Name: 激光 Microirradiation 研究体内细胞对简单复杂 DNA 损伤的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 了解激光显微照射技术用于诱导DNA单链断裂和复杂损伤，研究细胞内DNA损伤信号传导与修复因子组装机制。该方法支持实时高分辨率单细胞分析，揭示细胞对DNA损伤的识别与处理过程。

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我们感谢日本东北大学的Akira Yasui博士提供GFP-NTH1表达质粒，以及美国加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所的Eros Lazzerini Denchi博士提供TRF2-YFP和EGFP-53BP11220-1711表达质粒。本研究由美国空军科学研究办公室（FA9550-04-1-0101）和贝克曼激光研究所基金会（资助M.W.B.）、美国国家科学院福特基金会博士后奖学金（资助B.A.S.）、美国国家科学基金会MCB-1615701项目及加州再生医学研究所CRCC CRR-17-426665项目（资助K.Y.）提供支持。

1. 基本细胞制备
注意：此步骤适用于内源性蛋白招募或修饰的标准免疫荧光检测，以及稳定表达荧光标记重组蛋白的细胞系。例如， Potorustridactylus 稳定表达EGFP-53BP1的(PtK2)袋鼠肾上皮细胞1220-1711 或 TRF2-YFP 已在我们之前的研究中使用（图1)32在前一种情况下，将包含寡聚化结构域、Tudor结构域和泛素化依赖性招募（UDR）基序的53BP1焦点形成区域（氨基酸1220-1711）与增强型绿色荧光蛋白融合（EGFP-53BP1）1220-1711该融合蛋白能够重现全长53BP1在损伤位点的招募过程53,54,55在HeLa细胞中，用荧光标记的黏连蛋白亚基（例如，hSMC1-GFP51，GFP-Scc1 (Rad21)52，以及 GFP-SA2 51必须稳定表达，以确保高效整合到复合物中，并重现内源性黏连蛋白在S/G2细胞周期阶段特异性损伤位点的招募。51.
<ol>
	<li>将任何贴壁细胞类型接种到带有网格盖玻片的35 mm组织培养皿中，以便对单个细胞进行识别。根据特定细胞系的增殖速率，调整初始细胞数量，使其在36–48小时内达到60%的融合度。例如：
	<ol>
		<li>对于PtK2有袋类肾上皮细胞（野生型或稳定表达EGFP-53BP11220-1711或TRF2-YFP的细胞）：在2 mL添加了2 mM L-谷氨酰胺、4%胎牛血清（FBS）以及抗生素（100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）的高级最低必需培养基（MEM）中接种2.0 × 104个细胞，并在37 °C、7% CO2条件下培养。</li>
		<li>对于稳定表达荧光标记重组蛋白GFP-SA2的HeLa细胞：在2 mL添加了10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中接种1.0 × 105个细胞，并在37 °C、5% CO2条件下培养。也可使用其他类型的HeLa细胞，包括未修饰细胞或表达hSMC1-GFP的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>让细胞贴壁并增殖36–48小时，至30–60%融合度时进行DNA损伤诱导（以便观察网格编号）。继续进行第4节操作。</li>
</ol>
2. 瞬时转染
注意：有时可能无法获得可检测内源性蛋白的优质抗体。如果无法获得稳定表达标记蛋白的细胞系，可通过瞬时转染来标记荧光蛋白，以用于活细胞分析。
<ol>
	<li>对于HeLa细胞，第1天，接种6-8 x 104 24孔板中每孔加入0.5 mL培养基的细胞，在37 °C、5% CO₂、100%湿度的培养箱中孵育2参见步骤1.1中的培养基培养条件。</li>
	<li>第2天，使用编码荧光标记DNA修复因子的哺乳动物表达质粒（例如，用于碱基损伤的GFP-NTH1或GFP-OGG132,44,56，高剂量DSB下的GFP-Ku57GFP-53BP132 对于相对简单的双链断裂（DSBs）或其他与荧光标签融合的目的蛋白，可进行脂质体介导的DNA转染。在1.5 mL离心管中，将0.3 µg质粒DNA溶于25 µL无血清培养基中。</li>
