Name: 在酵母S.酵母缺氧反应期间, 测量一段时间内的 mRNA 水平 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解如何使用RNA-seq技术监测酿酒酵母在缺氧反应期间的mRNA水平动态变化。该方法可应用于分析各种细胞响应中的基因表达，为研究细胞信号传导和应激反应提供可靠的实验方案。

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感谢普林斯顿大学刘易斯-西格勒综合基因组学研究所测序核心设施在技术方面的指导以及在RNA文库制备和测序方面的支持。本研究得到了罗文大学和美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（NIH NIGMS）R15GM113187基金对M.J.H.的资助。

1. 诱导缺氧
<ol>
	<li>缺氧时间过程前一日或更早：按照以下步骤准备培养箱、细胞过滤系统、真空泵、气体罐、烧瓶、塞子、玻璃管和管路 材料表.</li>
	<li>将 N2 将培养箱、孵育器、真空泵及过滤系统置于临近位置，以便快速处理细胞。</li>
	<li>在玻璃瓶中混合成分，配制无菌液体YPD培养基（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖），然后进行高压灭菌。</li>
	<li>培养箱中培养瓶的布局示意图 
	注意：来自 N2 储液罐中，第一个烧瓶用作水阱，第二个烧瓶对应最后一个时间点，第三个烧瓶对应倒数第二个时间点，依此类推，直至最后一个烧瓶作为最终的水阱。 图1 显示了烧瓶之间的顺序和连接方式。</li>
	<li>在时间进程实验的前一天，将一个酵母菌落接种到装有5 mL液体YPD培养基的无菌试管中。具体操作为：使用无菌涂布棒从平板上挑取一个完整的菌落，将涂布棒放入液体YPD培养基中，并振荡涂布棒，直至大部分细胞悬浮于液体中。</li>
	<li>30转/分钟旋转试管 &#176;C，过夜（约16小时）。 
	注意：16 小时后，野生型细胞将达到饱和状态（~2 x 108 细胞/mL），表现为培养液非常浑浊。其他菌株可能需要更长时间才能达到饱和，应通过分光光度计测定细胞浓度来检测，如步骤1.9.4所述。</li>
	<li>在时间进程实验当天，经过16小时培养后，使用5 mL移液管将4 mL过夜培养物加入至无菌500 mL锥形瓶中的196 mL液体YPD培养基中，按1:50比例稀释饱和培养物。于30°C、约200 rpm振荡培养4小时。 &#176;C. 
	注意：4 小时后，野生型培养物将达到约 1-2 x 10⁸ 个/mL 的对数中期浓度7 细胞/毫升</li>
	<li>在4小时孵育期间，标记烧瓶（用于低氧和水捕集）以及50 mL收集管。如果步骤1.7中提到的培养箱不用于低氧时间过程，则开启另一培养箱并设置为30 °C &#176;C.</li>
	<li>在将细胞置于缺氧条件之前：
	<ol>
		<li>向两个无菌的250 mL锥形瓶中各加入约50 mL水，用作水 trap（水阱）。</li>
		<li>填充 1/3 将一个聚苯乙烯泡沫架放入装有液氮的冰桶中，用于放置50 mL离心管。</li>
		<li>设置用于收集细胞的过滤系统。使用无菌镊子将无菌滤膜放置在过滤系统的底座上，注意仅触碰滤膜边缘。将过滤系统的上部组件置于底座上，并用系统配备的夹具固定。确保上下组件对齐，以形成严密的密封，防止泄漏。</li>
		<li>使用分光光度计测定细胞浓度。将细胞稀释至可在分光光度计的线性范围内测量的浓度——OD600 在0.2至0.6之间，具体取决于分光光度计的型号。 
