tRNA种类的量归一化为同一样品中tRNAselC的量。在RNA纯化前加入内参细胞，相较于加入纯化的内参RNA，其优势在于还能校正不同样品间细胞裂解效率的差异。

使用此处所述方法，测定了三种tRNA的丰度和荷载水平 E. coli 氨基酸饥饿前后K-12的反应。
不能精氨酸营养缺陷型菌株NF9154 (thr leu his argH thi mtl supE44 在补充有0.4%甘油的MOPS最小培养基中培养至少十个世代， 50 &#181;g/mL 苏氨酸、亮氨酸、精氨酸和 5 &#181;g/mL 组氨酸在 37 &#176;C 以160 rpm振荡。通过过滤培养物并将其重悬于不含精氨酸的新鲜MOPS培养基中（方法同上）来诱导精氨酸饥饿。在精氨酸饥饿期间，蛋白质合成显著降低，但通过现有蛋白质降解所释放的精氨酸仍维持较低水平的蛋白质合成。样品在所示时间点收集。 图4在所有样品收获至TCA中后，加入过表达tRNA的MAS1074 spike-in细胞，占总量的5%<s...

本文介绍了一种直接测定纯化的大肠杆菌（Escherichia coli）RNA中转运RNA（tRNA）氨酰化水平的方法，以及一种通过添加表达参考基因的内参细胞，来比较不同样本间转运RNA或其他任何短链RNA相对含量的方法。

Escherichia coli中转运RNA丰度及其荷载水平的定量分析

转运RNA（tRNA）是任何生物体中翻译机制的重要组成部分。tRNA结合并将氨基酸转运至正在翻译的核糖体。

本实验的总体目标是对大肠杆菌中转运RNA（tRNA）的丰度及其荷载水平进行定量分析。该方法有助于解答细胞生物学领域的一些关键问题，例如tRNA荷载水平在不同生长状态下如何变化。该方法的主要优势在于，即使在显著改变细胞内RNA组成的不同生长状态下，也能够对RNA水平进行定量比较。按照文本方案，通过培养实验用和内参E.coli菌株来开始本实验。将内参菌株在37摄氏度、160 RPM振荡条件下培养。当内参菌株的OD436达到约0.1时，加入IPTG以诱导tRNA细胞C的表达。将培养物培养至 OD436 约为 0.5。然后将培养物置于冰上，直至所有样品均完成收集。随后，在 37 摄氏度水浴中预热一个 100 毫升带盖培养瓶，每份样品加入 4 毫升 10% 三氯乙酸（TCA）。在收获细胞前，直接测量并记录实验培养物在436 nm处的光密度（OD436）。随后，将四毫升培养物转移至预先温热的含三氯乙酸（TCA）的烧瓶中。用手轻轻旋转烧瓶混合样品，持续五秒钟，以立即终止所有酶活性，从而保持tRNA的氨酰化水平。所有样品收集完毕后，向每个样品中加入5%的内参细胞。同时，按照文本方案中的描述，制备仅包含内参细胞的对照样品。开始RNA提取时，将每个样品（包括对照）各取八毫升倒入预冷的离心管中。将样品在 4 °C 条件下以 9,500 × g 离心 10 分钟。完全去除上清液后，将沉淀物重悬于 0.3 毫升含 10 毫摩尔/升 EDTA 的冷乙酸钠溶液中。将每个样品转移至预冷的 1.5 毫升微量离心管中，并加入 0.3 毫升用以重悬沉淀物的缓冲液平衡过的苯酚。然后，每份样品涡旋振荡10次，每次15秒。每次涡旋之间至少间隔1分钟，置于0 °C以保持样品低温。接着，在4 °C条件下以20,000 × g离心15分钟。将上层水相转移至新的1.5毫升微量离心管中。向水相中加入0.3毫升冷酚，按照之前所述方法，涡旋振荡样品四次，每次15秒。然后，在4摄氏度下以20,000 × g离心10分钟。将水相转移至新的预冷的1.5毫升微量离心管中，加入2.5倍体积的预冷96%乙醇。然后在-20摄氏度孵育管子1小时，以沉淀RNA。在4摄氏度、20,000 × g条件下离心样品30分钟。去除上清液后，小心向RNA沉淀中加入1毫升冰冷的70%乙醇，注意不要扰动沉淀。轻轻倒置离心管一次，以乙醇洗涤沉淀。最后，在4 °C条件下，于20,000 × g离心10分钟。完全去除上清液，将沉淀物在空气中干燥，直至乙醇完全挥发。加入20 µL含1 mM EDTA的冷乙酸钠溶液，剧烈涡旋振荡以重新悬浮沉淀物。开始电泳前，将每个样品4 µL与6 µL上样缓冲液混合。将包括对照在内的样品上样至含有8摩尔尿素和0.1摩尔醋酸钠缓冲液的0.4毫米厚6.5%聚丙烯酰胺凝胶中。然后在4摄氏度下以每厘米凝胶10伏的电压进行电泳，运行约20小时，直至溴酚蓝染料迁移至凝胶底部。小心分开两块玻璃板，使凝胶保留在其中一块玻璃板上。使用溴酚蓝染料方向距二甲苯青染料区域向下20厘米范围内的凝胶区域进行印迹。将一片滤纸剪裁成所需印迹区域的大小，放置在凝胶用于印迹部分的上方。剪去并丢弃未被滤纸覆盖的凝胶部分。然后用滤纸小心地将凝胶从玻璃板上提起。将一张带正电荷的尼龙膜置于凝胶上方，并在转移缓冲液中以20伏电压电转移90分钟。最后，使用紫外光将RNA交联至膜上。接着，将交联后的膜放入杂交管中，并加入6毫升杂交液。在42°C下旋转孵育1小时，以预杂交膜。然后，加入30 pmol具有放射活性的寡核苷酸DNA探针，该探针在5'端用P32标记。将膜与探针在42°C下旋转孵育过夜。孵育结束后，使用一次性10 mL移液器移除探针。接下来，在杂交管中用15毫升洗涤液于室温下快速洗涤膜两次。将膜转移至一个平底塑料容器中，加入洗涤液覆盖膜，并盖上盖子。在室温下于摇床上孵育30分钟。更换溶液并继续洗涤，直至达到理想的信噪比。使用盖革-米勒计数管，通过比较探针与tRNA杂交区域的放射信号与空白区域的放射信号，来确定信噪比。随后，将膜紧密包裹在塑料膜中，并通过热封确保其完全密封。将此膜置于磷屏成像仪的成像屏上。在适当的曝光时间后，使用激光扫描仪扫描成像屏，并以凝胶格式保存文件。接着，将凝胶文件载入成像软件中。沿每个样品泳道绘制一条垂直线，使其横跨泳道的大部分宽度，同时避开条带边缘信号可能不均匀的区域。为显示每个泳道的计数，点击分析（analysis），然后创建图表（create graph）。手动定义每个泳道中代表带电荷和无电荷tRNA的两个峰。然后，点击分析，再选择面积报告，以获取每个峰的计数值。最后，记录两个峰各自的峰下面积。按照文本方案中所述方法计算 tRNA 水平。该方法用于检测精氨酸饥饿前后各种tRNA和大肠杆菌nf915的丰度。在用不同tRNA探针杂交的Northern印迹图中，代表带电tRNA的条带与代表无电荷tRNA的条带之间有明显分离。通过成像软件从Northern印迹图中获得每条泳道的放射性信号分布图谱。通过从印迹中分离每条泳道，对每条泳道的放射信号进行定量。代表单条泳道信号定量结果的图显示了两个峰：左侧峰来自氨酰化tRNA，右侧峰来自去氨酰化tRNA。每个峰下的面积被导出以进行进一步分析。Northern 印迹中条带的定量结果显示，在氨基酸饥饿期间，所有检测的 tRNA 种类的相对丰度均迅速且显著下降。另一方面，接受精氨酸的 tRNA 其 tRNA 充电水平在去除精氨酸后迅速下降，随后在饥饿期间略有回升。然而，其他tRNA的荷载水平在饥饿初期略有升高，随后下降至接近饥饿前的水平。观看本视频后，您应能够充分理解如何纯化RNA，以便定量检测tRNA的荷载状态和丰度，以及如何使用加标细胞进行归一化处理。在整个操作过程中，重要的是始终注意保持RNA处于低温和酸性环境中，以防止RNA发生水解。

