多光子时间推移成像实时可视化发展: 迁移神经嵴细胞在斑马鱼胚胎中的可视化
August 9th, 2017
激光扫描与波长多光子荧光显微镜的先进光学技术组合的实施是为了捕获高分辨率的、 三维的、 实时成像中甘油三酯 (sox10:EGFP) 和甘油三酯 (foxd3:GFP) 斑马鱼胚胎神经嵴迁移。
多光子延时成像的总体目标是捕获迁移细胞群的高分辨率三维实时图像。这种方法可以帮助回答发育生物学中的关键问题，例如绘制不同细胞群的迁移途径。与传统的共聚焦显微镜相比，该技术的主要优点是多光子激光器具有更深的组织穿透性和更低的光毒性。
这增加了在较厚组织中的可用性，并允许更长的图像采集时间。为了在下午 3：00 到 9：00 之间设置胚胎收集，组装繁殖罐并用反渗透或 RO 水填充它们。
将最多三只雌性和三只雄性转移到分开的水箱的相对两侧。第二天早上，在饲养箱的灯亮起后不久，取下隔板。让不受干扰的交配 20 分钟或直到产生足够数量的胚胎。
胚胎将位于繁殖箱的底部。当观察到鱼卵时，将开槽的内水箱与鱼一起提起，然后迅速将它们放入装满 RO 水的干净、坚固的外水箱中。使用种蛋收集筛从外槽中收集种蛋，并将种蛋转移到含有 30 mL 1X 胚胎培养基的培养皿中。
在 28.5 摄氏度下孵化收集的鸡蛋。对于转基因胚胎，在受精或 HPF 后 24 小时，去除死卵并评估胚胎的发育阶段。使用镊子，从三到四个表达 GFP 的胚胎中取出绒毛膜。
在具有标准 460 至 490 纳米带通激发滤光片的解剖荧光立体显微镜下，筛选 GFP 阳性胚胎。将这些胚胎转移到含有 30 mL 新鲜 1X 胚胎培养基的单独培养皿中。20 HPF 后，将筛选和去绒毛膜的 GFP 阳性胚胎置于 0.003% PTU 溶液中以抑制色素沉着。
避免尽早开始治疗，因为它会对神经嵴和神经上皮发育产生不利影响。将 0.4 克 LowMelt 琼脂糖粉添加到 20 mL 1x 胚胎培养基中。将混合物加热一到两分钟，或直到溶液澄清并且所有颗粒都溶解。
将大约 1 mL 琼脂糖溶液分装到新鲜的 1.5 mL 离心管中进行储存。要设置开放式桑拿房，请在开放式桑拿房的底部放置少量高真空润滑脂。将圆形玻璃盖玻片放在底座上，然后将打开的浴池顶部拧到底座上，直至拧紧。
将大约 500-700 微升 2% 琼脂糖溶液移液到打开的浴池中，直到底座装满约 3/4 秒。等待 30 秒，让琼脂糖略微冷却而不完全聚合，然后将单个胚胎转移到碱基中心。在荧光立体显微镜下，使用 10 微升微量移液器吸头定位胚胎并将其放置在琼脂糖底部附近，以便在添加胚胎培养基时它不会漂走。
一个关键步骤是确保胚胎在琼脂糖中正确定位。在这些实验中，我们将胚胎横向定向，但也可以将胚胎定位为专注于背侧和腹侧区域。监测并重新定位胚胎，直到琼脂糖凝固。
然后使用移液管将延时胚胎培养基完全填充组装好的开放腔室。将整个设置放在显微镜的载物台上后，根据文本协议，使用五倍物镜定位胚胎。然后手动将载物台升高到最高位置，并使用精细聚焦将胚胎定位在显微镜范围的中间。
手动降低载物台并将 5 次物镜更改为 25 次水浸物镜。小心地抬高载物台，使胚胎重新聚焦。在软件中，单击 XYTZ 模式以在 Z 深度上的 XY 平面上的时间或 T 间隔获取多个图像，使用落射荧光或明场视图找到感兴趣区域中的焦深，这将划定 z 堆栈。
对于这些实验，眼睛的外侧边缘是 z 堆栈的起点。当聚焦于此处时，在软件中单击开始按钮。向下聚焦到胚胎的中线（即 z 堆栈的末端）后，单击 end 按钮。
一个关键步骤是确保 Z 步长包含感兴趣的区域。在我们的例子中，我们想要捕获眼睛从外侧边缘到内侧边缘的宽度。单击菜单以调整采集时间和成像频率。
为了充分恢复 fluor4 和胚胎的存活，允许激光功率打开时的 z 堆栈采集和激光功率关闭时的恢复时间之间的比率至少为 1 比 3。在胚胎恢复的适当时间下，在指定窗口中设置 z 堆栈之间的时间。然后在相应的窗口中设置实验的总时间长度。
现在，打开实时图像设置以对激光设置进行最终调整。在软件中调整激光透射、增益和偏移滑块以优化荧光图像。此外，根据实验的长度、胚胎的预期生长等，根据需要调整胚胎的方向。
确保感兴趣区域在整个实验期间保持在帧内。在延时采集过程中，关闭落射荧光光源，用足以防止背景光的激光安全盒覆盖载物台，然后按开始。通过激光保险箱上的滑动门进入打开的浴室，每 8-12 小时补充一次延时胚胎培养基。
成像采集后，在图像处理软件中打开文件，突出显示正确的图像系列。在软件中，选择过程菜单，单击 3D deconvolution 并应用以对每个 z 堆栈进行反卷积。将单个 tif 文件导入视频处理软件，然后选择所有 tif 文件并将它们拖到视频编辑器中。
将视频中每张图片的长度调整为 0.1 秒。最后，将视频导出为 mov 或 mp4 文件。通过多光子荧光成像在这里看到的是颅神经嵴细胞的迁移模式，这些细胞在转基因 sox10：EGFP 和 foxd3：GFP 斑马鱼品系中产生了颅面部结构和眼前段。
12 至 30 hpf 之间的 Sox 10 阳性神经嵴细胞从神经管边缘迁移到颅面部区域。来自前脑和中脑的细胞向背侧和腹侧迁移到发育中的眼睛，以填充眼周间膜。如此处所示，sox10 阳性细胞形成额鼻突。
来自菱脑的神经嵴细胞向腹侧迁移并产生咽弓。30 至 60 hpf 之间的 foxd3 阳性神经嵴细胞的延时成像显示，这些细胞在视杯和表面外胚层之间迁移，并通过箭头标记的眼裂并聚结在星号标记的晶状体周围形成虹膜基质。一旦掌握，如果执行得当，这项技术从头到尾都可以在四天内完成。
尝试此过程时，请务必记住选择荧光量高的胚胎。最初设置软件可能具有挑战性，但一旦确定了参数，额外的更改通常很小。观看此视频后，您应该对如何使用多光子延时显微镜对胚胎中迁移的细胞进行成像有了很好的了解。
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概述
本研究利用先进的光学技术，特别是多光子荧光激发，实现了对斑马鱼胚胎中神经嵴迁移的高分辨率、三维成像。该方法允许实时观察迁移的细胞群体，增强了我们对发育生物学的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 成像技术
背景
- 多光子时间断层成像与传统方法相比，提供更深的组织穿透。
- 这种技术减少了光毒性，允许更长时间的成像会话。
- 了解细胞迁移对发育生物学至关重要。
- 斑马鱼胚胎是研究神经嵴迁移的有效模型。
研究目的
- 捕捉神经嵴迁移的高分辨率图像。
- 绘制不同细胞群体的迁移路径。
- 改进发育生物学研究的成像技术。
使用的方法
- 激光扫描显微镜
- 多光子荧光激发
- 时间断层成像
- 从斑马鱼中收集胚胎
主要结果
- 成功捕捉了神经嵴迁移的实时成像。
- 展示了多光子成像相对于共聚焦显微镜的优势。
- 提供了对胚胎中细胞迁移动态的见解。
- 增强了对斑马鱼发育过程的理解。
结论
- 多光子成像是研究细胞迁移的强大工具。
- 这种技术可以应用于各种发育生物学问题。
