Name: 腺相关病毒和共聚焦显微镜对器官脑切片胶质细胞器的可视化和实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 了解腺相关病毒转导和延时成像技术，用于器官型脑切片中少突胶质细胞线粒体动态的可视化研究。该方法有助于深入理解少突胶质细胞结构及其细胞器在完整脑组织环境中的动态变化。

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感谢Linda Hildegard Bergersen和Magnar Bjørås提供细胞实验室及设备的使用权限，感谢Janelia分子生物学共享资源团队在质粒和病毒制备方面的支持，以及Koen Vervaeke在激光功率测量方面的协助。本工作由挪威健康协会、挪威研究理事会资助，显微镜设备由Norbrain资助。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文所述的类器官培养方案是De Simoni和Yu（2006）5所描述方案的一种改良版本18。最重要的修改内容如下：在培养基中添加了Tris缓冲液，这可改善脑片在孵育箱外进行病毒转导和更换培养基期间的存活状态。此外，对confetti（载片）的灭菌程序也进行了调整。虽然其他方案采用高压灭菌法对confetti进行灭菌，但我们不推荐此方法，因为它会导致部分confetti发生卷曲。应避免使用卷曲的confetti，因为在这些载片上培养的脑片通常健康状况较差。本方案使用小鼠而非大鼠，并针对大脑皮层而非海马体进行培养，我们发现该调整适用于更薄的脑片（230 µm vs 300 µm）。由于小鼠和大鼠出生后第10至20天左右髓鞘化达到高峰19，因此使用出生后第7至9天（p7-9）的小鼠制备培养物，并继续培养11至14天，是研究成髓鞘少突胶质细胞的最佳选择。在体外培养11至14天后，培养物中包含多个具有致密髓鞘结构的成熟少突胶质细胞13。使用更年轻小鼠制备的...

