Name: 哺乳动物细胞基态衰竭超分辨成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习使用基态衰竭超分辨显微技术对哺乳动物细胞中的膜蛋白进行高分辨率成像和定量分析。该方法突破衍射极限，分辨率比传统荧光显微镜提高约十倍，有助于精确研究细胞生物学和膜生物物理学中的蛋白质分布。

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本研究工作获得了美国心脏协会（AHA）向 R.E.D. 提供的资助（15SDG25560035）。作者谨此感谢 Fernando Santana 博士提供其 Leica SR GSD 3D 显微镜的使用权限，以及 Johannes Hell 博士慷慨提供 FP1 抗体。

1. 清洗玻璃盖玻片
<ol>
	<li>样品处理前一天，将 #1.5 玻璃盖玻片置于 1 M KOH 溶液中进行超声处理 1 小时，以去除盖玻片上可能存在的任何荧光污染物。
	<ol>
		<li>用去离子水彻底冲洗盖玻片上的 KOH。</li>
		<li>经 KOH 清洗后，将盖玻片保存在 70% 乙醇中，直至使用前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 包被玻璃盖玻片
注意：本节步骤应在细胞培养罩内进行，以防止污染。
<ol>
	<li>使用镊子从70%乙醇溶液中取出单个盖玻片，并迅速过火以去除多余液体。将盖玻片放入6孔板中。若在培养罩内过火不可行，可考虑用去离子水冲洗盖玻片后进行高压灭菌，和/或在培养罩内通过紫外灯照射至少30分钟进行灭菌。</li>
	<li>为促进细胞贴附，于室温下用无菌的0.01%多聚赖氨酸（poly-L-lysine）处理盖玻片1小时。</li>
	<li>吸除多聚赖氨酸溶液，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗盖玻片。自然晾干后，置于冰箱中过夜。</li>
	<li>次日早晨，从冰箱中取出盖玻片，并加入300 µL浓度为50 µg/mL的层粘连蛋白（laminin），室温孵育至少30分钟。确保层粘连蛋白被小心地直接加在盖玻片表面。 
	注意：此层粘连蛋白处理步骤对COS-7细胞或HEK293细胞并非必需，但分离的心室肌细胞需要该步骤。其他原代细胞，如血管平滑肌细胞或神经元，可能在胶原蛋白或纤连蛋白包被的盖玻片上贴附效果更佳。</li>
</ol>
3. 细胞的制备
<ol>
	<li>培养细胞
	<ol>
		<li>在10 cm培养皿中，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（PS）溶液的10 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）培养COS-7细胞（或选用的其他细胞系）。将细胞置于37 °C、5% CO₂的细胞培养孵箱中培养2.</li>
		<li>当细胞达到90%融合度时，从10 cm培养皿中收集细胞，吸除DMEM培养基，加入5 mL 0.05%胰蛋白酶-EGTA溶液。待细胞开始变圆并脱落时，立即用添加了补剂的DMEM中和胰蛋白酶。
		<ol>
			<li>使用5 mL刻度吸管从培养皿中移除细胞。将培养基反复吹打培养皿底部数次，以去除仍贴壁的细胞，并使细胞在培养基中均匀分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞接种于35 mm培养皿中，使其融合度达到70%以进行转染。用新鲜的DMEM/FBS/PS溶液将培养皿中的培养基体积补至2 mL。</li>
		<li>将目标质粒DNA构建体转染至COS-7细胞中（例如，使用合适的转染试剂，按照制造商说明书将 sec61β-mCherry 质粒转染。 
		注意：蛋白表达可能需要 24–48 小时，具体时间取决于所使用的质粒和/或转染试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年小鼠心室肌细胞
	<ol>
		<li>采用成熟的兰格多夫灌注法分离成年小鼠心室肌细胞6将获得的心肌细胞沉淀重悬于添加了2.5% FBS和1% PS的Medium 199（M199）中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞接种