- 未来的研究可以利用这些方法获得对胚胎发育的更深入见解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Multi-photon time-lapse imaging in zebrafish embryos enables real-time, high-resolution visualization of migratory neural crest cells, directly addressing the challenge of mapping dynamic cell behaviors in complex developmental systems. This capability enhances predictive confidence in early discovery by clarifying cell lineage trajectories and supporting mechanistic de-risking for developmental targets. The approach is strategically positioned to inform target validation and translational continuity in disease-relevant models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of neural crest cell migration, supporting functional target validation in developmental pathways.
- Provides mechanistic insights into cell differentiation and migration relevant to congenital disease modeling.
- Facilitates biological de-risking by clarifying lineage-specific contributions to tissue development.
- Supports predictive confidence for early-stage portfolio triage in developmental biology programs.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, live-imaging systems for quantitative assessment of cell migration dynamics.
- Enables reproducible, high-content imaging outputs suitable for downstream screening workflows.
- Supports assay standardization through consistent imaging parameters and time-lapse protocols.
- Prepares robust biological models for compound evaluation targeting migratory or differentiation processes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by modeling neural crest contributions to craniofacial and ocular development.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic studies to preclinical validation of developmental targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking in vivo cell behavior to phenotypic outcomes.
- Supports translational biomarker identification through real-time visualization of cell fate and migration.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and quantitative analysis of cell migration in live vertebrate models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of neural crest migration and differentiation pathways.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis of genetic or pharmacological perturbations.
- Analytics: Provides high-content, time-resolved datasets for statistical comparison of cell migration patterns.
- Translational Research: Bridges early mechanistic findings to preclinical models of congenital disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, reusable imaging platform for diverse developmental and disease-relevant studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in developmental target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of developmental targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced microscopy and zebrafish embryology.
- Demands access to multi-photon laser scanning instrumentation and image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and embryo preparation protocols.
- Adaptation may be needed for different transgenic lines or developmental stages.
- Imaging depth and phototoxicity must be managed to preserve embryo viability during long acquisitions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:48
Embryo Collection for Time-lapse Imaging
1:51
Embryo Preparation
2:52
Preparation of 2% Low-melt Agarose and Mounting the Embryo
4:34
Adjusting Software Settings on the Multi-photon Microscope and Time-lapse Acquisition
7:26
Post-acquisition Processing
8:10
Results: Multi-photon Time-lapse Imaging of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos
9:29
Conclusion