		注意：一个OD600 单位约为 3 × 107 细胞/mL，具体取决于细胞形态和分光光度计。浓度约为 ~1-2 × 107 细胞/mL，相当于OD600 约 0.33 - 0.66。</li>
		<li>快速获取时间0样本。
		<ol>
			<li>将过滤系统通过真空管路连接至一个较强的真空源（约10 mbar），并连接1,000 mL的抽滤瓶作为捕集阱。打开真空泵。将培养液（通常约为20 mL）倒入滤器上部单元，等待液体在真空作用下滤过膜（约10秒，时间取决于真空强度）。</li>
			<li>用干净的镊子小心取出滤膜，并放入一个50 mL离心管中。立即将离心管放入浸没于液氮中的试管架内。重要的是，在插入滤膜前切勿预先冷却离心管，否则离心管可能发生爆裂。</li>
			<li>之后 &#62;30 秒后，将离心管放入 -80 &#176;C 冷冻机中，用于后续RNA提取。每次过滤后，清洗并重新组装过滤系统。通过抽水10秒（不使用滤膜）冲洗系统。最后用纸巾将系统擦干。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将4小时培养物稀释至不同的锥形瓶中以对应各个时间点，使每瓶培养物达到对数中期浓度（~1-2 × 10⁸ CFU/mL）。7 细胞/mL）在指定的缺氧时间点。 
		注意：表1显示了野生型S288C所使用的稀释比例 HAP1+ 单倍体菌株。建议在这些低氧培养条件下对每种菌株进行测试，并相应调整稀释比例。</li>
		<li>细胞和培养基加入培养瓶后，将覆盖瓶口的铝箔替换为带有两根插入式玻璃管的塞子。</li>
		<li>将烧瓶按照先前确定的布局放入培养箱中。</li>
		<li>如图所示，牢固连接管路 图1.</li>
		<li>检查所有塞子是否已紧密塞入烧瓶开口中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在0时刻，打开调节阀，然后将流量计设置为3 L/min。 
	注意：两个盛水的烧瓶中均会观察到气泡，表明气体流动正常。若无此现象，需检查所有塞子是否塞紧，以及导管是否正确连接。</li>
	<li>关闭培养箱，将摇床转速设置为约200 rpm。启动计时器。</li>
	<li>每次时间点前，按照上述步骤1.9.3所述设置滤膜系统。</li>
	<li>在每个时间点（例如5 分钟，10 分钟 等等。），由两人迅速按以下步骤处理细胞：
	<ol>
		<li>第一人：从支架上取下相应的烧瓶，拔出带有玻璃管的塞子。 
		注意：这不会中断 N 的流动2 但会暂时中断通往最后一个水封瓶的气流。</li>
		<li>第二人称：用移液器吸取1 mL培养液，加入比色皿中。将培养瓶的管路（现位于管路末端）重新连接至最后一个水封瓶（此过程中需移除一根导管和一个橡胶塞）。然后，按照上述步骤1.9.4所述方法测定比色皿中的细胞浓度。</li>
		<li>第一人称：将剩余的培养物倒入真空过滤系统，然后按照上述步骤1.9.5所述进行过滤和冷冻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成所有时间点的操作后，关闭 N2 气体。首先关闭调节阀并等待压力释放，然后关闭流量计。最后拆卸系统，并用水清洗所有材料，再用70%乙醇处理。</li>
</ol>
2. RNA 提取
<ol>
	<li>按照材料表中的说明配制用于RNA柱纯化的RLT缓冲液。</li>
