多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

多光子时间延时成像的总体目标是捕获迁移性细胞群体的高分辨率三维实时图像。该方法有助于回答发育生物学中的关键问题，例如绘制不同细胞群体的迁移路径。与传统共聚焦显微镜相比，该技术的主要优势在于多光子激光具有更深的组织穿透能力以及更低的光毒性。

这提高了在较厚组织中的可用性，并允许更长时间的图像采集。为在下午3:00至9:00之间收集胚胎，需准备繁殖用鱼缸，并用反渗透水（RO水）注满。

将最多三只雌性和三只雄性分别转移到分隔水箱的两侧。次日早晨，在动物房灯光开启后不久移除隔板。让其不受干扰地交配20分钟，或直至产生足够数量的胚胎。

胚胎将位于繁殖缸的底部。观察到卵子后，连同鱼类一起提起带孔的内缸，并迅速将其放入装有反渗水的洁净实壁外缸中。使用卵子收集筛从外缸中收集卵子，并将卵子转移至含有30毫升1倍胚胎培养基的培养皿中。

将收集的卵在 28.5 摄氏度下孵育。对于转基因胚胎，在受精后 24 小时（HPF）去除死亡的卵，并评估胚胎的发育阶段。使用镊子去除三到四个表达 GFP 的胚胎的卵膜。

在配备标准460至490纳米带通激发滤光片的解剖荧光体视显微镜下，筛选表达GFP的阳性胚胎。将这些胚胎转移至另一个含有30毫升新鲜1X胚胎培养基的培养皿中。在受精后20小时（20 HPF），将已完成筛选并去壳的GFP阳性胚胎置于0.003% PTU溶液中，以抑制色素形成。

避免过早开始处理，因为它可能对神经嵴和神经上皮发育产生不良影响。将 0.4 克低熔点琼脂糖粉末加入 20 mL 1× 胚胎培养基中。加热混合物 1 至 2 分钟，直至溶液澄清且所有颗粒完全溶解。

取约 1 mL 琼脂糖溶液分装至新的 1.5 mL 离心管中用于储存。设置开放式浴槽室时，将少量高真空润滑脂涂抹在开放式浴槽室的底座上，将圆形玻璃盖玻片置于底座上，然后将开放式浴槽室的上部拧紧到底座上。

用移液器吸取约500-700微升的2%琼脂糖溶液，加入开放的灌流室中，直至底部约填充至3/4处。等待30秒，使琼脂糖略微冷却但尚未完全凝固，随后将单个胚胎转移至底部中央。在荧光体视显微镜下，使用10微升微量移液枪头调整胚胎方向，并将其置于琼脂糖底部附近，以防止加入胚胎培养液后胚胎漂走。

关键步骤是确保胚胎在琼脂糖中的位置正确。在这些实验中，我们将胚胎侧向放置，但也可以根据需要调整胚胎位置，以聚焦于背侧和腹侧区域。在琼脂糖凝固之前，需持续观察并必要时重新调整胚胎位置。

然后使用移液管将延时胚胎培养基完全充满已组装好的开放腔室。根据文本方案，在将整个装置放置于显微镜载物台上后，使用5倍物镜定位胚胎。随后手动将载物台升至最高位置，并使用微调焦旋钮将胚胎调整至显微镜视野的中央。

手动降低载物台，将5倍物镜更换为25倍水浸物镜。小心地升高载物台，使胚胎重新进入焦点。在软件中，点击XYTZ模式，以在Z深度范围内，按时间（T）间隔在XY平面获取多幅图像。使用落射荧光或明场观察方式，找到感兴趣区域的焦平面深度，以确定z轴层扫范围。

在这些实验中，眼睛的侧缘是z轴堆栈的起始位置。在此处聚焦后，在软件中点击“开始”按钮。然后向下聚焦至胚胎的中线位置（即z轴堆栈的终点），点击“结束”按钮。

关键步骤是确保Z步进范围涵盖目标区域。在本例中，我们需要从外侧边缘到内侧边缘完整捕获眼睛的宽度。点击菜单以调整采集时间和成像频率。

为了充分恢复荧光信号4并保证胚胎存活，当激光开启时进行z层扫描采集的时间与激光关闭时恢复时间之间的比例应至少保持为1:3。在给予胚胎适当的恢复时间后，在指定窗口中设置各z层扫描之间的时间间隔，然后在相应窗口中设置实验的总时长。

现在，打开实时成像设置以对激光参数进行最后调整。在软件中调节激光透射率、增益和偏移滑块，以优化荧光图像。同时，根据实验时长、胚胎预期生长情况等因素，按需调整胚胎的方位。

确保在整个实验过程中，目标区域始终位于视野范围内。在进行延时成像时，关闭落射荧光光源，用符合激光安全防护要求的遮光盒覆盖载物台以隔绝背景光，然后点击开始。通过激光安全盒上的滑动门进入开放式灌流腔，每8-12小时更换一次延时成像用胚胎培养基。

成像采集完成后，在图像处理软件中打开文件，选中正确的图像序列。在软件中选择“处理”菜单，点击“3D 去卷积”并应用以对每个 z 层图像进行去卷积。将单个 tif 文件导入视频处理软件，然后选择所有 tif 文件并将其拖入视频编辑器中。

将视频中每帧图像的持续时间调整为0.1秒。最后，将视频导出为mov或mp4格式。此处通过双光子荧光成像显示的是颅神经嵴细胞的迁移模式，这些细胞在转基因sox10:EGFP和foxd3:GFP斑马鱼品系中发育形成颅面部结构以及眼睛的前段结构。

在12至30 hpf之间，Sox10阳性的神经嵴细胞从神经管边缘迁移至颅面区域。前脑和中脑来源的细胞向发育中的眼睛背侧和腹侧迁移，以定植于眼周间充质。如图所示，Sox10阳性细胞形成了额鼻突。

来自菱脑的神经嵴细胞向腹侧迁移并形成咽弓。在30至60小时（hpf）期间对foxd3阳性神经嵴细胞进行延时成像显示，这些细胞在视杯与表面外胚层之间迁移，并通过箭头所示的视裂，最终在星号标记的晶状体周围聚集，形成虹膜基质。一旦掌握，若操作得当，该技术从开始到完成可在四天内完成。

进行该实验操作时，重要的是要记住选择荧光信号较强的胚胎。软件的初始设置可能具有挑战性，但一旦确定参数，后续通常只需极少调整。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用双光子延时显微技术对胚胎中迁移的细胞进行成像。