	<li>在另一个1.5 mL离心管中，将1 µL基于脂质体的DNA转染试剂加入25 µL无血清培养基中，轻轻混匀。</li>
	<li>轻轻混合稀释的DNA和转染试剂，在室温（RT）孵育10分钟，以形成DNA-脂质复合物。</li>
	<li>用0.5 mL培养基洗涤细胞一次，弃去培养基，然后向细胞中加入0.5 mL新鲜培养基（同步骤1.1）。</li>
	<li>将DNA-脂质复合物加入细胞中，轻轻晃动培养板数次以混匀。将细胞放回培养箱中，步骤同2.1。</li>
	<li>4–6 小时后，移除细胞的培养基，加入 300 µL 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。吸除液体，再加入 200 µL 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C 培养箱中孵育 3–4 分钟。</li>
	<li>在确认细胞已脱落之后，加入800 µL培养基，轻轻吹打重悬细胞以分散细胞团块。将细胞悬液转移至含网格盖玻片的35 mm培养皿中，并添加培养基至终体积2 mL。</li>
	<li>在培养箱中按照步骤2.1所述孵育细胞48小时，然后进入第4节。 
	注意：如果重组蛋白的表达具有毒性（转染细胞在步骤2.8孵育后呈现圆形或不规则形态），应缩短表达时间，并在转染后16–20 h进行激光微辐照（第4节），只要能够确认蛋白表达即可（荧光检测参见步骤4.3）。在此情况下，直接在35 mm培养皿中进行转染。接种3.0 × 10⁵个细胞。5 在35 mm培养皿中接种HeLa细胞，使用带网格的盖玻片，使细胞在30小时后达到约50-70%的融合度。转染DNA质粒，并在转染后2-6小时更换培养基。若蛋白表达水平合理且细胞状态良好，则在转染后12-20小时进行激光微照射。</li>
</ol>
3. 细胞周期同步化
注意：对于同源重组修复（HR）蛋白（如 Rad51 和黏连蛋白），其招募在细胞周期的 S/G2 期更为显著，因为同源重组修复发生于该时期51。因此，为监测这些蛋白的招募，有必要将细胞同步化至 S/G2 期。
<ol>
	<li>S/G2期同步化
	<ol>
		<li>采用双胸腺嘧啶阻断法对细胞进行S/G2期同步化50,51。将细胞接种于35 mm带网格盖玻片培养皿中（见步骤1.1），在培养基（同步骤1.1）中加入胸腺嘧啶，使其终浓度为2.5 mM，在37 °C、5% CO2条件下孵育17 h。</li>
		<li>用1 mL不含胸腺嘧啶的培养基（同步骤1.1）清洗细胞两次，然后在2 mL不含胸腺嘧啶的培养基中孵育9 h（同步骤1.1）。</li>
		<li>将200 µL浓度为27.5 mM的胸腺嘧啶储备液（溶于培养基中）加入含细胞的培养基中，使胸腺嘧啶终浓度为2.5 mM。按步骤3.1.1条件继续孵育15 h。随后清洗细胞，并在不含胸腺嘧啶的培养基中孵育4–6 h，然后诱导DNA损伤（第4节）。</li>
		<li>通过细胞周期标志物（Cyclin A2和B1分别代表S/G2期和G2期）、S/G2期特异性的DNA损伤修复因子（e.g.，Rad51或cohesin），或IdU/EdU掺入实验（用于标记S期细胞）来确认同步化效率51。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>G1期同步化
	<ol>
		<li>在带有网格盖玻片的35 mm培养皿中接种6–8 × 104个HeLa细胞（步骤2.1）。</li>
		<li>两天后，在倒置显微镜下使用10X物镜和10X目镜识别处于中期的细胞（细胞略微隆起且呈圆形）。拍摄图像以记录中期细胞在网格盖玻片上的位置。</li>
		<li>3–4 h后，确认细胞已分裂为两个子细胞（处于G1期），然后诱导DNA损伤（第4节）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 激光输入功率的滴定
注意：在本实验方案中，我们使用连接共聚焦显微镜的780 nm脉冲飞秒近红外激光系统，或耦合倒置落射荧光显微镜的800 nm脉冲飞秒近红外激光系统来诱导DNA损伤。尽管在这些系统中诱导相当程度的DNA损伤反应（DDR）所需的输入功率（样品中激光焦点处的实际辐照度）有所不同，但输入功率滴定的基本原理适用于这两种系统，或任何近红外激光系统。32,57。该 原位 两种激光系统的单脉冲能量及焦点处的峰值辐照度均在5.33 × 10范围内-2-4 × 10-1 nJ 和 7 × 1010-5.24 × 1011 W/cm2分别32.