	<li>通过将每份样品加入10 µL DNase储备液至70 µL RDD缓冲液中，配制DNase工作液（见材料表）。</li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出含有滤膜和细胞的50 mL离心管，置于冰上解冻（约15分钟）。后续步骤均需在冰上操作。</li>
	<li>标记若干2 mL螺旋盖离心管并置于冰上，每个样品对应一管。使用1.5 mL微量离心管舀取并量取约0.6 mL经酸处理的玻璃珠，加入各管中。</li>
	<li>向50 mL离心管中加入0.6 mL预冷的RLT缓冲液。</li>
	<li>用移液器反复吹打，使细胞从滤膜上脱离并悬浮于溶液中。避免让滤膜长时间留在溶液中，因其会吸收溶液。用移液器吸头将滤膜紧贴管壁挤压，以尽可能回收被滤膜吸收的液体。</li>
	<li>将50 mL离心管中的全部液体转移至含有玻璃珠的螺旋盖离心管中。</li>
	<li>将螺旋盖离心管放入珠磨式匀浆器中，运行1分钟。 
	立即取出并置于冰上冷却3分钟。再次放入匀浆器中运行1分钟。</li>
	<li>从匀浆器中取出离心管，置于冰上静置5分钟，使玻璃珠完全沉降至管底。</li>
	<li>后续步骤均在室温下进行。</li>
	<li>用移液器小心吸取上清裂解液（约350 µL），避免吸入玻璃珠，转移至新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>在最大转速下离心2分钟，然后将上清液转移至另一新的1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>加入等体积的70%乙醇（使用分子生物学级无水乙醇配制），通过移液充分混匀。</li>
	<li>将溶液及任何沉淀物转移至已置于2 mL收集管中的RNA纯化柱中。</li>
	<li>在≥12,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液（收集管中的液体）。</li>
	<li>向纯化柱中加入350 µL RW1缓冲液。在≥12,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>向纯化柱膜上加入80 µL DNase I孵育混合液（避免接触管壁），静置15分钟。</li>
	<li>向纯化柱中加入350 µL RW1缓冲液。在≥12,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>向纯化柱中加入500 µL RPE缓冲液。在≥12,000 x g条件下离心15秒，弃去穿流液。</li>
	<li>向纯化柱中加入500 µL RPE缓冲液。在≥12,000 x g条件下离心2分钟。</li>
	<li>小心取出纯化柱，放入新的2 mL收集管中。在最大转速下离心1分钟（以彻底干燥膜）。</li>
	<li>弃去收集管，将纯化柱放入一个1.5 mL微量离心管中。向纯化柱膜中央加入30 µL无RNase水。</li>
	<li>在≥12,000 x g条件下离心1分钟，洗脱RNA。将纯化柱装入微量离心机时，确保收集管盖朝向离心机旋转方向，以防盖子脱落。</li>
	<li>保持纯化柱仍在同一微量离心管中，再向膜上加入30 µL无RNase水。</li>
	<li>在≥12,000 x g条件下离心1分钟，最终洗脱体积为60 µL。</li>
	<li>将每支含60 µL RNA的1.5 mL离心管储存于-80 °C冰箱中。</li>
</ol>
3. 确定RNA浓度和质量
<ol>
	<li>使用荧光计、DNA和RNA特异性荧光染料以及试剂盒中所列的检测管（见材料表），测定每个RNA样品中RNA和DNA的浓度。请遵循荧光计和染料的使用说明。</li>
