Name: 线粒体 Ca2 +保留容量检测和 Ca2 +触发的线粒体肿胀试验 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: 学习使用SH-SY5Y细胞分离线粒体进行钙离子保留容量检测和钙触发的线粒体肿胀试验。该方法通过荧光光谱和吸光度测量评估线粒体功能，为研究线粒体功能障碍和细胞能量代谢异常提供简单有效的实验方案。

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本研究由山东省杰出科学家计划项目（JQ201421）和国家自然科学基金（81371226）资助。

1. 线粒体的分离
注意：所有溶液和仪器应预冷至 0 - 4 °C，并置于冰上保存。
<ol>
	<li>在10 cm细胞培养皿中接种约3 × 106个SH-SY5Y细胞。使用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）-链霉素（100 µg/mL）的高糖Dulbecco改良Eagle培养基进行培养。于含5% CO2的培养箱中37 °C过夜培养。 
	注意：每次分离实验至少需要1 - 2 × 107个SH-SY5Y细胞。</li>
	<li>吸去培养基，用约1 mL预冷的PBS在10 cm细胞培养皿中洗涤细胞3次。</li>
	<li>向10 cm细胞培养皿中加入1 mL预冷的PBS，刮下贴壁细胞并转移至新的1.5 mL离心管中。在4 °C下以800 × g离心10分钟。</li>
	<li>在离心过程中，配制5 mL线粒体分离缓冲液（250 mM蔗糖，10 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸），10 mM KCl，1.5 mM MgCl2，1 mM EDTA），并加入50 μL蛋白酶抑制剂储备液（100倍&#160;浓度；1片无EDTA蛋白酶抑制剂片剂溶于500 µL ddH2O中）。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL线粒体分离缓冲液重悬沉淀。将1.5 mL离心管置于冰上孵育30分钟。</li>
	<li>在冰上使用玻璃匀浆器手动上下匀浆（15 - 25次）裂解悬浮细胞。 
	注意：匀浆过程中应避免产生气泡。在显微镜下目视计数完整细胞和裸露细胞核，确认细胞破裂率超过&#62;90%。</li>
	<li>将匀浆液转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟，以去除碎片（细胞核和残留的完整细胞）。</li>
	<li>将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，在4 °C下以1,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新离心管中，在4 °C下以14,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用1 mL线粒体分离缓冲液重悬含有线粒体的沉淀。</li>
	<li>在4 °C下以14,000 × g离心15分钟，沉淀线粒体。</li>
	<li>所得线粒体沉淀需保持在冰上，并根据沉淀体积用50 - 100 μL KCl培养基（125 mM KCl，2 mM K2HPO4，1 mM MgCl2，20 mM HEPES，5 mM谷氨酸，5 mM苹果酸，2 μM鱼藤酮，pH 7.4）重悬，用于后续实验。</li>
	<li>取5 μL线粒体溶液，采用标准BCA法测定线粒体蛋白浓度，使用酶标仪测定OD56213。</li>
</ol>
2. 线粒体 Ca2+ 保留能力的测定
<ol>
	<li>准备KCl培养基，并在实验前加入Ca2+-结合型绿色荧光染料，使其终浓度为0.5 μM。</li>
	<li>将1 mL分离的线粒体（0.4 mg/mL）转移至含有0.5 μM Ca2+-结合型绿色荧光染料的KCl培养基中，每孔加入一个6孔板的孔内。</li>
	<li>将含有Ca2+-结合型绿色荧光染料的线粒体在6孔板中于室温避光孵育1分钟。使用自动分配设置，向每个6孔板孔中加入4 μL的20 mM CaCl2溶液（20 mM CaCl2、127 mM KCl、1 mM MgCl2、20 mM HEPES、5 mM谷氨酸、5 mM苹果酸，pH 7.4），使每毫克线粒体蛋白引入200 nmol Ca2+。</li>
	<li>使用荧光分光光度计监测荧光变化，每3秒记录一次，持续2分钟，激发波长为506 nm，发射波长为531 nm。仪器软件控制在每次读数之间以600 rpm转速振荡3秒（图1）。</li>
	<li>向每个孔中再加入4 μL的20 mM CaCl2溶液，并每3秒监测一次荧光变化，持续2分钟。重复此步骤，直至荧光随时间增加。 
	注意：线粒体受到所添加Ca2+的刺激，表现为记录的荧光增强。当mPTP开放时，荧光随时间增加。</li>
	<li>将mPTP开放前累计加入的Ca2+总量解释为Ca2+保留能力。</li>
</ol>
3. 钙的测定 2+诱导的线粒体肿胀
<ol>
	<li>实验前准备好KCl培养基。
	<ol>
		<li>将1 mL分离的线粒体（0.4 mg/mL）置于KCl培养基中，分别加入6孔板的每个孔中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向线粒体蛋白中加入10 μL 20 mM CaCl2水溶液（500 nmol/mg线粒体蛋白），以诱导线粒体肿胀。</li>
	<li>使用软件控制的酶标仪，每3秒记录一次540 nm处吸光度的下降，持续10分钟（图2）。荧光变化是由溶质穿过线粒体内膜流入所引起的。 
	注意：540 nm处吸光度的降低对应于线粒体肿胀。若未观察到吸光度下降，可采用更长的读数间隔或延长读数时间。</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
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<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
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<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. Sun 监督了实验。Wei Li 进行了实验。Chen Zhang 和 X. Sun 撰写了论文。