quantification-abundance-charging-levels-transfer-rnas-escherichia

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

丰度和收费水平的转移 Rna 在大肠杆菌中的量化

我们描述了一种微阵列分析方法，用于测定酿酒酵母（S.

利用微阵列技术对tRNA的氨酰化（荷载）水平进行全基因组分析

来源： Stenum, T. S., 等 转运RNA丰度及其氨酰化水平的定量分析 大肠杆菌. 视频实验杂志 (2017)本视频演示了如何通过分离氨酰化和去氨酰化的tRNA形式，利用凝胶电泳和RNA印迹技术来检测和比较大肠杆菌（E.

凝胶电泳与RNA印迹法检测tRNA充电水平 大肠杆菌

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

在此，利用转座子介导的非编码DNA元件随机插入，确定了其在染色体上的最佳位置。...

利用一种新型转座子介导的方法确定 Escherichia coli 中 DNA 元件的最佳染色体位置

本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E.

单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

本方法通过一种简单的活体报告基因检测法，在细菌细胞中定量分析RNA结合蛋白（RBPs）与其同源及非同源结合位点的结合亲和力。该检测基于报告基因的表达抑制作用。...

一种用于定量细菌中蛋白质-RNA 结合的检测方法

本方案描述了单分子荧光原位杂交（smFISH）技术的一种应用，用于测量体内mRNA合成与降解的动力学过程。...

在 Escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mRNA 的时空动力学

MAPS 技术已开发用于在体内深入分析特定调控 RNA 的靶标组。感兴趣的 sRNA 被标记上 MS2 适体，从而实现其 RNA 相互作用伙伴的共纯化，并通过 RNA...

MS2亲和纯化联合RNA测序在革兰氏阳性菌中的应用

绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）是一种用于量化生物混合物中所有小RNA分布的技术。本文展示了AQRNA-seq的文库构建和数据处理步骤，用于量化在饥饿诱导的休眠期间Mycobacterium bovis...

AQRNA-seq用于小RNA定量

本实验方案描述了在非炎症条件下使小鼠定植 pks+ Escherichia coli 所需的步骤，以及验证定植效果和评估粪便中 pks+ E. coli...

在非炎症条件下小鼠pks+ Escherichia coli的定植

学习在大肠杆菌中量化tRNA丰度和氨酰化水平的方法。该技术利用内参细胞实现不同生长状态下RNA水平的精确定量比较，为研究微生物RNA动态与蛋白质合成调控提供可靠工具。

Escherichia coli中转运RNA丰度及其荷载水平的定量分析

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