	<li>或者，使用设定在260 nm波长的紫外分光光度计测定核酸浓度。 
	注意：A260值为1.0相当于约40 µg/mL的单链RNA。</li>
	<li>通过在商用核酸分析仪（见材料表）或标准甲醛/琼脂糖凝胶上电泳RNA来检测RNA质量26。</li>
</ol>
4. RNA-seq 分析
<ol>
	<li>从总RNA储备液中配制21 &#181;L 的 100 ng/&#181;L RNA，置于无RNase的水中。使用1 &#181;21 的 L 部分 &#181;L 测试 RNA 浓度，方法同上。提交剩余的 20 &#181;L (2 &#181;g) 将总RNA送至外部测序中心进行mRNA富集、链特异性文库构建（使用八个或更多条形码用于多重测序）及测序（参见 材料表）或者，在本地进行mRNA富集和文库构建，然后将文库提交测序。</li>
	<li>将八个或更多多重样本混合，并在下一代测序仪的一个测序通道中进行测序。</li>
	<li>下载包含所有测序读段及相应索引读段的FASTQ文件。同时下载包含多重条形码的文本文件。 
	注意：索引读段可能存在于单独的FASTQ文件中。请将所有这些文件放入同一个目录中。</li>
	<li>将提供的 shell 脚本放置于此， &#34;fastq_pipeline.sh&#34;，位于同一目录中。根据实验需求和计算机目录结构，适当编辑此脚本。 
	注意：该脚本包含详细注释，用于解释各个步骤。简要而言，该脚本对测序读段进行质量修剪，将读段比对至参考基因组，并生成一个制表符分隔的文件，其中包含每个样本中每个基因的读段数量。</li>
	<li>在发表前将FASTQ文件和原始读数计数数据存入NCBI的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus） 27. 按照说明进行操作 &#34;向 GEO 提交高通量测序数据&#34;https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html</li>
	<li>将读数计数数据导入 R 统计环境，并使用此处提供的 R 脚本进行统计分析， &#34;time_course_script.R&#34;根据实验和计算机目录的实际情况，适当编辑此脚本。 
	注意：该脚本包含详细注释，用于解释各个步骤。简要而言，该脚本导入测序读段数据，对读段进行标准化处理，识别在时间序列中表达发生显著变化的基因，执行主成分分析（PCA），并绘制选定基因的表达图谱。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，测定了酵母在低氧条件下所有基因的mRNA水平 S. cerevisiae目标是分析在受控的近无氧环境中生长时全局基因表达的变化情况。为确保本文所述方法的严谨控制和可重复性，采取了多个步骤。首先，细胞被暴露于精确设定的低氧环境中：99.999% N₂2 在丰富培养基（YPD）中。其他关于缺氧的研究则将烧瓶或试管对空气封闭 32，使用了模拟缺氧的氯化钴 33，或使用诱导缺氧的厌氧室或厌氧袋 34每种方法可能导致不同程度的缺氧或其他非预期的环境变化。在系统性改变气体混合物的同时研究基因表达将具有重要意义。例如，90% N2 和10% O₂2），因为野生酵母可能经历的缺氧条件较不严苛。其次，麦角固醇和不饱和脂肪酸（例如，未向培养基中添加Tween 80），因为如引言中所述，这些成分会影响基因表达。第三，为尽量减少因生长阶段不同而导致的基因表达变化，根据经验确定稀释比例，使培...