<ol>
	<li>转染的COS-7细胞
	<ol>
		<li>从35 mm培养皿中吸出2 mL DMEM/FBS/PS溶液，加入1 mL无Ca2+ PBS。将培养皿放回培养箱孵育2分钟。先吸除无Ca2+ PBS，然后加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EGTA溶液，收集培养皿中的细胞。
		<ol>
			<li>当细胞开始变圆并脱落时，立即用1 mL完全DMEM中和胰蛋白酶。轻轻吹打数次，确保转染的细胞在2 mL胰蛋白酶-EGTA-DMEM悬浮液中均匀分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将转染的COS-7细胞以适当密度接种到预先涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上，以便观察单个细胞，并用DMEM/FBS/PS补足培养皿内液体至2 mL（例如，向盖玻片上加入90 µL细胞悬液，再加入1,910 µL完全DMEM，轻摇培养皿使细胞均匀分布）。 
		注意：无需计数细胞，但加入每皿的细胞体积需根据细胞融合度进行调整。</li>
		<li>将接种后的细胞放回细胞培养箱过夜，使其贴壁并恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年小鼠心室肌细胞
	<ol>
		<li>吸除层粘连蛋白，将肌细胞以适当密度直接接种到包被的盖玻片上，以便观察单个细胞。接种密度取决于分离所得活细胞的浓度。</li>
		<li>在盖玻片上形成细胞悬液液滴，置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中孵育约45分钟，以促进细胞贴附。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 细胞固定
<ol>
	<li>从培养箱中取出细胞，并小心吸除培养基。
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗贴壁细胞一次。</li>
		<li>使用针对特定应用和抗体优化的固定剂对细胞进行固定。 
		注意：选择固定剂时需考虑的一个重要标准是，在保持样本细胞结构完整性的同时，确保目标抗原不发生构象改变。本实验方案中讨论了使用 3% 多聚甲醛/0.1% 戊二醛（PFA/GA）以及 100% 甲醇进行固定的方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达 Sec61β-mCherry 的转染 COS-7 细胞的 PFA/GA 固定
	<ol>
		<li>取 1.9 mL 16% 多聚甲醛和 20 µL 50% 戊二醛混合，并加入 PBS 至终体积为 10 mL。</li>
		<li>向每皿细胞中加入 1 mL 新鲜配制的 PFA/GA 溶液，在室温下固定 10 分钟。</li>
		<li>吸除 PFA/GA 溶液，用 PBS 清洗细胞 3 次。</li>
		<li>将贴壁细胞置于旋转器上（转速设定为中等速度，例如，每分钟 50 个循环），用 PBS 洗涤 5 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>接着，用 1 mL 新鲜配制的 0.1% 质量/体积的硼氢化钠水溶液处理，以还原游离醛基。</li>
		<li>先用 PBS 清洗细胞两次，再洗涤 3 次，每次 5 分钟，以彻底去除残留的硼氢化钠及其与游离醛基反应生成的醇类物质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成年小鼠心室肌细胞的甲醇固定
	<ol>
		<li>小心地向细胞中加入 1 mL 冰冷的 100% 甲醇。倾斜 6 孔板，将甲醇沿孔壁缓慢加入，避免直接滴加在盖玻片上。然后将 6 孔板恢复至水平位置，使甲醇均匀覆盖细胞。在 -20 °C 下固定 5 分钟。</li>
		<li>吸除固定剂，用 PBS 清洗细胞 3 次。</li>
		<li>将贴壁细胞置于旋转器上，用 PBS 洗涤 5 次，每次 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 封闭非特异性结合
