Name: 使用细菌共轭的 Enterobacterial 菌株 (如大肠杆菌或志贺菌福氏) 创建稠密的转插入库 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学习使用细菌接合技术在肠杆菌科菌株（如大肠杆菌或福氏志贺菌）中构建高密度转座子插入文库。该方法可高效生成数十万个独特的细菌突变体，适用于功能基因组学和遗传相互作用研究。

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感谢George Church实验室慷慨赠送pJA1质粒。感谢巴塞尔生物中心Urs Jenal实验室的Fabienne Hamburger和Alex Boehm在细菌接合实验方面的帮助以及提供BW20767菌株。同时感谢Olin Silander提出的有益修改意见。本研究经费由新西兰梅西大学以及瑞士巴塞尔大学系统生物学倡议项目（“Battle X”项目，授予Dirk Bumann）提供资助。

注意：若使用 S. flexneri 作为受体菌株，需注意 S. flexneri 是一种可引起胃肠道疾病的人类病原体。涉及 S. flexneri 的实验必须采取适当的生物安全防护措施（在欧洲和美国指定为 BSL-2，在新西兰指定为 PC2）。本实验方案相关视频中进行的所有实验均在 PC1 级别条件下使用非致病性 E. coli MG1655 受体菌株完成。如文献6所述，此前在巴塞尔生物中心的 BSL-2 实验室中开展了与 Shigella flexneri 相关的工作。
注意：以下实验需有效进行两次。第一部分（步骤 1.1–步骤 4.5）用于确定文库涂板的最佳稀释度，目标是找到一个接合产物的稀释度，使每个平板上出现大量独立菌落，但又不至于过多而形成菌苔。这样做的目的是减少适合度显著降低的突变体与适合度较强的突变体之间的竞争。第二部分（步骤 5.1–7.4）为最终文库的构建，即将适当稀释度的文库样品涂布于多个平板上。
1. 实验前一天的准备工作
<ol>
	<li>从冻存菌种中取样，将供体菌株接种于2 mL LB肉汤（Miller配方，含10 g/L NaCl）培养基中，培养基中添加100 µg/mL氨苄青霉素。此处使用的供体菌株为携带pJA1质粒的E. coli BW2076715菌株11。使用氨苄青霉素可维持对pJA1质粒的选择压力。</li>
	<li>从单菌落或冻存菌种中取样，将受体菌株接种于2 mL LB培养基中，培养基中添加除氨苄青霉素或卡那霉素以外的抗性标记物。此处使用的受体菌株为对萘啶酸具有自发抗性的E. coli &#34;野生型&#34; MG165517,18菌株，培养时使用30 µg/mL萘啶酸。</li>
	<li>制备20块含1.5%琼脂的LB琼脂平板（直径90 mm，每皿约12.5 mL）。不含抗生素的琼脂平板可在4 °C避光保存数月，直至使用。</li>
	<li>制备20块含1.5%琼脂的LB琼脂平板（直径90 mm，每皿约12.5 mL），其中添加30 µg/mL萘啶酸和50 µg/mL卡那霉素（LBA Nal30 Kan50）。含抗生素的琼脂平板可在4 °C避光保存数月，直至使用。</li>
	<li>制备200 mL无菌LB培养基。无菌LB培养基可在室温下保存数月。</li>
	<li>根据生产商说明书，制备1 mL 100 mM无菌IPTG储备液。</li>
</ol>
2. 细菌接合或接合作用
<ol>
	<li>离心1 mL供体菌株的过夜培养物，14,000 × g，室温下离心1分钟。弃去培养基。此步骤旨在去除含有抗生素的全部培养基。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于110 µL LB培养基（不含抗生素）中，从而浓缩培养物。</li>
	<li>使用无菌镊子将一张无菌硝酸纤维素滤膜（也可使用无菌印迹纸，参见材料列表）置于不含抗生素的LBA平板中央，标记平板 &#34;阴性对照：供体&#34;.</li>
	<li>使用移液器将50 µL浓缩的供体菌液滴加到滤膜上。</li>
	<li>重复步骤2.1-4处理受体菌株，标记培养板 &#34;阴性对照：受体&#34;</li>
	<li>对于文库构建，将50 µL供体菌液（来自步骤2.2）和50 µL受体菌株（来自步骤2.5）混合滴加到LBA平板上的一张无菌滤膜上（该平板不应含有抗生素）。标记此平板 &#34;文库&#34; 接合发生在滤膜上，因为供体菌和受体菌在滤膜上紧密接触。</li>
	<li>将含有滤膜的琼脂平板置于37 °C下6 h。</li>
</ol>
3. 通过IPTG诱导转座酶激活pJA1转座子
<ol>