许多生物通过改变基因表达来响应缺氧（即低 O2）1,2,3。这种应答有助于细胞应对有氧呼吸及多种生物合成反应所必需的底物缺乏，同时也应对氧化还原状态的变化4。在S. cerevisiae中开展的多项微阵列研究表明，成百上千个基因的mRNA水平会随缺氧而发生变化5,6,7,8,9,10,11,12。最近，RNA-seq 被用于刻画缺氧过程中随时间变化的基因表达改变13。本文将介绍并讨论该实验的具体细节。
缺氧可以通过多种方式实现，每种方法产生的 O2 水平不同。此处通过向烧瓶中持续通入超纯氮气（N2）来建立缺氧环境，可迅速且可重复地降低溶解氧浓度 [O2] 10。尽管可能存在少量残余的 O2 分子参与代谢和基因表达，但该环境被认为已非常接近无氧状态。在缺乏 O2 的情况下，酵母细胞无法生物合成血红素、麦角固醇和不饱和脂肪酸 4,12,14。因此，以往的研究在无氧培养酵母时通常会添加这些代谢物 5,10,15。然而，许多缺氧应答是由这些代谢物的耗竭所介导的，因此补充这些物质会逆转缺氧引起的基因表达变化 12,16。为了模拟自然状态下的缺氧环境，本实验未在培养基中添加这些代谢物。在细胞短暂暴露于缺乏这些必需代谢物的缺氧条件期间，未观察到明显的细胞死亡增加（数据未显示），也未出现持续的应激反应 13。
该反应还依赖于菌株及其基因型。尤其重要的是已知缺氧反应调控因子的等位基因2。S288C菌株背景备受青睐，以便能将实验结果与使用该菌株进行的其他基因组学研究进行比较。然而，S288C菌株携带一个HAP1基因的部分功能缺失型等位基因17，而HAP1是一种对缺氧反应至关重要的转录调控因子。该等位基因已通过来自Σ1278b菌株背景的野生型拷贝在S288C中得到修复11。
基因表达高度依赖于细胞所处的环境。因此，在进行全基因组mRNA分析时，应在保持环境条件恒定的同时改变另一个参数，例如时间、刺激因素或基因型。为了获得高度可重复的实验结果，在整个研究及其所有生物学或技术重复中应遵循以下三项实践。首先，应由同一名或同一组实验人员完成全部实验，因为不同实验人员的操作技术可能存在差异。其次，培养基中应使用同一批次的试剂成分，因为不同批次的成分可能存在微小差异，从而影响基因表达。第三，为尽量减少细胞周期的影响，每个时间点的细胞应处于对数生长中期（1 - 2 × 107 个细胞/mL）且为异步生长状态。
在表征缺氧引起的基因表达反应等复杂响应时，时间序列实验有助于确定各个事件发生的时间动力学。应选择能够捕捉到响应过程中主要变化的特定时间点。在本研究中，观察了0至4小时之间的时间点，因为以往的实验表明，在此期间基因表达发生了广泛的变化13。
为了检测全基因表达，采用了RNA-seq技术18,19。该方法利用下一代测序技术来确定每个基因转录本的相对丰度。与DNA微阵列分析相比，RNA-seq具有更高的灵敏度（可检测丰度较低的转录本）、更宽的动态范围（可测量更大的倍数变化）以及更优的可重复性（可准确追踪基因表达随时间的变化）。通常情况下，细胞中大多数RNA为核糖体RNA，因此已开发出多种方法用于富集特定类型的RNA20。本研究中使用了poly-T磁珠来纯化含有poly-A尾的mRNA转录本，但市面上可获得的各种rRNA去除试剂盒在mRNA富集方面也可能有效。
本研究对 S. cerevisiae 在低氧条件下的基因表达响应进行了表征。将细胞暴露于低氧环境中，并在八个时间点（0、5、10、30、60、120、180 和 240 分钟）取样。为验证实验的可重复性并识别具有统计学显著变化的转录本，共进行了三次生物学重复实验。通过机械裂解和柱纯化方法提取 RNA，随后进行 RNA-seq 分析。文中描述了测序后的分析流程，并提供了编程脚本，以实现所进行分析的精确重复。具体而言，使用 Trimmomatic 21、TopHat2 22、HTseq 23、R 统计环境 24 以及 DESeq2 软件包 25 处理 RNA-seq 数据，鉴定出在低氧过程中显著变化的 607 个基因。主成分分析（PCA）及重复样本的基因表达结果表明该技术具有良好的可重复性。聚类分析和热图揭示了广泛的基因表达动力学特征，而基因本体（GO）分析显示，在受氧气调控的基因集合中，许多细胞过程（如有氧呼吸）显著富集。