<ol>
	<li>打开近红外（NIR）激光器，并在使用前让激光系统预热 1 小时。</li>
	<li>将细胞培养皿置于带有加热装置（37 °C）的载物台上，放入可控制 CO2（5%）和湿度（100%）的培养室中。 
	注意：若无 CO2 培养室，可使用不含 CO2 的培养基，最多维持 5–6 小时。若无加热载物台，应将细胞在显微镜下观察时间控制在 &#60; 20 分钟内，并立即放回具备适当温度、CO2 浓度和湿度控制的组织培养孵育箱中。这些培养条件可能因所用细胞类型及来源物种（例如，哺乳动物与两栖动物）的不同而有所差异。</li>
	<li>对于荧光标记蛋白的活细胞分析，使用 100X 或 63X 油镜物镜，分别选择 GFP 滤光片（激发波长 450–490 nm，发射波长 515–586 nm）或 Cy3 滤光片（激发波长 540–552 nm，&#62; 590 nm 发射波长），用于检测 GFP 或 mCherry 融合蛋白。</li>
	<li>选择具有相似荧光信号的细胞，以反映蛋白表达水平相近。避免选择表达过弱或过强的细胞，以减少细胞间荧光测量的变异性。</li>
	<li>滴定激光输入功率。
	<ol>
		<li>连接至共聚焦显微镜的 780 nm 近红外激光器
		<ol>
			<li>使用软件的漂白功能，在细胞核内选定线性轨迹区域，进行单次激光扫描（分辨率 512 × 512 像素，放大倍数 X1，漂白区域 50 × 4 像素，像素驻留时间 12.8 µs，扫描次数 ×1），通过油镜（100X/1.3 NA）实施照射。</li>
			<li>调整激光透射百分比（使用显微镜制造商集成于系统中的软件/硬件），设为 5%，其他参数保持不变。</li>
			<li>将一个细胞置于视野中央。点击“感兴趣区域（ROI）”工具，用鼠标在细胞核内绘制一条线或一个矩形框（约 50 × 4 像素），然后点击 &#34;漂白&#34; 按钮以诱导 DNA 损伤。 
			注意：在后续的照射步骤中，可根据需要将 &#34;漂白&#34; 功率以 5% 为增量逐步增加至 40%，必要时可增至 100%。</li>
			<li>连接至落射荧光显微镜的 800 nm 近红外激光器</li>
			<li>通过在光路中引入并安装于计算机控制的电动旋转台上的偏振滤光片，利用（63X/1.4 NA）相差油镜物镜调节输入功率32,39,58。</li>
			<li>调节偏振器角度（°），并使用激光功率计测量进入显微镜的输入功率（mW）。确定能够提供 20 mW 至 155 mW 范围内输入功率的偏振器角度，功率增量为 5–10 mW。</li>
			<li>设置对应于 20 mW 输入功率的偏振器角度。 
			注意：对于本实验所用激光系统，当偏振器角度为 40 ° 时，输入功率为 65 mW。可按 5–10 mW 的增量逐步提高输入功率。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需进行活细胞分析，请进入步骤 6.1 和 6.3；如需进行内源性蛋白或其修饰的免疫荧光检测，请进入第 5 节。分析完成后，进入步骤 4.7 以进一步滴定激光功率。如需分析上游因子的需求情况，请进入第 7 节。 
	注意：碱基切除修复（BER）和非同源末端连接（NHEJ）相关因子的招募迅速（数分钟内），且呈短暂性（&#60; ~30 分钟至 1 小时，具体取决于因子种类，分别在损伤诱导后 &#60; ~4 小时内）。相比之下，同源重组（HR）因子 Rad51 和黏连蛋白（cohesin）的招募在损伤后约 30 分钟至 1 小时才可检测到，且在未修复的 DNA 损伤位点可持续存在超过 8 小时44,50,51。因此，有必要在不同时间点检测不同修复因子的招募情况。</li>
	<li>按照步骤 4.4 的方式，以所需增量（即，780 nm 近红外激光器为 5%，800 nm 近红外激光器为 5–10 mW）逐步增加输入功率，并在一组新细胞上重复步骤 4.5–4.7，以确定每种蛋白的阈值（50% 损伤细胞显示招募）和峰值（100% 细胞显示招募）。</li>
</ol>
5. 免疫荧光染色
注意：为了检测共价蛋白质修饰，例如PAR（复合损伤标志物）和H2AX磷酸化（γH2AX）（DSB标志物），以及环丁烷嘧啶二聚体（CPD）、（6-4）光产物（6-4PP）和8-氧代鸟嘌呤（8-oxoG）（分别为交联和碱基损伤标志物），必须对细胞进行固定，并使用特异性抗体染色。此外，最好通过抗体检测内源性蛋白质来验证荧光标记重组蛋白所得的结果，以区分由重组融合蛋白过表达所引起的假象。
<ol>
	<li>在诱导损伤后（步骤4.5）的不同时间点，根据所研究因素，将培养基替换为1.5 mL 4%多聚甲醛/1×PBS，在室温下固定细胞10分钟（参见步骤1.1）。 
	注意：多聚甲醛蒸气有毒，所有操作均应在通风良好的通风橱中进行。</li>
	<li>去除4%多聚甲醛/PBS，加入1 mL 0.5%去污剂/PBS，室温孵育10分钟。</li>
	<li>去除0.5%去垢剂/PBS，用2 mL PBS洗涤细胞，每次5分钟，共两次；在室温下用2 mL封闭液（10%小牛血清，1% BSA/PBS）孵育细胞1小时。</li>
	<li>去除封闭液，向细胞中加入 2 mL PBS，随后替换为 250 µL 含不同 DNA 损伤标志物特异性一抗的抗体溶液（3% BSA/PBS），4 °C 过夜或室温 1 小时。一抗稀释比例为 1:200 至 1:500（典型浓度约为 1 µg/mL，需根据实验条件优化确定）例如，γH2AX/53BP1（DSB）；Ku（DSB，NHEJ）；Rad51/黏连蛋白（DSB，HR）；CPD/6-4PP（交联损伤）；8-oxoG/DNA糖基化酶（例如，NTH1）（碱基损伤）；PAR（高剂量复合损伤）。</li>
	<li>除去抗体溶液，加入2 mL PBS，室温下振荡洗涤5分钟，重复两次；移除PBS，加入250 µL含0.1%二抗的3% BSA/PBS溶液，室温避光孵育1小时。</li>
	<li>移除二抗溶液，加入2 mL PBS，每次5分钟，重复两次；将细胞置于1.5–2 mL PBS中，4 °C保存，用于步骤6.1和6.2的成像。</li>