	<li>准备三个15 mL锥形管，每管中含有2 mL LB培养基，并加入IPTG至终浓度为1 mM（即，20 µL 100 mM 的IPTG储备液）。分别标记为：供体对照、受体对照和文库。</li>
	<li>从37 °C培养箱中取出培养6小时后的平板（自步骤2.4起）。滤膜上应可见部分细菌生长。</li>
	<li>使用无菌镊子，将供体对照组的滤纸取出，并放入已标记为“供体对照”（来自步骤3.1）的15 mL锥形管中。对受体对照组和文库组同样进行此操作。</li>
	<li>轻敲试管，使滤纸落入15 mL锥形管底部，并确保其完全浸没于LB培养基中。</li>
	<li>将涡旋仪调至高速，充分涡旋至少一整分钟，以使细菌从硝酸纤维素滤膜上解离。LB培养基应变得浑浊，表明含有细菌细胞。图2).</li>
	<li>使用无菌玻璃珠或无菌涂布棒，将涡旋振荡后的供体对照菌悬液 200 µL 涂布于标记的 LBA Nal30 Kan50 平板上 &#34;供体对照，200 µL&#34;.</li>
	<li>重复上述步骤（3.6）处理受体对照，标记培养皿 &#34;受体对照，200 µL&#34;.</li>
	<li>重复上述步骤（3.7）对文库进行操作，标记各孔板 &#34;文库，200 µL&#34;.</li>
	<li>进行额外的稀释（即，1:5、1:10 和 1:100 稀释度，使用不含抗生素的 LB 作为稀释液）文库。取 200 µl 未稀释的文库及各稀释度样品，分别涂布于标记适当的 LBA Nal30 Kan50 平板上。</li>
	<li>将平板放入37 °C培养箱中培养18 h。插入转座子后导致适合度显著降低的基因克隆可能需要更长时间生长，并在平板上较晚出现。平板上应出现多种大小不同的菌落。图3供体和受体菌株平板上应无菌落生长。</li>
</ol>
4. 选择用于最终突变文库的文库适当稀释度
<ol>
	<li>确定第3.9步文库的稀释度，使其产生大量大小不一且分布足够分散的菌落。目标是在一个平板上获得尽可能多的菌落，但数量不宜过多，以免菌落相互融合并竞争资源。每块平板上的菌落数量应约为500–2,000个。合适的平板菌落密度示例如图3所示。</li>
	<li>记录平板上的菌落数量。</li>
	<li>计算接合频率（每个受体细胞产生的接合子数量）。该频率应在1 × 10-4 至 1 × 10-6 范围内19。</li>
	<li>根据下游应用需求确定最终文库所需的突变体数量。许多用户仅需要包含尽可能多突变体的文库。为在理论上生成尽可能多的转座子插入（每个碱基对插入一次），应使菌落数量接近基因组的碱基对数目（即，对于E. coli约为4.5 × 106），以实现基因组中所有可能的转座子插入的完全饱和。需要注意的是，许多在必需基因或功能重要基因中发生插入的突变体无法被回收，因为这些突变对受体细胞是致死的。</li>
	<li>计算为构建所需规模文库所需的初始文库体积。例如，目标文库规模为5 × 104 个突变体。第3.9步中菌落分布最佳的稀释条件为1:10稀释液的200 µL，该平板上的菌落数量估计约为2,000个。若需要5 × 104 个突变体，而每块平板有2,000个菌落，则在此稀释度下需要25块平板。</li>
</ol>
5. 最终突变文库的构建
<ol>
	<li>重复步骤 1 至 3.8，根据需要调整步骤 1.4 中的平板数量（参见步骤 4.4）。</li>
	<li>在步骤 3.9 中，将步骤 4.1 所选的稀释液接种到所需数量的平板上，以构建目标大小的文库（参见步骤 4.4）。</li>
</ol>
6. 估算文库密度
<ol>
	<li>统计每块平板上的菌落数量，从而粗略估计文库的密度。例如：总共 2x105 菌落被接种。 E. coli MG1655 基因组大小约为 4.5 x 106 碱基对。因此，一个约含 2 x 105 插入意味着存在插入片段 平均而言 每22个碱基对发生一次突变，且每个基因大约突变45次，假设一个基因的长度约为1 × 103 碱基对。在该文库中，必需基因中的插入突变很可能被严重低估，因此非必需基因中的插入密度可能高于此值。此类计算可提供转座子密度的粗略估计。</li>
</ol>
7. 转座子文库的汇集与保存
<ol>
	<li>计数菌落后，向文库平板中加入 1 mL LB 培养基（或根据需要加入更多），并使用无菌涂布棒将细菌从平板上刮下。收集细菌悬液，转移至 50 mL 或 15 mL 的锥形管中。对所有平板重复此步骤。</li>
	<li>将合并的细菌悬液涡旋振荡整整一分钟，以充分混匀悬液。</li>
	<li>加入无菌甘油，使其终浓度为 20%。
	<ol>
		<li>在 0.25 mL 离心管中分装 100 份、每份 20 µL，便于后续重新培养。</li>