<ol>
	<li>在室温下用封闭液（见材料表）封闭1小时。 
	注意：可用于阻断非特异性抗体结合的封闭液有多种，包括3%牛血清白蛋白（BSA）或与一抗相同物种的非免疫血清。</li>
</ol>
7. 检测
<ol>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>吸除封闭液，不要洗涤或冲洗。</li>
		<li>按以下方法配制一抗溶液（参见步骤 7.1.5）：将一抗用抗体孵育液（见材料表）稀释至浓度为 10 µg/mL（或按厂家推荐浓度）。将少量体积平衡滴加在盖玻片上，小心地在其表面覆盖一块方形塑料石蜡膜。这有助于将少量抗体溶液均匀铺展于盖玻片表面，并防止蒸发。</li>
		<li>将 6 孔板放入湿盒中，于冰箱内过夜孵育。</li>
		<li>次日早晨，从湿盒中取出细胞，小心移除盖玻片表面的石蜡膜方块，并吸除一抗溶液。</li>
		<li>用 PBS 漂洗 3 次，然后在摇床上用稀释的封闭液（见材料表）洗涤 5 次，每次 5 分钟。 
		注：本实验方案使用以下抗体：用于图 2所示图像的抗 RFP 小鼠单克隆抗体，以及用于图 3所示图像的兔多克隆 FP17 抗 CaV1.2 抗体（由加州大学戴维斯分校 Johannes Hell 教授惠赠）。洗涤步骤中可使用 PBS，但本方案通过在洗涤步骤中使用稀释的封闭液，提高了标记特异性并降低了背景信号。湿盒可使用带紧密盖子的塑料餐盒，并在内部铺上湿润的纸巾即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二抗孵育
	<ol>
		<li>吸除洗涤液，加入 200 µL 用抗体孵育液按 1:1,000 稀释的偶联二抗溶液。在盖玻片上覆盖一块石蜡膜方块（参见步骤 7.1.2）。</li>
		<li>室温避光孵育 1 小时。</li>
		<li>吸除二抗溶液，用 PBS 漂洗 3 次。</li>
		<li>在摇床上用稀释的封闭液洗涤细胞 5 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。 
		注：本实验方案描述了分别用于图 2和图 3的抗小鼠 Alexa 647 偶联二抗和抗兔 Alexa 647 偶联二抗。对于单蛋白标记，优先选择 Alexa 647 作为荧光染料，因其光子计数高（提高定位精度）且占空比低（提高时间分辨率）8。也可选用其他多种荧光染料偶联的二抗，例如 Atto 或 Cy 系列染料。有关多种荧光染料/染料在超分辨率成像中适用性的全面评估，请参阅 Dempsey et al.8 和 Chozinski et al.9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 后固定（可选步骤）
<ol>
	<li>将50 µL 50% GA溶于10 mL PBS中，配制0.25% GA溶液。在室温下用此溶液对细胞后固定10分钟。</li>
	<li>在旋转仪上用PBS洗涤3次，每次5分钟。</li>
</ol>
9. 样品储存
<ol>
	<li>将样品置于冰箱（4 °C）中，并用铝箔包裹的容器避光保存，直至成像。</li>
	<li>如需长期保存样品（长达数月），应将其保存在含有 3 mM 叠氮化钠的 PBS 中，以防止细菌生长。</li>
</ol>
10. GSD超分辨率成像光开关缓冲液的制备
<ol>
	<li>按如下步骤配制氧气清除剂“GLOX”溶液：
	<ol>
		<li>在1.5 mL微量离心管中，向49.5 µL PBS中加入12.5 µL过氧化氢酶（储存液浓度34 mg/mL）、3.5 mg葡萄糖氧化酶和0.5 µL 1 M Tris（pH = 8）。</li>
		<li>短暂涡旋混匀，使各组分溶解，然后在4 °C下以20,800 × g离心3分钟。 
		注意：诸如GLOX之类的氧气清除剂溶液已被证实可抑制荧光漂白。GLOX溶液可在冰箱中保存最多一周。每次使用时均需重复离心步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下步骤配制诱导光转换的巯基溶液：
	<ol>