本文介绍了一种简单且有效的线粒体Ca2+蓄积能力检测以及Ca2+诱导的线粒体肿胀检测方案。
进行线粒体分离时，确保所有材料和离心管均置于冰上，尤其是在细胞匀浆过程中。可使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37 °C下处理5分钟，以使细胞从培养皿上脱落。经过15至25次研磨后，必须在显微镜下观察细胞膜的完整性，并避免线粒体膜破裂。然而，我们所获得的线粒体为粗制线粒体，可通过1.0 M/1.5 M不连续蔗糖梯度离心进一步纯化获得纯化的线粒体。由于周围培养基成分浓度的影响，活细胞中线粒体的生物学特性比分离后的线粒体更接近体内（in vivo）状态。线粒体Ca2+保留能力或Ca2+诱导的线粒体肿胀实验均在供能条件下测定。为评估线粒体功能，可添加5 mM琥珀酸作为呼吸底物，替代谷氨酸和苹果酸6。
Ca2+-结合型绿色荧光染料（与Ca2+的结合亲...

线粒体是哺乳动物细胞中主要的细胞器，通过氧化磷酸化产生细胞内近95%的ATP。据报道，线粒体可螯合微摩尔浓度的Ca2+，并在ADP和无机磷酸盐存在的情况下，将ADP磷酸化以合成ATP1。当胞质Ca2+浓度超过一定阈值时，线粒体可快速摄取Ca2+，并缓慢释放。因此，功能正常的线粒体能够吸收升高的胞质Ca2+。除了参与氧化磷酸化外，线粒体内的Ca2+还参与调控胞质钙信号，并通过诱导线粒体内膜上mPTP的开放来激活线粒体介导的凋亡机制2。目前普遍认为，细胞内Ca2+浓度异常升高可通过打开mPTP导致线粒体发生显著肿胀3。因此，本实验方案旨在通过定量测定线粒体Ca2+的保留能力以及Ca2+诱导的线粒体肿胀，来评估线粒体功能。
Ca2+滞留能力用于衡量线粒体摄取胞质钙离子的能力。线粒体可通过摄取钙离子形成无活性的沉淀物，从而缓冲胞质游离钙浓度，并调控钙依赖性细胞过程。在与能量受限相关的应激现象甚至神经退行性疾病中，均会出现Ca2+滞留能力受损4,5。可通过分离的线粒体或经皂苷（digitonin）透化的细胞来测定Ca2+滞留能力，而添加谷氨酸和苹果酸后，分离线粒体积累Ca2+的能力增强，这一特性不受线粒体分离操作的影响6。应使用经滴定确定的适量皂苷处理不同类型细胞，以实现细胞质膜的选择性透化。Ca2+结合型绿色荧光染料的六钾盐是一种对Ca2+敏感、细胞不可渗透、可在可见光激发下检测的指示剂，已被广泛应用7。该Ca2+结合型绿色荧光染料为低亲和力指示剂，可用于显示在长时间（5分钟）刺激过程中，细胞内游离Ca2+浓度持续上升的现象8。该方法相比放射性滤膜技术灵敏度较低，但操作显著简化。外源添加的Ca2+会使钙绿染料荧光增强，而线粒体对Ca2+的摄取则使荧光恢复至基线水平。通过连续多次添加Ca2+，直至线粒体无法再摄取胞外Ca2+为止9。可使用荧光酶标仪连续监测钙绿染料的荧光信号变化。
钙2+累积后，线粒体发生去极化，将钙2+释放到培养基中，并开始肿胀。由钙2+触发的线粒体肿胀可用于指示线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放。可通过电子显微镜观察以及在540 nm处光吸收度的降低来检测钙2+触发的线粒体肿胀10,11。线粒体体积还可通过前向角光散射技术直接测定12，其中吸收度的降低反映了线粒体基质的被动性肿胀。
本文阐述了检测SH-SY5Y细胞分离线粒体中线粒体Ca2+保留能力及Ca2+诱导线粒体肿胀的方法。