大脑的白质由被髓鞘包裹的神经细胞轴突构成，髓鞘是由少突胶质细胞形成的特化延伸的质膜。髓鞘对于动作电位的快速可靠传导以及有髓轴突的长期存活至关重要，髓鞘的丧失可导致神经系统功能障碍。尽管少突胶质细胞具有重要功能，但其特性相较于神经元和星形胶质细胞仍了解较少，因此针对少突胶质细胞的研究工具也相对匮乏。
对线粒体、内质网（ER）或不同囊泡结构等细胞器进行活体成像，有助于研究细胞器随时间发生的动态变化。传统上，少突胶质细胞的活体成像通常在单细胞培养体系中进行1,2。然而，单层培养中的少突胶质细胞并不形成致密的髓鞘结构，因此在研究细胞器的定位与运动时，脑组织切片（包括器官型或急性切片）可能是更优的选择。由于有髓轴突与周围髓鞘之间的距离极短，在髓鞘中对小型细胞器和蛋白质进行精确定位具有挑战性。因此，仅依靠光学显微镜下的免疫染色方法，其空间分辨率不足以区分位于髓鞘内的细胞器与轴突内的细胞器。这一问题可通过病毒转导技术加以解决，即利用细胞类型特异性启动子驱动靶向特定细胞器的荧光蛋白基因表达。该方法的优势在于可实现细胞特异性且稀疏的表达，从而精确评估细胞器的定位与动态行为。转基因动物也可用于实现此类细胞器靶向的细胞特异性表达3。然而，转基因动物的制备与维持成本较高，且通常难以达到病毒方法所能实现的稀疏表达水平。
本文所述方法利用病毒转导技术，将由髓鞘碱性蛋白启动子驱动的线粒体靶向荧光蛋白（dsred 或绿色荧光蛋白 GFP）导入少突胶质细胞（MBP-mito-dsred 或 MBP-mito-GFP），以在脑组织切片中可视化少突胶质细胞的线粒体。此外，通过在细胞质中表达另一种荧光蛋白（将 GFP 与 mito-dsred 联用，或将 tdtomato 与 mito-GFP 联用），可实现对细胞形态的观察，包括髓鞘的细胞质区域。本实验方案包含制备脑组织切片的步骤（对 De Simoni 和 Yu 于 2006 年描述的方案4,5进行了改良）。随后，我们介绍了用于研究线粒体运动的延时成像流程。该流程使用直立式共聚焦显微镜，并持续更换成像介质，此设置便于在成像过程中施加药物或其他培养基变化。延时成像可在任意共聚焦显微镜上进行，但需配备如下文所述的额外设备以维持组织切片的活性。本方案还包含多项优化成像效果并降低光毒性的实用建议。
最后，本文介绍了一种利用共聚焦反射显微镜（CoRe）快速、简便地观察未染色髓鞘的方法。该方法可用于活体成像过程中识别髓鞘结构。近年来，已开发出多种无需染色即可成像髓鞘的技术，但大多数技术需要特定的设备和专业知识6,7,8。此处描述的方法基于髓鞘的反射特性，是光谱共聚焦反射显微镜（SCoRe）的一种简化单激发波长版本（SCoRe通过组合多个激光波长来实现髓鞘成像）9。只要共聚焦显微镜配备488 nm激光器以及470–500 nm带通发射滤光片或可调发射滤光片，即可进行CoRe成像。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 19G</td><td>BD</td><td>301500</td><td>用于灌流槽进出液的针头</td></tr><tr><td>二氧化碳气体</td><td>AGA</td><td>105701</td><td></td></tr><tr><td>Brand 移液球</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z615927</td><td>移液球</td></tr><tr><td>本生灯（液态丙烷燃烧器）</td><td>VWR</td><td>89038-530</td><td></td></tr><tr><td>加热器控制器用电缆组件</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0106&amp;nbsp;</td><td>温度控制器—温度计部分</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>21100</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>AGA</td><td>100309</td><td>用于培养箱的CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>盖玻片，方形 Corning</td><td>Thermo&amp;nbsp; Fischer Scientific</td><td>13206778</td><td>用于灌流槽下方活体成像。用胶水或凡士林密封。</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Finescience</td><td>11063-07</td><td>用于解剖</td></tr><tr><td>钻石刻划笔</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>54463</td><td></td></tr><tr><td>一次性玻璃巴斯德移液管 230 mm</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td>玻璃移液管</td></tr><tr><td>双刃不锈钢剃刀刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#7200</td><td>用于振动切片机的刀片</td></tr><tr><td>Earle's 平衡盐溶液 (EBSS)</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>24010-043</td><td></td></tr><tr><td>滤纸圆片</td><td>Schleicher &amp; Schuell</td><td>300,220</td><td>用于PFA过滤的滤纸</td></tr><tr><td>可塑性粘土</td><td>Loctite</td><td>1270884</td><td>用于连接/调节灌流槽中进出液管的位置</td></tr><tr><td>C型折叠手巾 2</td><td>Katrin</td><td>344388</td><td></td></tr><tr><td>RC-41 型灌流槽用平网架</td><td>Warner Instruments</td><td>&amp;nbsp;64-1418</td><td>用于固定灌流槽中的组织样本。在用于器官型切片前需剪断网线。1.5 mm，13 mm，SHD-41/15</td></tr><tr><td>HEPES，分子量：260.3</td><td>Sigma</td><td>H-7006</td><td></td></tr><tr><td>Holten LaminAir，型号 1.2</td><td>Heto-Holten</td><td>96004000M</td><td>层流罩</td></tr><tr><td>马血清，热灭活</td><td>Gibco-Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>LCR 膜，PTFE&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>FHLC0130</td><td>Confetti&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Leica VT1200</td><td>Leica</td><td>14048142065</td><td>振动切片机</td></tr><tr><td>含 HEPES 的 MEM-Glutamax</td><td>Thermo&amp;nbsp; Fischer Scientific</td><td>42360024</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>R.P. Normapur</td><td>25 108.295</td><td></td></tr><tr><td>Heyman B 型微型勺</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62411-B</td><td>小型圆头刮铲，末端锋利，用于解剖</td></tr><tr><td>Millex-GP 滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SLGPM33RA</td><td>注射器滤器单元</td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养插件，30 mm</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td>细胞培养插件</td></tr><tr><td>Minipuls 3 调速控制模块</td><td>GILSON</td><td>F155001</td><td>用于活体成像的蠕动泵—控制模块部分（需连接双通道泵头）</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>71628</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta 表面</td><td>Thermo&amp;nbsp; Fischer Scientific</td><td>140675</td><td>培养板</td></tr><tr><td>制霉菌素混悬液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>物镜 W &quot;Plan-Apochromat&quot; 40x/1.0 DIC&amp;nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>441452-9900-000&amp;nbsp;</td><td>用于活体成像的水浸物镜（工作距离=2.5 mm），可见光-红外光</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>VWR</td><td>291-1211</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，颗粒状</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#19208</td><td></td></tr><tr><td>PC-R 灌流室</td><td>SiSkiYou</td><td>&amp;nbsp;15280000E</td><td>用于活体成像的灌流槽</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，液体</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 140 mm&amp;nbsp;</td><td>Heger</td><td>1075</td><td>大培养皿&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿 92x16 mm&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt&amp;nbsp;</td><td>82.1473</td><td>中等培养皿&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>培养皿 55x14.2 mm</td><td>VWR</td><td>391-0868</td><td>小培养皿</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td>PBS 片剂</td></tr><tr><td>R2 双通道泵头&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>F117800</td><td>用于活体成像的蠕动泵—双通道泵头部分（需配合控制模块使用）</td></tr><tr><td>不锈钢圆头/平头刮铲</td><td>VWR</td><td>82027-528</td><td>用于解剖的大刮铲</td></tr><tr><td>砂纸</td><td>VWR</td><td>MMMA63119</td><td>可选，用于打磨断裂的玻璃移液管</td></tr><tr><td>剪刀，&amp;nbsp;17.5 cm</td><td>Finescience</td><td>14130-17</td><td>用于解剖的大剪刀</td></tr><tr><td>剪刀，8.5&amp;nbsp;cm</td><td>Finescience</td><td>14084-08</td><td>用于解剖的小型锋利剪刀&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>单刃宝石刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>#71972</td><td>单刃剃刀刀片</td></tr><tr><td>SH-27B 单通道溶液加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td>温度控制器—加热部分</td></tr><tr><td>Steritop-GP 滤器单元，500 ml，45 mm</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>用于溶液灭菌的滤器</td></tr><tr><td>精密瞬间胶</td><td>Loctite</td><td>1577386</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 22 号</td><td>Swann Morton Ltd.</td><td>209</td><td>圆头手术刀片</td></tr><tr><td>温度控制器 TC324B</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0100</td><td>用于活体成像的温度控制器（需配合溶液加热器和电缆组件）</td></tr><tr><td>Trizma 基础</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>II 型水套式培养箱</td><td>Forma Scientific</td><td>78653-2882</td><td>培养箱</td></tr></tbody></table>