</ol>
6. 免疫染色或活细胞的定量荧光分析
<ol>
	<li>使用用于照射的显微镜捕获染色或活细胞的图像（n &#62;10）。对于落射荧光显微镜系统，采用1,344 x 1,024像素的分辨率，并将图像保存为16位TIFF文件。对于共聚焦显微镜，使用1X放大倍数；GFP/FITC使用氩离子激光器，Cy3/mCherry使用HeNe 594激光器；图像分辨率为512 x 512或1,024 x 1,024像素；扫描速度设为5，扫描次数设为1以快速扫描，或设为2次以上以多次扫描取平均值，从而提高信噪比。</li>
	<li>使用专为测量像素强度设计的图像分析程序。
	<ol>
		<li>使用体积矩形工具（Volume Rectangle Tool）在单个细胞图像中围绕损伤位点绘制感兴趣区域（ROI）。使用相同大小的ROI在核质中紧邻但不重叠损伤位点的区域测量背景荧光信号。这对于非共聚焦显微镜系统相关的光漂白归一化至关重要。</li>
		<li>在图像分析程序中测量荧光信号时，点击工具箱中的&#34;体积分析报告&#34;，将弹出一个新窗口。在&#34;数据显示&#34;部分，仅勾选&#34;名称&#34;和&#34;密度&#34;选项，然后点击&#34;完成&#34;以查看测量结果。</li>
		<li>通过点击“体积报告”窗口底部的表格图标，将数值导出至电子表格程序，并在“字段分隔符”中选择&#34;Tabs (excel format)&#34;，在“导出目标”中选择&#34;文件&#34;。</li>
		<li>为获得相对信号值，使用电子表格程序将损伤位点处的荧光强度（第1列）除以核质中对照背景区域的荧光强度（第2列），再减去1进行归一化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦显微镜进行实时定量荧光时间序列分析
	<ol>
		<li>按照步骤4.3中的方法，使用显微镜识别表达荧光标记蛋白的阳性细胞。</li>
		<li>在损伤前及第4节中诱导损伤后的不同时间点进行延时荧光成像。首先绘制漂白ROI（用于诱导损伤），然后选择&#34;采集&#62;时间序列&#34;子菜单，设置&#34;次数&#34;为20，&#34;循环延迟&#34;为30秒，选择&#34;首次扫描后漂白一次&#34;，然后点击&#34;开始B&#34;。在此设置下，第一幅图像在损伤诱导前立即获取，随后以30秒间隔连续获取19幅图像。可根据研究目的调整间隔时间（即&#34;循环延迟&#34;）。</li>
		<li>图像采集完成后，点击&#34;平均值&#34;，并在损伤区域绘制ROI。点击&#34;显示表格&#34;，以获得列出所选ROI内强度值的表格。将不同时间点损伤位点的荧光强度除以损伤前同一区域的强度，再减去1，对数据进行归一化处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 小干扰RNA（siRNA）转染
注意：靶蛋白的耗竭是明确观察到的蛋白在损伤位点招募过程中上游因子需求的有效方法（第4节）。此外，该策略也是验证用于免疫荧光检测的抗体特异性的最佳方法（见第5节）。
<ol>
	<li>第1天：在24孔板中准备两孔HeLa细胞，每孔接种6-8 × 104个HeLa细胞于0.5 mL培养基中，一孔用于对照siRNA转染，另一孔用于PARP1 siRNA（5'-CCG AGA AAT CTC TTA CCT CAA-3'）转染。</li>
	<li>第2天：确认细胞融合度约为40-50%。进行第一轮siRNA转染：将5 pmol siRNA溶于25 µL无血清培养基中，加入3 µL脂质类转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5-10分钟。</li>
	<li>用0.5 mL新鲜培养基洗涤细胞一次，并将细胞继续培养于0.5 mL新鲜培养基中（见步骤1.1）。</li>
	<li>将RNA-脂质复合物加入细胞中，通过轻轻倾斜培养皿前后晃动混匀。将细胞放回培养箱中，如步骤2.1所述。</li>
	<li>转染6小时后，吸除转染混合物，加入0.5 mL新鲜培养基（步骤1.1）。</li>
	<li>第3天：进行第二轮siRNA转染（见步骤7.2）。随后，将60-100%的细胞接种至35 mm带网格盖玻片培养皿中，操作如步骤2.3所述。</li>
	<li>第5天：使用第4节确定的最佳激光功率条件进行激光微照射，以实现目标因子的最大程度招募。通常可在约60-90%的HeLa细胞中观察到有效的蛋白耗竭。 
	注意：作为替代且互补的方法，若有可用抑制剂，可使用其抑制目标因子的功能32,44。为分析抑制DNA损伤应答（DDR）信号通路的影响，可在诱导损伤前1小时，向培养皿中加入20 µM PARP抑制剂、1 µM PAR糖水解酶（PARG）抑制剂，或10 µM DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）抑制剂联合10 µM ATM抑制剂，溶剂为二甲基亚砜（DMSO）。对照组细胞仅加入DMSO。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

使用激光显微照射技术进行DNA损伤应答（DDR）研究的优点包括：
1. 通过调整激光照射参数，可诱导从简单的链断裂到复杂的DNA损伤等多种类型和程度的DNA损伤，并可在DNA损伤位点检测不同的修复因子。还可以在同一细胞核内多次造成损伤，以评估trans效应（如图3所示）。
2. 重要的是，可以轻松区分损伤位点处发生的事件以及在细胞核其他位置发生的继发性事件。
3. 可在单细胞水平上对荧光标记蛋白在损伤刺激下的动态变化进行高分辨率实时测量，包括但不限于：荧光共振能量转移（FRET）、荧光寿命成像（FLIM）、配对相关函数（pCF） 等等。，以在活细胞中捕获DNA损伤反应（DDR）。
4. 结合RNA干扰或抑制剂处理，可在少量细胞中相对简便地检测上游因子的需求情况。
5....