		<li>在冻存管中至少分装两份或更多份、每份 1 mL 的样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有分装样品于 -80°C 保存</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可用于构建高密度插入文库。该方法能够在不到5 mL的培养体积内，构建包含超过2 × 105个独特转座子突变体的转座子文库6。该方法操作相对简便，仅需大多数基础微生物学实验室常见的试剂，具有可扩展性，且无需昂贵的设备或耗材（如电穿孔比色皿）。
该方法的一个显著优势在于，理论上用户在选择肠杆菌科受体菌株时具有很大的灵活性。本文及其他研究11均使用E. coli作为受体菌株，但pJA1质粒也已成功应用于其他肠杆菌科受体菌种，例如Shigella flexneri6和伤寒沙门氏菌鼠伤寒血清型SL1344株Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410。理论上，pJA1质粒中的γ复制起点（oriR6Kγ）使其能够在广泛的宿主范围内维持存在19，前提是受体菌株为pir+。最近已有新方法被报道，可在多种肠杆菌科菌株中构建pir+基因型20，从而进一步提高了灵活性。此外，pJA1质粒中含有来自RP4质粒的300个碱基对的mob区域，可实现该质粒向多种革兰氏阴性细菌菌株的接合转移19。简而言之，只要满足以下条件，该方法理论上可适用于多种受体菌株：菌株为pir+，且带有不同于卡那霉素抗性、也不同于供体菌株的抗生素抗性标记。
该实验方案中的一个关键步骤在于第4.1步中准确估算铺板所需的细胞数量。如果菌落间距过小，它们会在平板上竞争营养物质，导致适应性较差的突变体被竞争淘汰，这可能会减少突变体的总数。相反，如果菌落间距过大，则每个平板上的菌落数量会过少，为构建大规模文库所需的琼脂平板数量将变得过多，增加操作负担。因此，每块平板上菌落数量需达到适当平衡，这一点至关重要。
进行方案中列出的对照实验非常重要，以确保各步骤按描述正常进行。值得注意的是，当使用萘啶酸作为对抗供体菌株的反向筛选剂时，必须确保阴性供体对照平板上无菌落生长。这是因为可能存在较低频率（约 1 × 10-10）21 的萘啶酸自发抗性，从而导致假阳性结果。通常情况下，接合与转座的发生率约为 2 × 10-4 19。因此，接合与转座的频率比萘啶酸自发抗性的频率高出数个数量级。因此，在实验流程正常运行时，假阳性率相对于真实的转座事件而言极低，可忽略不计。然而，如果接合或转座的频率显著降低（由于接合效率低下和/或IPTG未能有效诱导转座酶基因表达），并且通过扩大实验规模来弥补这一问题，则假阳性克隆（即未插入转座子的克隆）的数量也可能随之增加。
可在步骤 3.2 和 3.10 的孵育时间上进行某些调整。步骤 3.2 指出偶联反应应持续 6 h，但根据我们的经验，该时间可作调整（即，4-7 小时）而不显著改变结果。此外，在步骤 3.10 中，菌落在琼脂平板上的培养时间也可调整，具体时长可根据受体菌株的平均倍增时间或生长速率而定。根据我们的经验，培养 18 小时会产生大小不一的菌落，表明文库中存在多种适合度差异。然而，适合度显著降低的菌落可能需要更长时间才能生长，因此在 18 小时后可能尚未可见。如果本方法用于筛选适合度极低的克隆，建议延长培养时间，并减少平板上的菌落数量以降低拥挤效应（即，48 小时，50-300 个菌落）可被使用。
该方法的其他局限性包括：无法使用已具有卡那霉素抗性的受体菌株。为克服这一障碍，可考虑将 pJA1 质粒中的卡那霉素抗性标记替换为其他可筛选标记，例如氯霉素抗性标记。此外值得注意的是，理论上可以使用具有氨苄青霉素抗性的受体菌株，因为含有氨苄青霉素抗性标记的 pJA1 质粒在转座发生后不久便会丢失。
在选定的遗传背景下构建高密度转座子文库，可能对许多后续应用具有潜在优势。例如，可利用高密度转座子文库通过影印平板法鉴定营养缺陷型突变体22，或鉴定在建立感染过程中存在缺陷的突变体1,2。近年来，随着DNA测序成本的降低以及高通量测序等新技术的普及，转座子文库已与深度DNA测序结合使用，以深入研究基因必需性、基因功能及遗传相互作用。相关方法已在文献23中有所综述，包括转座子导向插入位点测序（TraDIS）、转座子测序（Tn-seq）、深度测序介导的高通量插入追踪（HITS）以及插入序列测序（INSeq）。所有这些后续分析方法均依赖于构建高密度的转座子插入文库。尽管某些特定的后续方法可能需要使用其他载体，但本文所述方案概述了操作过程中需遵循的关键步骤。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir+.