量化人单核细胞趋化性 体外 和小鼠淋巴细胞迁移 体内

这些实验的总体目标是实时定量体外单核细胞趋化作用，并在体内追踪淋巴细胞迁移。该体外方法有助于回答免疫学领域的关键问题，例如血清因子对免疫细胞趋化作用的影响。该体外技术的主要优势在于能够实现实时的定量和多重检测。

体内方法有助于回答免疫学领域中的关键问题，例如特定细胞类型在受体动物体内的迁移方式。该体内技术特别适用于在同一动物体内对多种细胞类型的迁移进行定量评估。在开始实验之前，将THP-1细胞置于35毫米细胞培养皿中，用完全培养基在37摄氏度下与荧光染料孵育30分钟。

在细胞孵育的同时，向24孔板的空白对照孔和阳性对照孔中加入750微升含有25毫摩尔HEPES和0.1% BSA的HBSS缓冲液。向实验孔和阳性对照孔中加入用BSA溶液配制的适当浓度MCP-1水溶液。然后将多孔插入式培养小室放入各孔中，注意使插入室的标签与板上的凹槽对齐。

放置小室后，必须彻底清除底部孔中的任何气泡，因为气泡会干扰荧光检测。孵育结束后，将标记的细胞转移至15毫升锥形管中，通过离心收集细胞。并肉眼检查所得沉淀，以确认染料已被细胞摄取。

接下来，在相同的离心条件下，小心地用真空抽吸法吸除上清液，并用添加了25毫摩尔HEPES的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞。将细胞沉淀重悬于含HEPES的新鲜无血清培养基中，进行细胞计数。然后调整体积，使细胞终浓度为每毫升1×10⁶至1.5×10⁶个细胞。

向每个孔的上层室中加入 250 µL 细胞，并将培养板放入 37 °C 的酶标仪中。随后，在适合染料的荧光激发和发射波长下，以每 1 至 3 分钟一次的间隔采集下层室的荧光读数。为准备供体细胞以进行过继性转移，首先将一只经麻醉的 8 至 12 周龄雄性 C57 black six 小鼠的整个脾脏收获至含有冰上预冷完全培养基的细胞培养皿中的 40 µm 尼龙筛网滤器中。

使用注射器活塞末端，通过滤网轻轻研磨脾脏组织。当获得单细胞悬液后，将细胞转移至15毫升锥形管中，并加入四倍体积的氯化铵钾裂解缓冲液以去除红细胞。室温孵育5分钟后，通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于完全培养基中，细胞浓度为每毫升2×10⁷至5×10⁷个细胞。

通过新的40微米尼龙滤网过滤细胞，以去除细胞碎片。将每只受体小鼠含有1×10⁷个细胞的样本用一种可与活细胞兼容的荧光染料进行标记，该染料在后续固定过程中仍可保留，于37摄氏度孵育30分钟。孵育结束后，用四倍体积的含HEPES的HBSS缓冲液洗涤细胞。

将沉淀重悬于新鲜的含 HEPES 的 HBSS 中，调整细胞浓度至每毫升一乘以十的八次方个细胞。接下来，短暂涡旋混匀供体细胞，并将其加入配备 27 号 0.5 英寸针头的 1 毫升注射器中。将麻醉后的 8 至 12 周龄 C57 black six 受体小鼠置于俯卧位，对第一只动物眼球背侧的皮肤施加轻度尾向压力，使眼球轻微突出。

进行眶后注射时，将针头向内侧方向刺入，注入100 µL供体细胞。然后缓慢撤出针头，将小鼠放入单独的恢复笼中，并持续监测直至完全恢复。确保动物得到适当麻醉，并且注射操作经过充分练习，这对于在不同动物之间以及不同实验之间实现一致的细胞递送至关重要。

在过继转移后最多24小时内，将每个受体的脾脏收获至1毫升完全培养基中，并按前述方法制备无红细胞的单细胞悬液。计数后，用染色缓冲液将细胞悬液调整至每毫升含3×10⁷个细胞的浓度。

将100微升细胞转移至96孔圆底板的各个孔中。根据标准的流式细胞术分析方案，对目标标记物进行细胞染色。冰上避光孵育20分钟后，用100微升染色缓冲液洗涤细胞，并将细胞沉淀重悬于200微升新鲜染色缓冲液中，进行第二次离心。

然后将沉淀重悬于125 µL新鲜染色缓冲液中，并根据标准操作流程在流式细胞仪上分析细胞样本。自动荧光读数可清晰显示细胞向MCP-1迁移的现象，且在血清存在下该迁移作用增强。根据迁移刺激的强度不同，在荧光信号增加之前至少存在15分钟的延迟；随着细胞从插入膜底侧进入下室的速度快于从上室迁移的细胞，荧光信号可能达到峰值后逐渐下降。

若过继转移了多个荧光标记的细胞群体，则需要对输入材料中各细胞群体的相对比例进行定量，以校正细胞群体混合过程中可能出现的任何偏差。例如，在本实验中，绿色与橙色荧光标记细胞的比例为0.97比1。细胞迁移情况通过回收的标记细胞数量除以回收的细胞总数来定量。

尽管不同动物之间回收的细胞数量存在较大差异，但对于同一只动物而言，绿色与橙色荧光细胞的比例通常大致相等。掌握该技术后，体外实验可在四小时内完成，而体内实验若操作得当，可在六小时内完成。在进行该操作时，需注意避免在实验腔室中产生气泡，并在经眶后注射过继转移细胞时力求操作一致。

该技术问世后，为免疫学领域的研究人员探索体外和体内趋化作用铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何实时开展并监测体外趋化实验，以及如何分离天然淋巴细胞，用于过继性转移及其体内迁移行为的追踪。感谢观看，祝您的实验顺利成功。