		<li>用PBS配制100 mM β-巯基乙胺（MEA）溶液，并调节pH至8；也可选择使用β-巯基乙醇（βME）。将MEA溶液分装后于-20 °C冷冻保存，最多可保存1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前立即在冰上配制最终的光转换缓冲液，将巯基组分与氧气清除剂组分混合。配制500 µL GLOX-MEA缓冲液时，将5 µL GLOX加入50 µL MEA（pH = 8）和445 µL盐水缓冲液（含2.5 mL 1 M Tris pH = 8、29.22 mg NaCl（终浓度10 mM）、5 g葡萄糖和47.5 mL水）中。若配制GLOX-βME溶液，则将5 µL GLOX加入5 µL βME和490 µL盐水缓冲液中。
	<ol>
		<li>将溶液保持在冰上，根据需要用于将样品封片至凹面载玻片上。 
		注意：含巯基的溶液（如βME或MEA）可诱导基于氰基的染料（如Alexa 64710）或基于荧光素的染料（如Alexa 568）发生光转换。对于Alexa 647，βME效果更佳；而对于Alexa 568，或当采用双标记策略同时成像两种蛋白（分别使用Alexa 568和647）时，推荐使用MEA。由于酸化作用，该缓冲液在数小时内会逐渐降解，导致样品的平均光子计数下降。为避免此问题，建议在使用2–3小时后或当观察到平均光子计数下降、或诱导光转换所需时间明显延长时，重新配制新鲜的光转换缓冲液。最近有文献报道了一种新型成像缓冲液Ox-EA，我们尚未测试，但据称其pH可在数天内保持稳定，并且在多色成像应用中表现优于GLOX11。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
11. 样品封片
<ol>
	<li>使用 100 µL 成像缓冲液将带有标记细胞的盖玻片（参见第 1–9 节）安装到凹面载玻片上。</li>
	<li>用硅胶密封盖玻片边缘，以防止成像缓冲液快速氧化。等待数分钟，直至硅胶完全固化，否则在成像过程中盖玻片会发生漂移。 
	注意：硅胶若接触 βME 则无法固化。务必先将盖玻片边缘干燥，以避免硅胶与成像缓冲液接触。</li>
</ol>
12. 图像采集
<ol>
	<li>参见表1，了解图2和图3中所用成像参数的列表。
	<ol>
		<li>首先，根据所选的荧光染料，选择适当的激光以照射样品。本方案中使用的SR-GSD系统配备了高功率激光器（488 nm，1.4 KW/cm2；532 nm，2.1 KW/cm2；561 nm，2.1 KW/cm2；642 nm，2.1 KW/cm2）。图2使用了642 nm激光器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用高数值孔径（NA）的油浸物镜。本实验所用的SR-GSD系统配备有HC PL APO 160X/1.43 NA物镜。</li>
	<li>选择合适的二向色镜成像立方体。本方案中的SR-GSD系统配备了488 HP-T、532 HP-T、568 HP-T、642 HP-T，其发射带通滤光片分别为505–605 nm、550–650 nm和660–760 nm。</li>
	<li>选择2D采集模式。将相机设置为帧转移模式，曝光时间为10 ms（100 Hz）。将EM增益设为300。选择检测阈值。 
	注意：低阈值会导致图像背景较高；高阈值可能会滤除感兴趣的信号。应基于阴性对照（如未转染细胞的盖玻片或仅孵育二抗的细胞）的成像结果来确定阈值。</li>
	<li>开启自动事件控制，并将每幅图像的事件数设为8。</li>
	<li>在GSD采集选项卡中输入像素大小（起始可设为10 nm或20 nm）。在开始成像前，确保在“高分辨率图像计算选项”下的GSD工具选项卡中已选择&#34;直方图模式&#34;。</li>
	<li>若要对细胞质膜上的蛋白质进行成像，选择全内反射荧光（TIRF）模式，并调节入射角以确定穿透深度。</li>
	<li>为将电子送入暗态（称为泵浦），将激光强度设为100%。</li>
	<li>在泵浦过程中选择单分子检测，并设置当帧相关性达到0.20时自动开始采集。</li>
	<li>在采集过程中，将激光强度设为50%。</li>
	<li>将采集帧数设为60,000。 
	注意：研究者可能会发现某些样品所需帧数多于或少于该数值。应根据荧光染料光漂白的观察情况调整帧数，并在无法再检测到新事件时停止采集。</li>