&#160;Recently, new methods have been described that allow for construction of the&#160;pir+&#160;in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use&#160;E. coli&#160;as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as&#160;Shigella flexneri6&#160;and&#160;Salmonella enterica&#160;serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the &#947; origin of replication (oriR6K&#947;) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is&#160;pir-.&#160;The&#160;300 base pair mob&#160;region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is&#160;pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References&#160;section was updated from:
<ol start="18">
	<li>Blattner, F. R., Plunkett, G.,&#160;et al.&#160;The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12.&#160;Science.&#160;277&#160;(5331), 1453-1462 (1997).</li>
	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Kvitko, B. H., Bruckbauer, S.,&#160;et al.&#160;A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids.&#160;BMC Res Notes.&#160;5&#160;(1), 157 (2012).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
</ol>
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<ol start="18">
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	<li>Alexeyev, M. F., &#38; Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria.&#160;Gene.&#160;160&#160;(1), 59-62 (1995).</li>
	<li>Barrick, J. E., Yu, D. S.,&#160;et al.&#160;Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli.&#160;Nature.&#160;461&#160;(7268), 1243-1247 (2009).</li>
	<li>Jacobs, M. A., Alwood, A.,&#160;et al.&#160;Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa.&#160;PNAS.&#160;100&#160;(24), 14339-14344 (2003).</li>
	<li>van Opijnen, T., &#38; Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.&#160;Nature Rev Microbiol.&#160;11&#160;(7), 435-442 (2013).</li>
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An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56216/creation-dense-transposon-insertion-library-using-bacterial">Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri</a>.&#160;The Discussion and References sections have been corrected.

Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

在细菌中构建转座子诱变文库具有广泛的应用价值，其应用范围涵盖细菌病原体中毒力基因的发现1,2、必需基因的研究3,4,5,6，以及遗传相互作用网络的鉴定7,8,9。这些研究的关键在于能够构建规模庞大的突变体文库。转座子（可随机插入基因组中的短DNA片段）的使用是一种简单有效的基因功能破坏方法，因为转座子插入基因的开放阅读框或调控区域通常会破坏该基因的功能或表达。
本文概述了一种利用质粒 pJA110 通过细菌接合在 E. coli 或 S. flexneri 中构建转座子文库的方法。使用该质粒具有两个主要优势。第一个优势是，pJA1 质粒表达的 Tn10 转座酶变体具有可诱导性且插入偏好性低11,12，这意味着当在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG）后，转座子能够随机整合到基因组中。转座子含有卡那霉素抗性标记，可用于筛选转座子插入受体菌染色体的突变体。pJA1 质粒的第二个优势在于其含有 R6K 突变型复制起点。R6K 突变型复制起点需要 λ pir 基因才能维持质粒的复制13。由于该质粒无法在 pir- 菌株中复制，因此在受体菌株中会丢失（图 1）。这确保了 Tn10 转座酶从细胞中被清除且不再具有活性，从而在初始转座事件后减少进一步的突变发生。
利用细菌接合将pJA1质粒从供体菌株转移至受体菌株具有多个优势。接合操作简单、成本低廉，且无需电穿孔仪等特殊设备。此外，由于细菌接合效率高，仅需数毫升（mL）过夜培养的细菌培养物即可构建非常大的文库（&#62;2 × 105个独立插入突变体）6。该过程仅需约两小时的动手操作时间，外加细菌孵育与生长所需时间。Langridge et al.14 报道，为构建与本文所述规模相似的转座子突变文库，需进行130次电穿孔实验8，而本方法仅需一次接合反应即可实现。进行130次电穿孔需要大量人力和时间来制备电转化感受态细胞，并消耗大量昂贵材料（例如，电穿孔比色皿），仅耗材成本就超过1000美元。其他研究10虽采用类似方法，但使用不同的细菌菌株，所获得的文库规模远小于本研究（仅5 × 104个菌落形成单位）。
供体菌株的说明：此处使用的供体菌株为 E. coli 菌株 BW2076715 含有 pJA1 转座子质粒16菌株BW20767可与其他菌株接合，使pJA1质粒的转移效率极高。此外，重要的是，BW20767为λ⁻菌株 pir+ 如前所述，质粒pJA1只能在含有λ的菌株中维持 pir 基因。该菌株具有卡那霉素和氨苄青霉素抗性。pJA1质粒含有氨苄青霉素抗性标记，而转座子内包含卡那霉素抗性标记。该菌株在含有100 µg/mL氨苄青霉素的培养基中进行质粒选择性培养。还需注意的是，其他携带 组成型地 表达的转座酶基因已知不稳定，而此处使用的转座酶处于 可诱导的 对照组中仍存在较低的渗漏表达风险。因此，建议尽量减少该菌株的传代次数，并且每次新建文库时均应从冻存菌种中重新划线获取新鲜单菌落。本研究所用的供体菌株可应要求从本实验室获取。
受体菌株的注意事项：受体菌株可选用特定菌株，例如K12衍生的实验室菌株 E. coli 或菌株的 S. flexneri （另请参见讨论部分）. 受体菌株必须具有除卡那霉素抗性之外的另一种抗生素抗性标记，以便筛选排除供体菌株。对于受体菌株，一种 E. coli 此处使用带有自发性萘啶酸抗性突变的 MG1655 菌株。通过将 2 mL 过夜培养物以 200 µL 分装量涂布于含 30 µg/mL 萘啶酸的平板上，筛选获得该自发性萘啶酸抗性突变体。选取一个对萘啶酸具有抗性的 MG1655 单克隆作为受体菌株。此外，该受体菌株必须为 λ 噬菌体溶原性菌株 pir 阴性，如上所述。
概述：在细菌接合完成后，pJA1 质粒从供体菌株转移至受体菌株，此时向培养基中添加 IPTG 可诱导 tnp 基因的表达，该基因受 IPTG 可诱导的 lacIq/Ptac 启动子调控（图 1）。pJA1 质粒上的 tnp 基因为一种突变型转座酶，其在热点区域的插入频率较低6,10,11。加入 IPTG 并诱导后，转座子被激活，并随机插入基因组中。该质粒无法在 lambda pir- 受体菌株中稳定维持，因而会丢失。