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y 细胞系</td><td>ATCC（全球生物资源中心）</td><td>ATCC 编号：CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>钙绿-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;结合型绿色荧光染料</td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂</td><td>Roche 分子生化公司</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>玻璃匀浆器</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>苹果酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>鱼藤酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Flash 仪器</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>棒曲霉素</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>乌头苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>高糖 Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>含 4.5 g/L 葡萄糖、L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA 检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 细胞培养皿</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

线粒体 ca2+ 保留能力检测与 ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

通过氧化磷酸化生成ATP是线粒体的主要功能。在高等真核生物中，线粒体还参与细胞质Ca2+的缓冲作用，且线粒体内游离Ca2+浓度可介导线粒体的ATP生成。Ca2+保留能力可被视为线粒体在基质中保留钙的能力。细胞内Ca2+的积累会导致线粒体内膜通透性增加，称为线粒体通透性转换孔（mPTP）的开放，从而引起分子量小于1.5 kDa的分子泄漏。由Ca2+触发的线粒体肿胀可用于指示mPTP的开放。本文描述了两种用于检测分离线粒体中Ca2+保留能力和Ca2+触发的线粒体肿胀的实验方法。在加入一定量的Ca2+后，所有步骤均可在一天内完成，并由酶标仪记录结果。因此，这两种简单而有效的检测方法可用于评估与Ca2+相关的线粒体功能。

Ca的代表性结果2+ 保留能力： 
结果以荧光值表示。通过额外的 Ca 脉冲2+ （200 nmols/mg 线粒体蛋白），随着mPTP开放，荧光强度较基线水平增加了一倍。 5 μM 邦克列酸（BKA），一种Ca2+-诱导的mPTP开放，或 1 μM atractyloside（ATR），一种Ca的激活剂2+诱导的mPTP开放，在分离的线粒体中加入。所加入的总钙量2+ 直到mPTP开放，表现为荧光强度较基线水平升高两倍，被解读为Ca2+ 保留能力。我们的数据显示，线粒体 Ca2+ BKA治疗组的保留能力远高于ATR组。这些数据证实了线粒体Ca测量的适宜性2+ 保留能力（图3).
Ca<su...