体内 DNA 损伤信号传导机制尚不明确 
在体内，DNA 与组蛋白及其他因子结合形成染色质纤维。染色质结构的调控对 DNA 代谢至关重要。例如，在双链断裂（DSB）发生后，组蛋白变体 H2AX 可被共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）及其他激酶磷酸化，这一过程对于 DSB 损伤信号的放大以及为其他因子提供结合位点具有重要作用。损伤信号的扩散及修复通路的选择似乎受到损伤位点局部染色质结构的关键影响1。事实上，多种染色质重塑因子、组蛋白伴侣蛋白以及组蛋白修饰酶均会被招募至损伤位点，并在高效 DNA 修复中发挥重要作用，凸显了染色质调控在 DNA 损伤应答（DDR）与修复过程中的重要意义2,3,4。此外，在酵母和drosophila中观察到损伤位点的聚集或重新定位现象5,6,7,8，类似于基因位点在细胞核亚区室中的重定位，后者与基因调控相关9,10。近期在小鼠和人类细胞中的研究也揭示了 DSB 位点的移动性，这种移动性影响修复保真度及通路选择11,12。这提示 DDR/修复过程可能与细胞核结构、高级染色质组织以及染色体动态密切相关。因此，开发高分辨率方法，在活细胞内源性核环境中研究 DDR 与修复过程，对于理解 DNA 损伤的短期和长期后果至关重要。
PAR聚合酶（PARP）在评估损伤程度与类型以及调控损伤位点蛋白质组装中的关键作用 
PARP1是一种DNA切口感应蛋白，可在DNA损伤后迅速被激活，在DNA修复中发挥关键作用13。最初认为PARP1与X射线修复交叉互补蛋白1（XRCC1）协同作用，促进碱基切除修复（BER），但近年来的研究揭示了其在其他DNA修复通路中的功能，包括双链断裂（DSB）修复14。活化的PARP1以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）为底物，对多种靶蛋白（包括其自身）进行ADP-核糖基化修饰。该酶及其家族其他成员近年来受到广泛关注，因为PARP抑制剂已作为有前景的抗癌治疗药物出现。尽管最初发现PARP抑制剂在乳腺癌基因（BRCA）突变的乳腺癌细胞中有效，但目前已有大量证据表明，其在单药治疗及与DNA损伤剂或放疗联合治疗中，对多种不限于BRCA突变的癌症均具有治疗效果15,16,17,18,19,20。
在分子水平上，PARP的激活被证明在损伤位点局部染色质结构的组织中发挥关键作用。依赖PAR的染色质修饰酶的招募有助于DNA双链断裂（DSB）修复，并决定修复通路的选择，提示PAR修饰在损伤位点具有重要的支架功能。13,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 我们最近证明了PAR可将p53结合蛋白1（53BP1）排除在损伤位点之外32，为PARP抑制剂导致53BP1依赖性的非同源末端连接（NHEJ）过度激活提供了另一种解释，突显了PARP在DSB修复通路选择中的重要性33,34。PARP1还可直接对多种DNA修复因子进行PAR化修饰并影响其活性14。
利用激光显微照射技术研究DNA损伤应答/修复 体内 
激光微辐照技术用于在单个染色体上产生亚微米级改变，最早于1969年被报道35 并于1981年进行了详细综述36几十年后，激光显微照射被证实可在细胞核内特定的亚微米区域诱导DNA损伤，并被证明是一种研究各种因子向DNA损伤位点募集或修饰的有价值技术。 体内13,37,38,39,40,41该方法可用于检测那些在损伤位点不形成明显辐射诱导灶（IRIF）的因子。39,42还可以在损伤位点以及细胞核其余区域中检测染色质结构变化的空间-时间动态。我们仔细比较了不同激光系统和输入功率所诱导的DNA损伤应答（DDR），以评估DNA损伤类型与微辐照条件之间的关系32,43,44,4553BP1 和端粒重复序列结合因子 2（TRF2）的异常招募模式在此前的激光损伤研究中已有观察，这为人们持续关注该问题提供了依据 &#34;非生理性的&#34; 激光诱导损伤的性质46,47,48,49我们发现，这些表面上的差异现在可以通过差异性PARP信号传导来解释，后者能够评估所诱导损伤的程度和复杂性32我们证实了：1）激光微照射的细胞（即使在高输入功率照射后）以依赖于损伤检查点控制的方式停滞在间期，并保持存活（至少达48小时）32,50；以及2）修复因子的招募/修饰能够真实再现使用传统DNA损伤剂处理及通过核酸内切酶诱导DNA双链断裂时所观察到的现象32,39,42,44,50,51,52这些结果有力地支持了研究激光损伤诱导的细胞反应具有重要的生理相关性。

<table><tbody><tr><td>Ti:Sapphire 近红外飞秒脉冲激光器 Mira-900</td><td>Coherent公司</td><td>Mira 900</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜&amp;nbsp;</td><td>卡尔·蔡司</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>63倍/1.4 数值孔径物镜</td><td>Zeiss</td><td>复消色差 Ph3&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型旋转台&amp;nbsp;</td><td>Newport 公司</td><td>PR50PP</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>沃纳</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>加热系统</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>10918</td><td></td></tr><tr><td>气体培养系统</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>11920</td><td></td></tr><tr><td>激光功率和能量计（RoHS）</td><td>相干的</td><td>FieldMaxII-TOP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-R2 数字化CCD相机</td><td>滨松</td><td>C10600</td><td></td></tr><tr><td>LSM 