	<li>开始采集。 
	注意：采集开始时，所有染料分子均处于荧光态，随后切换至暗态。当帧相关性达到0.20时，将开始采集图像。当每帧检测到的事件少于8个时，405 nm激光将自动开启，促使荧光分子从暗态返回基态。在对来自n = y只动物的n = x个细胞的数据集进行成像时，TIRF穿透深度、检测阈值和采集帧数等参数应保持恒定。</li>
</ol>
13. 图像分析
<ol>
	<li>为了量化蛋白簇的大小，使用 ImageJ 的“分析粒子”（analyze particles）功能。 
	注意：可进一步使用基于随机光学重建显微技术的相对定位分析（stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis, STORM-RLA）或类似方法进行分析13。
	<ol>
		<li>使用 ImageJ 进行簇分析（图3），步骤如下：</li>
		<li>打开待分析的图像文件。该文件应为上述成像软件（第12节所述）生成的10 nm直方图单分子定位图。</li>
		<li>调整图像的亮度和对比度以清晰显示图像：点击图像菜单，选择“调整”（adjust），然后选择“亮度/对比度”（brightness and contrast），点击“自动”（auto）选项。</li>
		<li>将图像类型更改为8位：选择图像菜单，然后选择“类型”（type），再选择“8位”（8-bit）。</li>
		<li>设置图像的比例尺：打开“分析”（analyze）菜单，点击“设置比例尺”（set scale），输入以下参数：距离 = 1，已知距离 = 10，1像素 = 10 nm。</li>
		<li>为选择需测量的参数，打开“分析”菜单，选择“设置测量”（set measurements），并勾选“面积”（area）选项旁的复选框。</li>
		<li>调整图像的阈值：打开图像菜单，选择“调整”（adjust），然后选择“阈值”（threshold），选择“过/欠”（over/under）。将最大值调至255，最小值调至1，然后点击“应用”（apply）。</li>
		<li>为分析粒子，打开“分析”菜单，选择“分析粒子”（analyze particles）。勾选“使用像素单位”（pixel units）、“显示结果”（display results）和“汇总”（summarize）选项。将大小设置为4-无穷大（因为分辨率为~20 nm），选择“仅显示轮廓”（bare outlines）选项，然后点击“确定”（ok）。系统将生成一个汇总文件，其中包含平均簇大小和图像中簇的数量等分析结果。 
		注意：在对特定簇中蛋白质数量得出结论时应谨慎，因为定位点的数量与蛋白质数量之间并非线性相关。GSD技术对与抗体偶联的染料进行定位，导致荧光标记与表位之间的连接误差在任意方向上可能超过&#62;10 nm。此外，若使用多克隆抗体，多个抗体可能结合到单个抗原上；更复杂的是，商用二抗平均偶联有3–6个染料分子，因此一个荧光基团并不总等于一个蛋白质。可通过将染料直接偶联至一抗（从而省去二抗）或采用基于纳米抗体的标记策略来减少连接误差14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

近年来，一系列突破光学衍射极限的成像技术迅猛发展，为深入理解哺乳动物细胞信号转导在空间与时间上的复杂性提供了全新的视角。这些技术包括STORM、STED、PALM、GSD、SIM及其各种变体（例如，dSTORM、FPALM）。这些技术背后科学家的创造性工作使我们得以绕过光衍射物理规律所带来的限制。尽管取得了巨大进展，但每种技术在实现超分辨率成像时都需在某些方面做出权衡，因而各自存在局限性。细胞生物学家和生物物理学家所追求的理想状态是：具备最佳灵敏度、高分辨率和快速图像采集能力，同时完全避免光漂白现象。此外，我们还应意识到，将细胞从生物体内分离出来本身就会改变其状态，进而可能影响分子动态行为。因此，开发一种能够在活体、呼吸状态的动物中实现动态、活细胞、单分子成像的超分辨率技术，仍是当前持续探索的目标。目前，我们已拥有可在横向和轴向分辨率上分别达到20 nm和50 nm、较衍射极限提升10倍的成像工具。本文将讨论实现GSD超分辨率成像的样本制备、图像采集及分析方法。
尽管本实验方案的重点是 Sec61β 和 CaV1.2 L 型 Ca2...

