线粒体 Ca²⁺ 保留能力检测与 Ca²⁺ 诱导的线粒体肿胀检测

本实验的总体目标是测定钙诱导线粒体肿胀过程中的线粒体钙保留能力。该方法有助于回答线粒体功能障碍研究中的关键问题，例如异常的能量代谢。该技术的主要优势在于其操作简便且高效。

首先，在每个10厘米细胞培养皿中接种约三百万个SH-SY5Y细胞。移除培养基，用约一毫升冰浴PBS在10厘米细胞培养皿中清洗细胞三次。向10厘米细胞培养皿中加入一毫升冰浴PBS，刮取贴壁细胞并转移至新的1.5毫升离心管中。

在4°C条件下，以800 × g离心10分钟。离心期间，准备5毫升线粒体分离缓冲液，并加入50微升蛋白酶抑制剂储备液。弃去上清液，用1毫升线粒体分离缓冲液重悬沉淀。

将1.5毫升离心管置于冰上孵育30分钟。然后，在冰上使用玻璃匀浆器手动上下抽吸裂解悬浮细胞。将匀浆液转移至1.5毫升离心管中。

然后，在 4°C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，以去除碎片。离心后，将上清液转移至新的 1.5 毫升离心管中，再按前述条件进行一次离心。将上清液转移至新管后，在 4°C 条件下以 14,000 × g 离心 15 分钟。

吸去上清液，用1毫升线粒体分离缓冲液重悬含有线粒体的沉淀。然后在4°C条件下，以14,000 × g离心15分钟，使线粒体沉淀。所得的线粒体沉淀须置于冰上保存，并根据沉淀体积用50至100微升氯化钾培养基重悬，再进行后续检测。

最后，取5 µL线粒体溶液，采用标准BCA法测定线粒体蛋白浓度，使用酶标仪测定OD562。实验前配制氯化钾介质，并加入钙结合绿色荧光染料，使其终浓度为0.5 µmol/L。为测定线粒体钙保留能力，首先将1 mL悬浮于含0.5 µmol/L钙结合绿色荧光染料的氯化钾介质中的分离线粒体转移至6孔板的每个孔中。

将线粒体与钙结合绿色荧光染料在六孔板中于室温下孵育，避光孵育1分钟。孵育结束后，使用自动分配设置向六孔板的每个孔中加入4微升20毫摩尔氯化钙溶液，使每毫克线粒体蛋白引入200纳摩尔钙。使用荧光分光光度计监测荧光变化，每3秒记录一次，持续2分钟，激发波长为506纳米，发射波长为531纳米。

该培养板配备由软件控制的振荡功能，每次读数之间以600 rpm振荡三秒。向每个孔中再加入4微升20毫摩尔/升的氯化钙溶液，然后每三秒监测一次荧光变化，持续两分钟。为检测钙诱导的线粒体肿胀，将1毫升悬浮于氯化钾培养基中的分离线粒体转移至六孔板的每个孔中。

然后，向线粒体蛋白中加入 10 微升 20 毫摩尔的氯化钙水溶液，以诱导线粒体肿胀。使用由软件控制的酶标仪，在 540 纳米波长下每 3 秒记录一次吸光度的降低，持续 10 分钟。此处展示了邦克列酸（bongkrekic acid，一种钙诱导的线粒体通透性转换孔（MPTP）开放抑制剂）、乌头苷（atractyloside，一种钙诱导的 MPTP 开放激活剂）以及空白对照的线粒体钙保留能力的代表性结果。

与预期一致，山道年酸处理组的容量明显高于乌头苷组。此处展示了山道年酸、乌头苷以及未处理对照组诱导钙离子介导的线粒体肿胀的代表性结果。在540纳米波长下监测到的吸光度降低表明线粒体发生了肿胀。

结果表明，BKA 可抑制 MPTP 的开放，而 ATR 可促进 MPTP 的开放。只要熟练掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在进行该操作时，务必记住将所有溶液置于冰上保存。