<table><tbody><tr><td>0.45 微米硝酸纤维素滤膜（无菌）</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>也可使用印迹纸（见下文）</td></tr><tr><td>将印迹纸剪成约 1 英寸的圆形，用铝箔包裹后高压灭菌/无菌处理。硝酸纤维素滤膜与印迹纸在效率上无差异</td><td>GE life Sciences：产品 Grade 3MM Chr 印迹纸，片状，46 &amp;times; 57 cm</td><td>3030-917</td><td>也可使用硝酸纤维素滤膜（见上文）</td></tr><tr><td>金属镊子，无菌</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>MURRE009/01</td><td></td></tr><tr><td>无菌培养皿，直径 90 mm，体积 68 mL，&amp;nbsp;工作体积 12.5 mL</td><td>Interlab 新西兰</td><td>2303-1090</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃涂布棒</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>NZNZSPREADER</td><td>也可使用无菌玻璃珠将菌液涂布于平板（见下文）</td></tr><tr><td>无菌玻璃珠</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>HERE1080603</td><td>也可使用无菌玻璃涂布棒将菌液涂布于平板（见上文）</td></tr><tr><td>萘啶酸（可选）</td><td>GoldBio.com</td><td>N-015-250</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐 BioChemica</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>APLIA0839.0025</td><td>按生产商推荐方法配制</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素 BioChemica</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>APLIA1493.0010</td><td></td></tr><tr><td>IPTG（异丙基&amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷）&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher 新西兰</td><td>FMTR0393</td><td></td></tr><tr><td>Difco 琼脂颗粒</td><td>Fort Richard Laboratries/Interlab 新西兰</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基基础（Miller's LB Broth Base）</td><td>Thermofisher</td><td>12795-084</td><td></td></tr><tr><td>双蒸甘油 99.5%</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>VWRC24388.320</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 聚丙烯无菌锥形管&amp;nbsp;</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>CORN430791</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，平盖，1.7 ml，超透明聚丙烯材质，带刻度，可高压灭菌且可冷冻</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>AXYGMCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管，Falcon 品牌，聚丙烯材质，锥形，带印刷刻度，平口螺旋盖，无菌</td><td>VWR/Global Science 新西兰</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37°C 培养箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用于培养基灭菌的高压灭菌器&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如escherichia coli或shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