利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片培养中少突胶质细胞器的可视化与活体成像

腺相关病毒，共聚焦显微镜，脑片培养，少突胶质细胞，细胞器，活体成像，髓鞘

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

神经元依赖于髓鞘化少突胶质细胞提供的电绝缘和营养支持。尽管少突胶质细胞具有重要意义，但目前用于研究神经元的先进工具在少突胶质细胞研究中仅得到部分应用。通过病毒转导实现细胞类型特异性标记是研究活细胞器动态的有效方法。本文介绍了一种利用腺相关病毒（AAV）转导技术在脑片器官型培养中可视化少突胶质细胞线粒体的实验方案，该病毒携带在髓鞘碱性蛋白启动子转录调控下的线粒体靶向荧光蛋白基因。文中包括制备小鼠冠状脑片器官型切片的详细步骤，随后介绍了线粒体延时成像的操作流程。这些方法可推广至其他细胞器，并可能特别适用于研究髓鞘中的细胞器。最后，我们介绍了一种易于实现的、通过共聚焦反射显微镜（CoRe）在活体脑片中直接观察未染色髓鞘的技术。CoRe技术无需额外设备，可在活体成像过程中有效识别髓鞘结构。

按照上述方法培养和转导的脑组织切片显示，表达 mito_dsred 和 GFP 的皮层少突胶质细胞呈稀疏分布。使用针对 Olig2 和 MBP 的抗体进行免疫染色证实，该表达特异性地存在于少突胶质细胞中（图1）。
进行活体成像时，通过其多个平行排列的髓鞘特征性形态可识别出被转导的少突胶质细胞（图1 和 图2A）。对转导的少突胶质细胞进行延时成像，可监测线粒体在初级突起和髓鞘中的运动（图2B–D）。
在GFP表达水平较低的细胞中，可通过在488 nm波长下激发样本并...