510 META 激光扫描显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X/1.3 NA 蔡司 Plan APO物镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm 网格培养皿&amp;nbsp;</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-CGRD-D</td><td></td></tr><tr><td>PtK2 肾上皮细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL 56&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>CO2-非依赖性培养基&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>高级MEM&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12492-013</td><td>添加L-谷氨酰胺，4% 胎牛血清</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-02</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶脱氧核苷&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;SIGMA</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （Opti-MEM I 低血清培养基）</td><td>Fisher Scientific</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>抗环丁烷嘧啶二聚体（CPD）（小鼠）</td><td>Kamiya Biomedical Company</td><td>MC-062</td><td></td></tr><tr><td>抗XRCC1（小鼠）</td><td>Gene Tex Inc</td><td>GTX72311</td><td></td></tr><tr><td>抗53BP1（兔）</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-22760</td><td></td></tr><tr><td>抗 CtIP（兔）</td><td>Abcam</td><td>ab70163</td><td></td></tr><tr><td>抗PAR聚合物（小鼠）</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-SA216-0100</td><td></td></tr><tr><td>抗PAR（兔）</td><td>Trevigen</td><td>4336-BPC-100</td><td></td></tr><tr><td>抗TRF2（小鼠）</td><td>Novus Biological&amp;nbsp;</td><td>NB100-56506</td><td></td></tr><tr><td>抗 6-4PP（小鼠）</td><td>加米亚生物医学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 Rad21（兔）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （用于黏连蛋白检测）</td><td>由横森（KY）实验室制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗 Rad51（兔）</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-8349</td><td></td></tr><tr><td>抗Ku70（小鼠）</td><td>&amp;nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100-102</td><td></td></tr><tr><td>8-氧代鸟嘌呤&amp;nbsp;</td><td>Trevigen, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗PARP1&amp;nbsp; （兔）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>在KY实验室中制备</td><td></td><td>参考文献43</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;抗hCAPG（兔）&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; （用于凝缩蛋白检测）</td><td>在 KY 实验室生成</td><td></td><td>参考文献 42</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗兔 IgG</td><td>&amp;nbsp;Jackson ImmunoResearch Inc</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>驴抗小鼠Alexa Fluor 488 IgG</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>HiPerFect siRNA 转染试剂</td><td>Qiagen</td><td>301705</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>GFP-SMC1 稳定细胞系&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>在KY实验室生成</td><td></td><td>参考文献 49&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-NEIL2 