本方案旨在逐步描述一种检测SH-SY5Y细胞分离线粒体的Ca2+保留能力及Ca2+诱导线粒体肿胀的方法。

线粒体 Ca2+ 保留能力检测与 Ca2+ 诱导的线粒体肿胀检测

通过氧化磷酸化生成ATP是线粒体的主要功能。在高等真核生物中，线粒体还参与……

本实验的总体目标是测定钙诱导线粒体肿胀过程中的线粒体钙保留能力。该方法有助于回答线粒体功能障碍研究中的关键问题，例如异常的能量代谢。该技术的主要优势在于其操作简便且高效。首先，在每个10厘米细胞培养皿中接种约三百万个SH-SY5Y细胞。移除培养基，用约一毫升预冷的PBS在10厘米细胞培养皿中洗涤细胞三次。向10厘米细胞培养皿中加入一毫升预冷的PBS，刮取贴壁细胞并转移至新的1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以800 × g离心10分钟。离心期间，准备5毫升线粒体分离缓冲液，并加入50微升蛋白酶抑制剂储备液。弃去上清液，用1毫升线粒体分离缓冲液重悬沉淀。将1.5毫升离心管置于冰上孵育30分钟。然后，在冰上使用玻璃匀浆器手动上下反复吹打，裂解悬浮细胞。将匀浆液转移至1.5毫升离心管中。然后，在 4°C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，以去除碎片。离心后，将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中，再按前述条件进行一次离心。将上清液转移至新管后，在 4°C 条件下以 14,000 × g 离心 15 分钟。吸除上清液，并用一毫升线粒体分离缓冲液重新悬浮含有线粒体的沉淀。然后在4°C条件下以14,000 × g离心15分钟，使线粒体沉淀。所得的线粒体沉淀必须置于冰上保存，并根据沉淀体积用50至100微升氯化钾培养基重新悬浮，以用于后续检测。最后，取5 µL线粒体溶液，采用标准BCA法测定线粒体蛋白浓度，使用酶标仪测定OD562。实验前配制氯化钾介质，并加入钙结合绿色荧光染料，使其终浓度为0.5 µmol。为测定线粒体钙保留能力，首先将1 mL悬浮于含0.5 µmol钙结合绿色荧光染料的氯化钾介质中的分离线粒体转移至6孔板的每个孔中。将线粒体与钙结合绿色荧光染料在六孔板中于室温避光孵育一分钟。孵育结束后，使用自动分配设置，向六孔板的每孔加入4微升20毫摩尔氯化钙溶液，使每毫克线粒体蛋白引入200纳摩尔钙。采用荧光分光光度计，以506纳米为激发波长、531纳米为发射波长，每三秒监测一次荧光变化，持续两分钟。该培养板配备由软件控制的振荡功能，每次读数之间以600 rpm振荡三秒。向每个孔中再加入4微升20毫摩尔氯化钙溶液，然后每三秒监测一次荧光变化，持续两分钟。为检测钙诱导的线粒体肿胀，将1毫升悬浮于氯化钾培养基中的分离线粒体加入六孔板的每个孔中。然后，向线粒体蛋白中加入 10 微升 20 毫摩尔的氯化钙水溶液，以诱导线粒体肿胀。使用由软件控制的酶标仪，在 540 纳米波长下每 3 秒记录一次吸光度的降低，持续 10 分钟。此处展示了短杆菌肽（bongkrekic acid，一种钙诱导的线粒体通透性转换孔（MPTP）开放抑制剂）、乌头酸苷（atractyloside，一种钙诱导的 MPTP 开放激活剂）以及空白对照的线粒体钙保留能力的代表性结果。在孔霉素处理组中，其能力远高于乌头苷组，符合预期。此处展示了孔霉素、乌头苷以及未处理对照组中钙诱导线粒体肿胀的代表性结果。在540纳米波长下监测到的吸光度降低表明线粒体发生肿胀。结果表明，BKA 可抑制 MPTP 的开放，而 ATR 可促进 MPTP 的开放。只要熟练掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行该操作时，务必记住将所有溶液保持在冰上。

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

科研

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Neuroscience

神经科学

线粒体 Ca2 +保留容量检测和 Ca2 +触发的线粒体肿胀试验

本方案描述了一种通过荧光成像实时测量线粒体钙流的方法。该方法利用一种基于环状重排黄色荧光蛋白（YFP）的双激发比率型钙离子探针（ratiometric...