<table><tbody><tr><td>封闭式干燥培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MaxQ 4000</td><td>设为30 &amp;deg;C. 修改门以允许一根Tygon管通过。或者，使用New Brunswick G25培养箱，该培养箱配有管道接口。请勿使用开放式水浴摇床，因为冷凝水会积聚在连接烧瓶的管道之间，可能导致培养物交叉污染。</td></tr><tr><td>微型分析滤膜夹</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25毫米直径，不锈钢支架，5号打孔硅胶塞安装于标准125毫升抽滤瓶</td></tr><tr><td>强真空</td><td>爱德华兹</td><td>E-LAB 2</td><td>这 &amp;ldquo;房屋&amp;rdquo; 真空可能过弱。或者，可使用电动便携式真空泵，例如此处列出的型号。</td></tr><tr><td>1,000 mL 烧瓶</td><td></td><td></td><td>用作真空陷阱。</td></tr><tr><td>约2英尺长的厚壁真空管，内径3/8英寸，外径7/8英寸</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>两部分：第一部分将真空装置连接至捕集阱，第二部分将捕集阱连接至过滤系统。</td></tr><tr><td>高压氮气&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 气罐</td><td></td><td></td><td>99.999% 纯度， &gt;1,000 psi，配备调节器和气体流量控制器</td></tr><tr><td>已灭菌的500 mL烧瓶</td><td></td><td></td><td>用铝箔封口，每种酵母菌株一个。</td></tr><tr><td>经高压灭菌的 250 mL 三角瓶</td><td></td><td></td><td>用铝箔覆盖开口，每个时间点一个，另加两个用于水陷阱。</td></tr><tr><td>锥形瓶塞（6号，两个直径为5 mm的孔）</td><td></td><td></td><td>用70%乙醇灭菌。每个烧瓶各用一个。</td></tr><tr><td>玻璃管，长度9厘米或17厘米，内径2毫米，外径5毫米</td><td></td><td></td><td>用70%乙醇灭菌。每个烧瓶配两根试管。将试管插入每个瓶塞的孔中。参见图1了解9 cm与17 cm试管的放置方式。</td></tr><tr><td>长约 25 厘米、内径 5 毫米的塑料管</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>每个烧瓶各一片。使用70%乙醇灭菌。</td></tr><tr><td>无菌滤膜圆片</td><td>Millipore</td><td>HAWP02500</td><td>25 mm 直径，0.45 &amp;micro;m 孔径，每个时间点各一个</td></tr><tr><td>无菌去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O（约100 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 比色皿</td><td></td><td></td><td>用于测定OD600（即细胞浓度）</td></tr><tr><td>50 mL 无菌离心管</td><td></td><td></td><td>每个时间点一个</td></tr><tr><td>洁净且无菌的镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>用于细胞冻存</td></tr><tr><td>酸洗珠</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>4℃保存 &amp;deg;用于裂解细胞的 C 液</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>用于RNA柱纯化</td></tr><tr><td>Qiagen RLT 缓冲液</td><td></td><td></td><td>加入10制备 &amp;micro;L of &amp;beta;每1 mL RLT缓冲液中加入-巯基乙醇，4℃保存 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>2 mL 收集管</td><td>Qiagen</td><td></td><td>包含在Qiagen RNeasy Mini Kit中</td></tr><tr><td>缓冲液 RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>包含在Qiagen RNeasy Mini Kit中</td></tr><tr><td>缓冲液 RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>包含在Qiagen RNeasy Mini Kit中</td></tr><tr><td>DNase I 储存液与工作液</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>DNase I 酶以冻干粉末形式保存于玻璃小瓶中。使用无菌针头和注射器，向瓶内注入 550 &amp;micro;将无RN酶水（Qiagen试剂盒提供）加入小瓶中。通过轻轻倒置瓶子进行混匀。为避免酶变性，请勿涡旋震荡。使用移液器将此储存液从小瓶中移出，并储存于-20℃冰箱中。 &amp;deg;C) 分装成单次使用量（80 &amp;micro;L 每份）。该储备液不应反复冻融。</td></tr><tr><td>缓冲液 RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>包含在Qiagen DNase试剂盒中</td></tr><tr><td>冰冻的 2 mL 螺口管</td><td></td><td></td><td>用于RNA提取过程中的细胞裂解</td></tr><tr><td>珠磨均质器</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>保持在冷室中</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>YPD液体培养基</td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto）</td><td>BD</td><td>DF0886</td><td>YPD液体培养基</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>YPD液体培养基</td></tr><tr><td>Qubit 检测管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32856</td><td>用于测量核酸浓度</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>用于测量核酸浓度</td></tr><tr><td>Quant-iTTM RNA 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32855</td><td>用于测量核酸浓度</td></tr><tr><td>Qubit 荧光仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q33216</td><td>用于测量核酸浓度</td></tr><tr><td>商用电泳系统</td><td>安捷伦</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>用于测量核酸质量</td></tr><tr><td>下一代测序仪</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>用于测序文库</td></tr><tr><td>自动化液体处理系统</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>用于构建测序文库</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA 分离试剂盒</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>用于从总RNA中分离mRNA</td></tr><tr><td>PrepX RNA测序用于Illumina文库试剂盒</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>用于从总RNA构建链特异性测序文库</td></tr><tr><td>条形码拆分器</td><td></td><td></td><td>https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&amp;&changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools，包含 gzip 命令</td><td></td><td></td><td>http://www.htslib.org/download/</td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2（在安装 TopHat 之前安装）</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R（在安装 R Studio 之前安装）</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio（免费版）</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