髓鞘形成少突胶质细胞可促进动作电位的快速传导以及神经元的存活。本文描述了一种在脑片组织切片中实现少突胶质细胞特异性表达荧光蛋白的实验方案，并可进行后续的时间序列成像。此外，还介绍了一种简单的方法用于可视化未染色的髓鞘结构。

神经元依赖于髓鞘化少突胶质细胞提供的电绝缘和营养支持。尽管少突胶质细胞具有重要作用，但其高级……

本病毒转导与延时记录实验的总体目标是可视化观察少突胶质细胞线粒体在脑片组织切片中的运动。该方法有助于回答少突胶质细胞研究领域中的关键问题，例如少突胶质细胞及其细胞器如何响应局部环境的变化。该技术的主要优势在于，它能够在保留所有不同类型脑细胞并形成致密髓鞘的脑片组织中，提供关于少突胶质细胞结构和细胞器动态的详细信息。在体外培养第7天对切片培养物中的少突胶质细胞进行转导。每片切片吸取1.3 µL稀释后的AAV病毒液。确保移液枪头外壁干燥，将移液枪置于皮层上方，尽可能接近切片但不接触切片表面，并缓慢将溶液推出枪头。当溶液接触到切片时，将枪头在皮层区域移动，使溶液均匀覆盖整个皮层区域。当一个培养皿中的所有切片完成转导后，将培养皿放回培养箱，随后对其他培养皿重复该过程。检查切片中荧光标记物的表达情况，在荧光标记物表达水平足够且切片状态良好时进行成像。开始准备成像用灌流槽：使用建模黏土固定弯曲成45°的注射器针头

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Neuroscience

神经科学

腺相关病毒和共聚焦显微镜对器官脑切片胶质细胞器的可视化和实时成像

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

颅内注射腺相关病毒载体

本方案描述了一种针对出生后大脑优化的器官型脑片实验方法，可用于对嗅束迁移流中神经母细胞迁移进行高分辨率的时间推移成像。...

一种用于出生后大脑神经元迁移高分辨率延时成像的器官型脑片实验方法

来源：Kennedy, L. H., 等人 利用腺相关病毒和共聚焦显微镜对脑片中少突胶质细胞细胞器进行可视化与活体成像 视频实验杂志...

器官型脑切片培养中少突胶质细胞内线粒体运动的共聚焦成像

来源： Moye, S. L., et.al. 利用荧光黄电泳技术可视化星形胶质细胞形态。 J. Vis. Exp. (2019)。...

使用荧光染料电泳法在固定的小鼠脑切片中可视化星形胶质细胞形态

本文介绍了一种利用前脑和小脑脑片培养系统研究NG2细胞和少突胶质细胞的技术。该方法可在保持组织细胞结构完整性的同时，通过简便地调控细胞外环境，观察少突胶质细胞谱系中细胞增殖与分化的动态过程。...

用于研究少突胶质细胞动态及髓鞘形成的器官型脑片培养技术

为了研究炎性脱髓鞘疾病皮层病变中脱髓鞘和神经元凋亡的机制，需采用不同的动物模型。本文介绍一种离体（ex vivo）方法，即将少突胶质细胞特异性的CD8+...

一个 离体 少突胶质细胞靶向性T细胞攻击在急性脑切片中的模型

本文介绍了一种改良的滚管法，可用于对啮齿类动物脑片进行长期培养，并在光刻蚀盖玻片上实现精确复位的间歇性高分辨率成像。该方法能良好维持神经元的存活率和脑片的形态结构。文中还展示了利用该完全封闭系统，结合病毒实现细胞类型特异性表达的应用实例。...

封闭系统中长期培养脑片期间实现精确定位与重复间歇成像的改良滚筒管法

我们描述了一种在小鼠前脑器官型脑片培养物中实现基因编码的基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK细胞类型特异性表达的实验方案。此外，我们展示了如何利用该传感器对神经元和星形胶质细胞中的细胞ATP水平进行动态成像。...

使用基于FRET的传感器ATeam1.03YEMK对小鼠脑组织切片中细胞内ATP进行成像

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。...

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

了解腺相关病毒转导和延时成像技术，用于器官型脑切片中少突胶质细胞线粒体动态的可视化研究。该方法有助于深入理解少突胶质细胞结构及其细胞器在完整脑组织环境中的动态变化。

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