利用基因编码钙传感器监测细胞凋亡过程中线粒体钙水平的动态变化

本文介绍了一种利用光谱荧光法测定分离的小鼠心脏线粒体中线粒体通透性转换孔开放的实验方案。该检测方法包括同时测量线粒体的Ca2+处理能力、线粒体膜电位以及线粒体体积。同时，还描述了获取高质量且具有功能活性的心脏线粒体的操作步骤。...

离体小鼠心脏线粒体通透性转换孔开放的多参数测量

本视频介绍了一种基于酶标仪的检测方法，用于测量分离线粒体中的线粒体钙离子摄取。该方法通过分析钙敏感性荧光染料的荧光信号，研究线粒体钙离子摄取的动力学过程以及钙超载现象。...

线粒体钙摄取检测：一种基于酶标仪的分离线粒体钙摄取测量方法

本视频介绍了一种基于共聚焦显微镜成像的检测方法，用于测量培养细胞中的线粒体钙离子摄取。该检测方法利用钙离子敏感的荧光染料...

用于测定培养细胞中线粒体钙摄取的钙离子内流检测法

本视频展示了通过监测线粒体摄取钙离子时荧光的实时变化，来评估线粒体钙保留能力的操作流程。该检测方法可用于研究线粒体功能及与钙离子相关的过程，包括细胞凋亡和神经退行性疾病。...

测定分离线粒体的钙保留能力

线粒体可利用其内膜上的电化学势能（ΔΨm）来摄取钙离子（Ca2+），从而调控细胞质内的Ca2+信号。本文介绍一种利用荧光染料和共聚焦显微镜在活细胞中同时检测线粒体Ca2+摄取和ΔΨm的方法。...

活细胞中线粒体钙与线粒体膜电位的荧光显微镜同步检测

本文介绍了两种用于测量分离线粒体和培养细胞中线粒体 Ca2+ 内流的实验方案。针对分离的线粒体，我们详细描述了一种基于酶标仪的 Ca2+ 摄取检测方法，该方法使用对 Ca2+ 敏感的染料钙绿素绿-5N（calcium green-5N）。对于培养细胞，我们描述了一种使用 Ca2+ 染料 Rhod-2/AM...

分离线粒体与培养细胞中线粒体钙离子内流的分析

在本研究中，我们描述了一种改进的实验方案，通过使用重组的perfringolysin...

测量重组Perfringolysin O透化细胞中的线粒体底物通量

本方案旨在提供一种方法 体外 和 体内 线粒体 Ca2+...

成像线粒体 Ca2+ 星形胶质细胞和神经元中利用基因编码Ca探针检测摄取2+ 指示剂（GECIs）

本方案描述了一种比较性检测方法，通过检测在有或无 Na+ 存在条件下线粒体复合物 CI+CIII 和 CII+CIII...

线粒体内膜对 Na+ 的敏感性揭示了功能型辅酶Q池的部分区室化

本文介绍了一系列检测方法，用于独立于哺乳动物细胞消耗分子氧能力之外直接测量其线粒体功能。...

不依赖氧气的哺乳动物线粒体功能检测方法

学习使用SH-SY5Y细胞分离线粒体进行钙离子保留容量检测和钙触发的线粒体肿胀试验。该方法通过荧光光谱和吸光度测量评估线粒体功能，为研究线粒体功能障碍和细胞能量代谢异常提供简单有效的实验方案。

线粒体 Ca²⁺ 保留能力检测与 Ca²⁺ 诱导的线粒体肿胀检测

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