稳定细胞系</td><td>在KY实验室中制备</td><td></td><td>参考文献 54</td></tr><tr><td>GFP-NTH1 稳定细胞系</td><td>在KY实验室生成</td><td></td><td>参考文献 32</td></tr><tr><td>GFP-SMC1 质粒</td><td>在KY实验室中制备</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-Ku 质粒</td><td>在KY实验室生成</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗MDC1（兔）</td><td>&amp;nbsp;Novus Biologicals</td><td>NB100&amp;ndash;395</td><td></td></tr><tr><td>抗gH2AX（兔）</td><td>&amp;nbsp;Millipore</td><td>07&amp;ndash;164</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-53BP1(1220-1711) PtK2 稳定细胞系</td><td>由 Berns 实验室生成</td><td></td><td>参考文献 32</td></tr><tr><td>TRF2-YFP PtK2 稳定细胞系</td><td>由 Berns 实验室生成</td><td></td><td>参考文献 32</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>PARG抑制剂</td><td>Trevigen</td><td>4680-096-03</td><td></td></tr><tr><td>DNA&amp;ndash;PKcs抑制剂&amp;nbsp; NU7026&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N1537</td><td></td></tr><tr><td>ATM抑制剂KU55933</td><td>&amp;nbsp;Calbiochem</td><td>118500</td><td></td></tr><tr><td>奥拉帕利&amp;nbsp;</td><td>Apexbio Technology</td><td>A4154</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛&amp;nbsp;</td><td>电子显微镜科学 MS</td><td>100503-916 (EA)</td><td></td></tr><tr><td>Quantity One 1-D 分析软件版本 4.6.9</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>SOFT-LIT-70-9600-Q1-469PC&amp;nbsp;</td><td>图像分析程序</td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td></td><td>电子表格程序</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>去垢剂</td></tr><tr><td>不含钙和镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）10X</td><td>Fisher Scientific</td><td>14200166</td><td>稀释至1倍浓度&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂dna损伤的反应

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA损伤会诱导细胞内产生特定的信号传导和修复反应，这对于维持基因组完整性至关重要。体内研究DNA损伤反应（DDR）时，激光显微照射已成为一种重要的实验工具。该技术可对细胞核内亚微米区域受限的激光诱导损伤，进行实时、高分辨率的单细胞大分子动态分析。然而，目前已有多种不同的激光条件被使用，却往往未充分考虑其所诱导损伤类型的差异。因此，损伤的性质通常未能得到良好表征或有效控制，导致在修复因子的招募或修饰模式上出现明显的不一致。我们已证明，不同的照射条件（即飞秒（fs）近红外（NIR）激光的不同波长以及不同的输入功率（辐照度））会诱导出不同的DDR及修复蛋白组装模式，这反映了所产生的DNA损伤类型。本实验方案描述了如何通过调节激光输入功率，诱导出不同数量和复杂程度的DNA损伤，并可通过检测碱基损伤与交联损伤、差异化的聚（ADP-核糖）（PAR）信号以及损伤位点处通路特异性的修复因子组装情况，对损伤程度进行便捷监测。一旦确定了损伤条件，即可进一步研究不同损伤复杂性、差异性损伤信号传导，或上游因子缺失对任意目标因子的影响。

使用稳定表达EGFP-53BP11220-1711或TRF2-YFP的PtK2细胞，通过激光输入功率滴定确定其招募的最佳条件（图1）32。
在高输入功率激光损伤位点，观察到CPD（通常由紫外（UV）损伤产生的交联损伤）以及特异性识别碱基损伤的GFP-NTH1 DNA糖基化酶显著聚集。此外，还观察到更高的XRCC1和CtIP信号，反映出链断裂数量增加，表明在此条件下可诱导产生复杂的DNA损伤。图 2A）。其他与荧光蛋白融合的DNA糖基化酶（例如，GFP-nei 内切酶 VIII 样 2（NEIL2）和 GFP-8-氧代鸟嘌呤糖苷酶（OGG1）以及凝缩蛋白 I 也可用作碱基损伤标志物44,59. 与此一致，我们发现高输入功率激光可显著诱导 PAR 反应即</...

本实验方案的目的是描述如何利用激光显微照射诱导不同类型的DNA损伤，包括相对简单的链断裂和复杂损伤，以研究DNA损伤信号传导及修复因子在损伤位点的聚集。 在体.

激光微辐照技术用于研究 体内 细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

DNA损伤会诱导细胞产生特定的信号传导和修复反应，这对于维持基因组完整性至关重要。激光显微照射……