测量酵母 s. cerevisiae 缺氧应答过程中 mrna 水平随时间的变化

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

基因表达的复杂变化通常介导了细胞应答的大部分过程。每个基因的表达变化都可能具有独特的动力学特征，因为其受到多种刺激、信号通路或次级效应在特定时间上的调控。为了全面捕捉酵母细胞对缺氧的基因表达应答 S. cerevisiae，采用RNA-seq分析检测细胞在缺氧暴露后特定时间点所有基因的mRNA水平。缺氧条件通过将细胞培养于约100% N₂环境中建立2 气体。重要的是，与其他缺氧研究不同，培养基中未添加麦角固醇和不饱和脂肪酸，因为这些代谢物会影响基因表达。选择缺氧后0 - 4小时的时间点，因为该时间段涵盖了基因表达的主要变化。在每个时间点，处于对数中期的缺氧细胞被迅速过滤并冷冻，以限制其暴露于O₂2 以及基因表达的伴随变化。从细胞中提取总RNA，用于富集mRNA，随后将其反转录为cDNA。基于该cDNA构建多重文库，并在下一代测序仪的一个测序通道中对八个或更多样本进行测序。文中描述了测序后的分析流程，包括碱基质量修剪、序列比对及每基因读段数的统计。利用R统计环境中的DESeq2工具，鉴定在任一缺氧时间点发生显著变化的基因。对三个生物学重复样本的分析显示结果具有高度可重复性，揭示了具有不同动力学特征的基因以及大量预期的O2受调控的基因。这些方法可用于研究不同生物体的细胞随时间对缺氧的反应，并可加以适应以研究其他细胞应答过程中的基因表达。

缺氧时间进程和RNA-seq分析独立重复了三次。为检验三次重复实验的可重复性，对所有基因的基因表达数据进行了主成分分析（PCA）。图2展示了样本在前两个主成分上的变化情况，这两个主成分共同解释了58.9%的变异。该分析表明，每次时间进程的变化趋势相似（表现为各曲线形状相似）。此外，后两次重复实验之间的相似性高于它们与第一次重复实验的相似性。这与以下事实一致：后两次重复由同一人使用相同批次的培养基组分完成，而第一次重复则由不同人员使用不同批次完成。该结果强调了实验操作技术和试剂的一致性是获得高可重复性的关键因素。最后，PCA分析有助于评估所选时间点是否捕捉到了时间进程中发生的主要变化。聚焦于单条重复曲线，早期样本之间的距离较大，表明基因表达发生显著变化；而后期样本之间的距离较小，表明变化幅度减小，可能已接近从有氧到缺氧基因表达转换的终点。
接下来，使用 R 中的 DESeq2 软件包<sup c...

本文介绍了一种利用RNA-seq技术监测S. cerevisiae细胞在低氧应答过程中随时间变化的mRNA水平的实验方案。该方法可适用于分析任何细胞应答过程中的基因表达变化。

