Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

该实验程序的总体目标是使用细菌偶联在大肠杆菌或福氏志贺氏菌中创建高密度转座子插入文库。该技术允许通过随机基因组插入 Tn10 转座子来产生数十万个独特的细菌突变体。该技术的主要优点是，在携带转座子时血浆的转移是通过细菌偶联完成的，而不是其他效率较低的方法，例如电穿孔。

此外，Tn10 转座子本身插入基因组的偏差比其他转座子小。使用无菌技术，将 1 毫升供体菌株的过夜培养物加入无菌 eppendorf 管中。试管应标有 D，例如，代表供体。

对受体菌株执行相同作，将 1 毫升受体菌株的过夜培养物移入无菌 eppendorf 管中。同样，标记为 R，表示收件人。在室温下以 14， 000 倍 G 离心两根试管 1 分钟。

这可以在台式离心机上完成。离心机运行时，准备用于偶联的过滤器。使用无菌镊子将硝酸纤维素滤膜置于不含抗生素的标记 LB 琼脂平板上。

或者，可以使用无菌印迹纸代替硝酸纤维素滤纸。将每个过滤器放在单独的 LB 琼脂平板上，以尽量减少污染。确保将每个过滤器放置在适当标记的 LB 琼脂平板上。

制作三个板，每个板包含一个过滤器。一个用于供体菌株，一个用于受体菌株，一个用于文库。离心机完成后，去除过夜培养物。

从 eppendorf 管中取出所有含有抗生素的生长培养基并丢弃。注意不要破坏或干扰细菌细胞调色板，但要尝试去除所有生长培养基。确保在无菌条件下工作，并在每个样品之间更换吸头。

向每个 eppendorf 管中加入 110 微升不含抗生素的新鲜 LB 培养基，并上下移液以重悬培养物。确保无菌工作。通过上下吹打数次以确保没有细胞团块残留。

执行此步骤是为了浓缩细菌培养物并去除过夜培养物中残留的任何抗生素。使用移液管，将 50 微升浓缩的供体培养物放在标有 Donor 的过滤器上。以逐滴方式缓慢地将 50 μL 加入过滤器中。

对受体菌株执行相同的作，加入 50 μL 重悬培养物，将浓缩的重悬培养物以逐滴方式添加到受体过滤器上。为了发生偶联，受体菌株和供体菌株都被添加到同一张滤纸中，以便它们进行密切的物理接触。为此，将 50 微升供体菌株和受体菌株添加到板标记文库上的同一过滤器中。

将这些含有过滤器的琼脂板在 37 度下放置 6 小时。共轭过程在 37 摄氏度下进行 6 个多小时。在偶联过程中，pJA1 纤溶酶进入受体菌株。

偶联后，通过涡旋将细菌与过滤器分离，并用 1 毫摩尔 IPTG 诱导。IPTG 诱导转座酶，并将含有卡那霉素耐药基因的转座子随机插入受体菌株的基因组中。将细菌接种在含有卡那霉素和另一种抗生素的LB琼脂平板上，以选择含有转座子的受体菌株。

受体菌株是 Lambda pir 阴性，因此 pJA1 纤溶酶丢失。在 37 摄氏度下生长 6 小时后，偶联完成。从培养箱中取出含有过滤器的板。

使用无菌镊子从 LB 琼脂平板上去除含有阴性供体对照的过滤器。轻敲试管，将滤纸弄到锥形瓶的底部，并确保过滤器完全浸没在 LB 介质中。该管含有 2 毫升含 IPTG 的 LB 培养基，终浓度为 1 毫摩尔。

涡旋试管 1 分钟，以将细菌与硝酸纤维素过滤器分离。LB 培养基应因细菌细胞而变得浑浊。对收件人控件和库重复此作。

将含有细菌细胞的过滤器彻底涡旋以将细菌与过滤器分离后，将细菌细胞接种在选定的培养基上。在此步骤中，将细菌接种到含有卡那霉素和另一种抗生素（如萘啶酸）的 LB 琼脂平板中。卡那霉素用于选择含有卡那霉素抗性标记物的转座子成功整合到基因组中的受体细胞。

选择尚未将标记整合到基因组中的受体细胞。另一种抗生素（如萘啶酸）用于选择供体菌株。这里使用的供体菌株对萘啶酸敏感，而受体菌株对萘啶酸耐药。

使用第二种抗生素，可以去除供体菌株。在此步骤中，应进行几次稀释，以确定文库的稀释度，从而产生许多间距足够的菌落。在计数和记录含有转座子文库的所有平板上的克隆数后，一些用户可能希望将文库合并或合并为一个试管。

这可以使用无菌撒布器来完成。将 1 毫升 LB 培养基添加到含有转座子文库的 LB 琼脂平板中。将培养基添加到板中后，使用无菌铺展器刮除并分离细菌。

通常不可能将所有细菌从板中清除。去除细菌悬浮液，放入 50 mil 或 15 mil 锥形真空中。对所有板重复此作。

刮完所有板后，将混合的细菌悬浮液涡旋整整一分钟，以打碎任何细胞团块。现在，这构成了池化库。在 37 度下生长 18 小时后，供体或受体对照板上不应有生长。

理想情况下，含有突变文库的板包含许多不同大小的菌落。不同的菌落大小表明克隆具有不同的适应性，是该方案奏效的好兆头。在细菌中建立致密的转座子诱变文库可能有利于许多下游应用，从发现毒力基因和细菌病原体到研究必需基因，再到鉴定遗传相互作用网络。

所有这些下游应用都依赖于密集转座子插入文库的构建。这里介绍的方法提供了一种简单、快速且廉价的程序，用于在肠杆菌菌株（如大肠杆菌或福氏志贺氏菌）中制备非常密集的转座子文库。