本实验方案的总体目标是介绍如何利用激光显微照射诱导多种类型的DNA损伤，包括简单的链断裂和复杂的损伤，以在活体条件下研究DNA损伤信号传导及修复因子的组装过程。在20世纪60年代和70年代，我们通过显微镜（如我身后所示）将激光束聚焦，能够对染色体的特定小区域造成损伤。细胞随后仍能分裂并存活，而我们无法理解其原因。40年后的今天，我们正在利用这一方法选择性地研究DNA修复，这也是您今天将要看到的内容。该方法有助于回答DNA修复领域中的关键问题，例如DNA损伤如何被识别和处理，以及损伤信号如何在细胞内传播。激光显微照射技术能够对细胞核内数微米区域的DNA损伤作出响应，实时、高分辨率地分析单个细胞中大分子动态变化。然而，由于在不同激光条件下诱导的损伤类型存在差异，而这些差异未被充分认识，导致细胞反应、因子募集及修饰方面出现不一致。为了在Hela细胞中表达荧光标记的蛋白质，在第一天，将六至八乘以10的四次方个细胞接种于24孔板的一个孔中，每孔加入0.5毫升培养基。然后将培养板放入组织培养箱中。在第二天，通过将编码荧光标记DNA修复因子的0.3微克哺乳动物表达质粒DNA溶于25微升无血清培养基中，进行脂质体介导的DNA转染。本实验中，我们使用与GFP融合的53BP1损伤位点靶向结构域来标记双链断裂损伤，或使用与GFP融合的DNA糖基化酶NTH1来标记碱基损伤。在另一个1.5毫升离心管中，将1微升基于脂质体的DNA转染试剂溶于25微升无血清培养基中，然后将含稀释DNA的管与含转染试剂的管内容物混合，室温孵育10分钟，以形成DNA-脂质复合物。用 0.5 毫升培养基清洗细胞一次，然后吸去培养基，向细胞中加入 0.5 毫升新鲜培养基。将 DNA-脂质复合物加入细胞中，轻轻晃动培养板数次以混匀。然后将细胞放回培养箱中。培养四到六小时后，移除细胞的培养基，加入 300 微升 0.5% 胰蛋白酶-EDTA。去除溶液后，再加入 200 微升胰蛋白酶-EDTA，于 37 摄氏度孵育细胞三到四分钟。确认细胞脱落之后，加入 800 微升培养基，通过轻柔吹打重悬细胞，以分散细胞团块。将细胞悬液转移至含有网格盖玻片的35毫米培养皿中，并加入培养基至终体积为2毫升。48小时后，细胞融合度将达到30%至60%，并表达荧光蛋白，此时可进行激光损伤诱导。打开近红外激光器，并在使用前让激光系统预热一小时。将细胞培养皿置于带有二氧化碳和湿度控制的培养腔内的37摄氏度加热载物台上。对荧光标记蛋白进行活细胞分析时，使用高倍油镜物镜，并根据标记物选择合适的荧光滤光片组合。寻找具有相似荧光蛋白表达水平的细胞。避免选择表达过弱或过强的细胞，以减少细胞间荧光测量的变异性。进行共聚焦显微镜观察时，使用100倍、数值孔径1.3的油镜，并利用软件的漂白功能靶向细胞核内的线性轨迹。在不改变其他任何设置的情况下，将激光透射百分比调整为5%。然后将一个细胞置于视野中央。点击目标区域，使用鼠标在细胞核内绘制一条线或一个矩形框，大小约为50乘以4像素。注意避免接触核膜或核仁。然后点击漂白按钮以诱导DNA损伤。此处，GFP-53BP1与GFP-NTH1峰值募集的差异明显。为利用共聚焦显微镜对活细胞进行定量荧光分析，使用1倍放大倍数及氩离子激光激发GFP/FITC。设置分辨率为 512 x 512 像素，扫描速度为 5，扫描次数设为 1 次以进行快速扫描，或设为 2 次及以上以对多次扫描进行平均，从而提高信噪比。随后采集图像。绘制漂白 ROI 以诱导损伤，然后选择已获取的时间序列子菜单，将循环次数设为 20，循环延迟设为 30 秒。在首次扫描后选择一次漂白，然后单击开始B。在此情况下，第一幅图像在损伤诱导前立即获取，随后以30秒为间隔连续获取19幅额外图像。此处可见，GFP-NTH1会快速且短暂地被招募至损伤位点，而GFP-53BP1则缓慢积累并在损伤位点持续存在。某些修复因子可能以细胞周期特异性的方式被招募至损伤位点。为了识别用于诱导损伤的 G1 期细胞，在倒置显微镜下使用 10 倍物镜和 10 倍目镜，寻找略微隆起且呈圆形的有丝分裂中期细胞。获取图像以记录有丝分裂中期细胞在带网格盖玻片上的位置。三到四小时后，确认细胞分裂已产生两个子代细胞，并位于先前记录的位置，可用于后续的损伤诱导。为制备处于SG2期的细胞，采用双胸腺嘧啶阻断法。通过DNA谱型分析和/或检测损伤位点处Rad51的定位来确认同步化效率。与低输入功率相比，在高输入功率激光损伤条件下，环丁烷嘧啶二聚体（CPD）紫外线损伤的聚集以及特异性识别碱基损伤的GFP-NTH1 DNA糖基化酶的聚集更为明显。此外，观察到 XRCC1 和 CtIP 的水平升高，反映了单链和双链断裂数量的增加，从而表明诱导了复杂的 DNA 损伤。如本研究所示，激光输入功率的变化会导致损伤信号的改变。PARP1 介导损伤位点处靶蛋白的多聚 ADP-核糖基化（PAR），该过程在高输入功率激光照射下显著诱导，而在低激光功率下仅微弱诱导。53BP1 会被招募至低输入功率造成的损伤位点，但不会被招募至高输入功率造成的损伤位点。有趣的是，当同一细胞核内同时存在高输入功率损伤时，53BP1 向低输入功率损伤位点的招募受到抑制。这种抑制作用可被 PARP 抑制剂缓解。相反，抑制降解PAR的PARP会增强PAR信号，并有效抑制53BP1在低功率激光诱导损伤位点的招募。这表明，决定53BP1招募的是PARP信号通路本身，而非损伤性质本身。该实例表明，通过激光滴定可揭示PARP1对DNA损伤程度与复杂性的差异性激活，进而调控损伤位点的可及性。掌握该技术后，包括细胞准备、激光系统设置、DNA损伤诱导、活细胞或免疫沉默细胞成像以及数据分析在内，整个过程大约需要五天时间。若涉及细胞同步化或时间成本分析，则可能需要更长时间。在实施该实验过程中，需要注意的是，即使在同一激光系统中，激光输入功率的滴定效果也可能随时间发生偏差，尤其是在系统重新校准后，因此定期检查修复因子的招募模式至关重要。采用此方法后，可进一步实施并比较其他DNA损伤方法（如分析辐照、化学试剂或核酸内切酶表达）所获得的结果，以确认这些结果并非由激光特异性伪影所致。该技术建立后，为DNA修复领域的研究人员探索DNA损伤应答及其与细胞核染色质的关系提供了途径，并有助于发现新的DNA损伤识别、加工及信号转导相关因子与通路。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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激光微辐照技术用于研究体内细胞对简单和复杂DNA损伤的反应

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