转座子诱变是一种通过将一段称为转座子的DNA随机插入基因组中，从而实现基因失活的方法。以下方案概述了一种高效在细菌菌株间转移携带转座子的质粒的方法，该转座子含有卡那霉素抗性标记。质粒携带的转座酶由一种tnp基因变体编码，可在插入受体菌株基因组时表现出极低的插入偏好性。因此，该方法可用于构建大规模突变文库，其中转座子已插入到大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella flexneri）受体菌株基因组中的独特位置。通过使用细菌接合（而非电穿孔或化学转化等其他方法），可构建包含数十万个独立克隆的文库。由此产生的高密度插入文库中，非必需基因区域的插入频率可高达每4–6个碱基对即发生一次插入。该方法优于其他方法之处在于，它提供了一种成本低廉、操作简便且高效的构建高密度转座子插入文库的途径。所构建的转座子文库可用于后续应用，例如转座子测序（Tn-Seq），以推断遗传相互作用网络，或更简单地用于突变筛选（正向遗传学筛选）。

培养18小时后，平板上应出现大量菌落，菌落大小各异 (图3）。不同的菌落大小表明具有不同适应性的克隆，这是实验方案成功的一个良好迹象。供体和受体对照组的平板上应无任何生长。采用上述方案应可获得远超过 2 x 105 菌落形成单位（CFU）。将实验规模扩大至同时进行五次重复接合反应，预计可获得约 1 x 106 菌落形成单位。在之前的研究中，使用下一代测序进行的分析表明，如此扩大的文库应能产生 &gt;2 x 105 独特的插入序列6. 当菌落形成单位（CFU）极高时（即，1 × 106 菌落形成单位（CFU）中独特插入序列的比例预计将达到平台期，因为所有可利用的（非致死性）插入事件均已得到代表。
<img alt="细菌接合示意图：通过IPTG介导pJA1质粒转移和Tn10转座子插入，卡那霉素筛选。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：细菌接合及转座子插入染色体的示意图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细菌涡旋示意图、培养基澄清度变化、微生物实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：滤膜在LB培养基中涡旋前后的图像。 涡旋前，细菌附着在滤膜上，培养基澄清；涡旋后，细菌从滤膜上脱落进入培养基，使培养基变浑浊。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细菌菌落生长，琼脂平板法，培养皿实验，基因转化结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56216/56216fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：（A）转座子文库在培养 18 小时后的代表性平板。（B）菌落大小的近距离观察。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56216/56216fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用细菌接合技术在大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库的简便方法。该实验方案可通过转座子在基因组中的随机插入，获得包含数十万种不同突变株的细菌突变体库。

利用细菌接合在肠杆菌科菌株（如Escherichia coli或Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库

转座子诱变是一种通过将称为转座子的DNA片段随机插入基因组来实现基因破坏的方法。以下方案……

