一种在透射电镜中获取微生物连续超薄切片的方法
2018年1月17日
本研究为在透射电子显微镜下获取无昂贵设备的微生物的连续超薄切片提供了可靠、简便的程序。
该程序的总体目标是安全、轻松地制作连续的超薄切片。这种方法可以帮助回答细胞生物学领域的关键问题，在电子显微镜水平上提供整个细胞的定量和三维结构信息。该技术的主要优点是无需昂贵的机器即可完成连续超薄切片，并且使用这种方法可以获得高分辨率图像。
要开始此过程，请清洁载玻片的表面。然后通过使用橡胶球将载玻片的一半浸入 Formvar 支撑成膜装置上柱中的 1.5% Formvar 溶液中，方法是用空气将溶液压入三通旋塞阀中。打开三通旋塞并释放空气以降低压力，以排出色谱柱中的溶液。
然后从仪器中取出载玻片，在空气中干燥，在载玻片表面形成一层薄膜。用剃须刀片刮掉载玻片上薄膜的四个边缘。在载玻片上呼吸以促进薄膜与载玻片分离后，通过将载玻片以较低的水平角度缓慢浸入水中，从薄膜上漂浮。
然后使用带孔的铝架从水中舀起 Formvar 薄膜。要在立体显微镜下用超声波修整刀片和剃须刀片修剪标本块，首先用光学显微镜观察块的尖端，确保块的表面有细胞。然后将标本块安装在卡盘中，并将卡盘安装在修整台上。
将块修剪为 0.7 x 1.0 毫米的大小。如果环氧树脂非常坚硬，请先使用超声波修整刀片修剪盒子，然后用剃须刀片进一步修剪块。切开一个肩部以标记切割方向。
要使用切片机用金刚石刀修剪标本块，请将标本块卡盘放在超薄切片机的标本架中。用金刚石修整刀切开块的表面。将金刚石刀刃平行于试样块表面，并切割最少的试样表面，以免丢失任何试样。
使用修整刀将刀台向左旋转 30 度，切开块的左边缘。在连续切片中，该边缘成为样品的上侧。然后通过将刀台向右旋转 100 度，从试样左边缘切下约 30 微米的块面。
在连续切片中，该边缘成为标本的下侧。取下修整刀，将标本块顺时针旋转 90 度。将超薄切片刀设置到切刀台。
调整试样表面和刀口，使其使用试样表面的大部分彼此平行。接下来，在切片机的卡盘和卡盘支架上贴上胶带，并在边界处剪下胶带。从切片机中取出标本卡盘，将其置于立体显微镜下。
用剃须刀片切掉标本的大部分，留下细长的部分，从中获得连续切片 使用巴斯德移液管将约 1 微升 0.5% 氯丁橡胶溶液滴到标本上，用于连续切片，使切片侧面具有粘性。然后用氯丁橡胶溶液覆盖整个样品。立即用放在样品附近的一张滤纸吸收过量的氯丁橡胶溶液。
接下来，准备三个狭缝网格用于拾取连续切片。为此，将网格的手柄弯曲 60 度，并用 0.5% 氯丁橡胶溶液处理网格。然后通过辉光放电使网格成为水生的。
通过对齐胶带部分，将标本块卡盘放回切片机中的相同位置。这使得刀座面和刀刃彼此完全平行。然后将刀靠近标本。
将刀舟装满水后，用塑料盖住切片机以防止空气流动。开始切割 200 纳米的截面厚度的样品。切割第一个部分后，将截面厚度设置为 70 纳米。
当序列截面数达到 20 时，将截面厚度设置为 10 纳米。由于切片机无法切割 10 纳米厚的切片，因此不会出现新的切片，并且先前切割的切片会与刀口分离。接下来，将截面厚度设置为 60 纳米。
这将产生 70 纳米的切片，因为机器将增加之前的 10 纳米厚度。最后，将截面厚度设置回 70 纳米，并继续切割，直到获得 1.8 毫米长的截面。要拾取串行部分，首先将部分保持环放在第三个部分组上。
然后将水面提升环放在刀台上。通过移动 WSRL 的轴和手柄，将 WSRL 的环放在串行部分的正上方。将 WSRL 的环降低到水面上，使环环绕各部分。
向下转动螺钉，将环向下推，使水面因表面张力而升高。将部分移动到 Loop 的中心。将其放置在水的顶点，并使用发丝调整截面的方向。
用裸露的狭缝网格触摸它来拾取截面组，该网格由镊子帮助并保持与水面平行。将带有切片的网格和一小滴水放在 Formvar 支撑膜上。使用滤纸去除多余的水。
切片完全干燥后，撕下网格周围的 Formvar 薄膜;并移除承载这些截面的轴网。按适当的顺序将网格设置在染色管的凹槽中，并用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色切片。以适当的顺序设置多试样夹具座中的五个网格，使网格狭缝的长轴垂直于试样夹具座轴线。
用网格固定器固定网格，然后将样品架插入透射电子显微镜中。继续以高倍率拍摄目标细胞和所有细胞切片的照片。此处显示的是五个承载连续截面的网格的低放大倍率视图。
18-25 个部分安装在一个网格上。请注意，这些截面连接在一起并且具有相同的厚度。此处显示了 pericarion 肌生成的连续切片。
该图显示了 67 个完整截面中的 12 个。发现该细胞具有一个大类核，由裸露的 DNA 纤维组成，具有单个类核膜和类似于细菌但没有线粒体的内共生体。因此，这种生物似乎是从原核生物进化为真核生物的中间生命形式。
此处显示的是大肠杆菌的连续切片。该图显示了 12 个完整的部分。有趣的是，发现该细胞包含 21， 700 个核糖体。
看完这个视频，你应该对如何制作连续超薄截面有了很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三个小时内完成。
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概述
本研究提出了在不使用昂贵设备的情况下，通过透射电子显微镜获取微生物连续超薄切片的可靠且简便的程序。该方法旨在提供电子显微镜水平下整个细胞的定量和三维结构信息。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 电子显微镜
- 微生物分析
背景
- 连续超薄切片对于详细的细胞研究至关重要。
- 传统方法通常需要昂贵的设备。
- 本研究探索了一种成本效益的替代方法。
- 高分辨率成像对于理解细胞结构至关重要。
研究目的
- 开发一种获取超薄切片的可靠方法。
- 便于获取高分辨率图像而不需要昂贵的机械。
- 增强对微生物细胞结构的理解。
使用的方法
- 清洁玻璃载玻片的表面。
- 将载玻片浸入1.5%的Formvar溶液中。
- 使用三通活塞阀控制气压。
- 排空溶液以准备切片。
主要结果
- 成功生产了连续超薄切片。
- 使用所描述的方法获得了高分辨率图像。
- 证明了该技术在不使用昂贵设备的情况下的可行性。
- 为研究细胞结构提供了新的方法。
结论
- 该方法对获取超薄切片是有效的。
- 它为研究人员提供了一种成本效益的替代方案。