测量酵母 S. cerevisiae 缺氧应答过程中 mRNA 水平随时间的变化

基因表达的复杂变化通常介导了细胞应答的大部分过程。每个基因的表达变化可能具有独特的动力学特征，随着……

本实验的总体目标是监测酿酒酵母（S. cerevisiae）细胞在缺氧条件下随时间变化的所有基因的 mRNA 水平。该方法有助于回答细胞信号传导领域中的关键问题，例如：细胞应答过程中基因表达变化的动力学特征是什么？该技术的主要优势在于，mRNA 水平是在多个时间点连续测量，而非仅在细胞应答过程中的单一时间点进行测量。尽管该方法可用于研究酵母的缺氧应答，也可推广应用于其他可在液体培养基中生长的微生物物种。本方法的可视化演示对于准确传达烧瓶与管路连接的详细布局以及从缺氧环境中快速收集细胞的操作至关重要。在开始缺氧时间进程实验的前一天或更早，需准备好所需材料。将氮气瓶、培养箱、真空泵和过滤系统放置在彼此邻近的位置，以便快速处理细胞。通过在玻璃瓶中混合葡萄糖、酵母提取物和蛋白胨，配制液体YPD培养基，并进行高压灭菌以获得无菌培养基。下一步是根据示意图规划培养箱内烧瓶的布局：从氮气瓶出发，第一个烧瓶为水阱，第二个烧瓶对应最后一个时间点，第三个烧瓶对应倒数第二个时间点，依此类推，直至最后一个烧瓶，作为最终的水阱。例如，下图展示了一个包含七个缺氧时间点的烧瓶布局与连接方式。在时间进程实验前一天，需准备一种酵母菌株的预培养物。使用无菌涂布棒从平板上挑取一个完整的菌落，将涂布棒放入含5 mL无菌液体YPD培养基的试管中，轻轻振荡使大部分细胞悬浮于液体中。将试管在30

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在酵母S.酵母缺氧反应期间, 测量一段时间内的 mRNA 水平

基因删除和蛋白质过表达是研究蛋白质功能的常用方法。本文中，我们描述了一种在群体水平和单细胞水平上分析酿酒酵母（Saccharomyces...

酿酒酵母中蛋白质浓度依赖的形态表型发育分析

在本实验方案中，酵母（Saccharomyces...

Saccharomyces cerevisiae 的微阵列分析

本方案描述了一种进行荧光检测的实验操作流程 原位...

mRNA分子的荧光可视化与分析 原位 杂交在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。...

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

特定mRNA的稳态水平由其合成速率和降解速率共同决定。通过测定mRNA的半衰期，可测量全基因组范围内的mRNA降解速率或特定mRNA的降解速率。本方案重点介绍在Saccharomyces...

使用 rpb1-1 菌株测定 Saccharomyces cerevisiae 中 mRNA 降解速率

转录后调控在控制蛋白质丰度中起着重要作用。本文中，我们描述了一种用于定量分析芽殖酵母 Saccharomyces cerevisiae...

通过核糖体图谱分析对芽殖酵母进行全基因组翻译定量分析

本文所述方案基于对经4-硫尿嘧啶标记的酵母细胞中纯化的新生mRNA进行全基因组水平的定量分析。该方法能够将mRNA合成与mRNA降解过程分离，从而准确测量RNA聚合酶II的转录活性。...

Saccharomyces cerevisiae 中利用 4-硫代尿嘧啶进行代谢标记及新合成 mRNA 的定量作为 RNA 聚合酶 II 活性的替代指标

本方案描述了单分子荧光原位杂交（smFISH）技术的一种应用，用于测量体内mRNA合成与降解的动力学过程。...

在 Escherichia coli 中利用双色单分子荧光原位杂交技术研究 mRNA 的时空动力学

我们介绍一种利用甲醛交联在活酵母和哺乳动物细胞中快速稳定翻译（蛋白质生物合成）复合物的技术。该方法能够解析瞬时中间产物以及动态的RNA:蛋白质相互作用。交联后的复合物可用于多种下游应用，例如基于深度测序的分析方法、显微镜观察和质谱分析。...

快速 体内 真核细胞中翻译复合物的固定与分离

本方案采用一种生物发光报告基因，可实现对转录活性的检测 Saccharomyces eubayanus...

体内利用酵母生物发光报告系统监测代谢转换过程中的转录活性

了解如何使用RNA-seq技术监测酿酒酵母在缺氧反应期间的mRNA水平动态变化。该方法可应用于分析各种细胞响应中的基因表达，为研究细胞信号传导和应激反应提供可靠的实验方案。

测量酵母 S. cerevisiae 缺氧应答过程中 mRNA 水平随时间的变化

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