本实验方案的总体目标是利用细菌接合技术，在大肠杆菌（Escherichia coli）或福氏志贺菌（Shigella flexneri）中构建高密度转座子插入文库。该技术可通过Tn10转座子在基因组中的随机插入，产生数十万种不同的细菌突变体。该方法的主要优势在于，携带转座子的质粒通过细菌接合方式进行转移，相较于电转化等效率较低的方法更为高效。此外，Tn10 转座子本身插入基因组的偏好性低于其他转座子。采用无菌操作技术，将一毫升供体菌株的过夜培养物加入无菌的微量离心管中。该管应进行标记，例如使用 D 表示供体。对受体菌株进行同样操作，取一毫升受体菌株的过夜培养物至无菌离心管中。例如，可标记为 R，代表受体。将两个离心管在室温下以 14,000 ×g 离心一分钟。此步骤可在台式离心机中进行。离心机运行期间，准备用于偶联的滤膜。使用无菌镊子将硝酸纤维素滤膜放置于不含抗生素的、已标记的LB琼脂平板上。或者，可使用无菌印迹纸代替硝酸纤维素滤膜。将每张滤膜分别置于不同的LB琼脂平板上，以尽量减少污染。确保每张滤膜都放置在已正确标记的LB琼脂平板上。制备三个含有滤膜的平板，分别用于供体菌株、受体菌株和文库。离心结束后，取出过夜培养物。移除含有抗生素的所有培养基，并丢弃。注意不要破坏或扰动细菌沉淀，但应尽量去除所有培养基。操作过程中须保持无菌，并在处理每个样品之间更换吸头。向每个离心管中加入 110 微升不含抗生素的新鲜 LB 培养基，上下吹打以重悬菌体。操作过程中须保持无菌。通过反复吹打数次，确保无细胞团块残留。此步骤旨在浓缩细菌培养物，并去除过夜培养中残留的任何抗生素。使用移液器将50 µL浓缩后的供体培养物加至标记为“Donor”的滤膜上。以逐滴方式缓慢将50 µL培养物加入滤膜。对于受体菌株，同样操作，将重悬的菌液50微升以逐滴方式加到受体滤膜上。为使接合反应发生，需将受体菌株和供体菌株同时加至同一张滤纸上，以确保二者密切接触。为此，将50微升供体菌株和50微升受体菌株同时加至标记为文库的培养皿中的同一张滤纸上。将含有滤膜的琼脂平板置于37摄氏度下孵育六小时。接合过程在37摄氏度下持续六小时。在接合期间，pJA1质粒进入受体菌株。接合后，通过涡旋将细菌从滤膜上分离，并加入1毫摩尔IPTG进行诱导。IPTG可诱导转座酶表达，携带卡那霉素抗性基因的转座子将随机插入受体菌株的基因组中。将细菌涂布于含有卡那霉素及另一种抗生素的LB琼脂平板上，以筛选含有转座子的受体菌株。受体菌株为 Lambda pir 阴性，因此 pJA1 质粒会丢失。在 37 摄氏度下培养六小时后，接合完成。从培养箱中取出含有滤膜的培养皿。使用无菌镊子从LB琼脂平板上取出含有阴性供体对照的滤膜。轻弹试管，使滤纸沉至锥形小瓶底部，并确保滤膜完全浸没于LB培养基中。该试管中含有2 mL添加了IPTG的LB培养基，IPTG终浓度为1毫摩尔。 将试管涡旋震荡一分钟，使细菌从硝酸纤维素滤膜上解离下来。LB培养基应变得浑浊，表明含有细菌细胞。对受体对照组和文库同样重复此步骤。在将含有细菌细胞的滤膜充分涡旋以使细菌从滤膜上解离后，将细菌细胞接种至选择性培养基上。在此步骤中，将细菌接种到含有卡那霉素和另一种抗生素（如萘啶酸）的LB琼脂平板上。使用卡那霉素是为了筛选出转座子已成功整合至基因组并携带卡那霉素抗性标记的受体细胞。通过筛选去除基因组中未整合标记基因的受体细胞。使用另一种抗生素（如萘啶酸）来筛选去除供体菌株。此处使用的供体菌株对萘啶酸敏感，而受体菌株则对萘啶酸具有抗性。使用这种第二种抗生素，可以去除供体菌株。在此步骤中，应涂布多个稀释梯度，以确定能够产生大量且分布充分的菌落的文库稀释度。在计数并记录所有含有转座子文库的平板上的菌落数量后，部分使用者可能希望将文库汇集或合并至一个离心管中。可使用无菌涂布棒进行操作。向含有转座子文库的LB琼脂平板中加入一毫升LB培养基。加入培养基后，用无菌涂布棒刮下并分散平板上的细菌。通常无法将平板上的所有细菌全部转移下来。将细菌悬液移出，放入 50 ml 或 15 ml 的锥形离心管中。对所有平板重复此操作。所有平板刮取完成后，将汇集的细菌悬液涡旋振荡整整一分钟，以打散任何细胞团块。此时即得到汇集的文库。在37摄氏度培养18小时后，供体和受体对照平板上应无任何菌生长。含有突变体文库的平板理想情况下应包含大量大小各异的菌落。不同大小的菌落表明克隆具有不同的适应性，这是实验方案成功的一个良好迹象。构建高密度的细菌转座子突变文库可能对许多下游应用具有优势，范围从毒力基因和细菌病原体的发现、必需基因的研究，到遗传相互作用网络的鉴定。所有这些下游应用均依赖于构建高密度的转座子插入文库。本文所介绍的方法提供了一种简单、快速且经济的流程，用于在大肠杆菌或福氏志贺氏菌等肠杆菌菌株中构建高密度转座子文库。

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