- 该技术可以显著地帮助细胞生物学研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Serial ultrathin sectioning for transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution, three-dimensional analysis of microbial cell architecture, supporting early discovery and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This method provides quantitative structural data without reliance on costly automated equipment, facilitating broader access to advanced cellular imaging. Its reproducibility and precision underpin confident target validation and inform risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detailed interrogation of microbial cell structures to clarify biological pathways.
- Supports functional target validation by revealing subcellular organization at nanometer resolution.
- Provides quantitative morphological data to de-risk mechanistic hypotheses.
- Facilitates triage of targets based on structural evidence.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream imaging and analysis workflows.
- Ensures reproducibility and standardization of section thickness and orientation.
- Delivers consistent, quantitative outputs suitable for comparative studies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on cellular ultrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Aligns high-resolution imaging with disease-relevant microbial models when applicable.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing robust structural endpoints.
- Reduces translational risk by enabling direct visualization of cellular changes.
- Strengthens predictive confidence in preclinical findings.
Pipeline & Workflow Integration
This serial sectioning method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early mechanistic studies and advanced imaging-based validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of cellular architecture.
- Screening: Provides standardized, reproducible sections for quantitative imaging assays.
- Analytics: Enables precise measurement of structural features and supports statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Offers continuity of structural endpoints from in vitro models to preclinical studies when relevant.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, cost-effective capability for serial sectioning across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and enhances reproducibility without expensive automation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust structural data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ultramicrotomy and TEM sample handling.
- Needs access to standard microtomy and electron microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sectioning and imaging protocols.
- Adaptable to various microbial models with attention to specimen preparation nuances.
- Section integrity and order must be maintained to ensure reliable 3D reconstruction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Preparation of Support Film
1:53
Trimming the Specimen Block
3:31
Preparing the Specimen
4:59
Making Serial Sections
6:18
Picking up Serial Sections
7:23
Staining and Observation of Serial Sections
8:14
Results: Serial Ultrathin Sections of Microorganisms
9:18
Conclusion