细胞信号转导反应可将不断变化的内外环境转化为细胞响应。它们调控人体生理学的各个方面，是激素和神经递质释放、心跳、视觉、受精以及认知功能的基础。这些信号级联反应的紊乱可能导致严重的病理生理状况，例如癌症、帕金森病和阿尔茨海默病。数十年来，生物与医学研究者成功地将荧光蛋白、探针和生物传感器结合荧光显微镜，作为理解这些细胞信号精确时空组织的主要工具。
光学技术（如落射荧光、共聚焦或全内反射荧光（TIRF）显微镜）的优势在于其高灵敏度、快速成像以及与活细胞成像的良好兼容性，而其主要局限在于受衍射极限的分辨率限制，即无法分辨小于200–250 nm的结构或蛋白质复合物。随着确定性超分辨率技术在理论与实践上的发展例如，受激发射损耗显微镜（STED1），结构照明显微镜（SIM）2）或随机超分辨率（例如，光激活定位显微技术（PALM3），或基态耗尽（GSD4,5在荧光显微镜中，横向与轴向分辨率已突破衍射极限，达到数十纳米量级。因此，研究者现在能够以前所未有的能力在接近分子水平上观察并理解蛋白质动态行为与空间组织如何转化为生物学功能。
基态耗尽显微技术结合单分子返回（GSDIM），简称GSD，通过减少同时发光的荧光分子数量，克服了衍射极限4,5。该技术使用高能激光激发标记有荧光分子的样品，使光子不断轰击电子，从而提高其发生“自旋翻转”的概率，从激发态进入三重态或称为“暗态”4。这一过程有效耗尽了基态的荧光分子，因此得名“基态耗尽”。在三重态下，荧光分子不发射光子，样品显得更暗。然而，这些荧光分子会随机返回基态，并在再次进入三重态之前，经历多次发射光子的激发态到基态跃迁。由于在任意时刻只有少量荧光分子处于发射状态，单个荧光分子所发出的光子簇在空间和时间上均与邻近荧光分子的信号相互分离。这些光子簇可通过高斯函数拟合，其计算出的质心位置即代表荧光分子的位置，定位精度取决于物镜的数值孔径（NA）、激发光波长，以及每个荧光分子发射的光子数量。GSD的一个局限性在于，由于任意时刻仅有部分荧光分子处于活跃发射状态，因此需要在数分钟内采集数千幅图像，才能构建完整的定位图谱。较长的采集时间以及对高激光功率的需求，使得GSD更适用于固定样品而非活体样品。
本文介绍了用于膜蛋白和内质网（ER）驻留蛋白超分辨率显微成像的固定样品制备方法&#160;（所需耗材和试剂清单见材料表）。文中展示了该实验方案如何简便地应用于定量分析心肌细胞肌膜中L型电压门控Ca2+通道（Cav1.2）的聚集体大小及其聚集程度，或用于可视化观察内质网的细胞内分布。了解这些细胞组分的分布与组织形式，对于理解多种Ca2+依赖性信号级联反应的起始、转导及其最终功能至关重要。例如，Cav1.2通道在兴奋-收缩耦联过程中具有根本性的重要作用，而受体介导的内质网Ca2+释放可能是哺乳动物细胞中最普遍存在的信号转导通路。

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>用于清洁盖玻片</td></tr><tr><td>#1.5 盖玻片 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>用于细胞培养/处理/成像</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>用去离子水稀释至1x</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>促进细胞在盖玻片上的黏附</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>促进细胞在盖玻片上的黏附</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>心室肌细胞培养基</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>细胞培养溶液</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>瞬时转染试剂</td></tr><tr><td>无 Ca²⁺ PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>100% 甲醇</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>可使用 BSA 或其他封闭溶液替代</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>用于细胞透化的去垢剂</td></tr><tr><td>兔抗 CaV1.2 (FP1)</td><td>赠品</td><td>N/A</td><td>市面上存在商业化的抗 CaV1.2 抗体，例如 Alomone Labs 的兔抗 CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗 RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>一抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>二抗</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>防止微生物生长，用于样品长期保存</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>β-巯基乙胺盐酸盐</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>光转换缓冲液组分</td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>Neolab</td><td>1 &amp;ndash; 6293</td><td>用于样品封片</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>用于密封盖玻片</td></tr><tr><td>sec61&amp;beta;-mCherry 质粒</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Leica SR GSD 3D 显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>洗涤封闭溶液</td><td></td><td></td><td>含 20% SEAblock 的 PBS</td></tr><tr><td>一抗孵育溶液</td><td></td><td></td><td>含 0.5% Triton-X100 和 20% SEAblock 的 PBS</td></tr><tr><td>二抗孵育溶液</td><td></td><td></td><td>用 PBS 1:1000 稀释</td></tr></tbody></table>

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

荧光显微镜技术与细胞生物学的进步密切相关，可视化细胞事件能力的提升常常显著推动我们对细胞功能机制的理解。超分辨率显微镜的发展与普及已将光学分辨率的极限从约250 nm大幅提升至20 nm。如今，生物学家不再局限于在衍射极限范围内的共定位来描述分子相互作用，而是能够直接观察单个分子之间的动态相互作用。本文概述了一种利用基态耗尽显微镜&#160;对固定细胞进行成像，以实现细胞蛋白可视化与定量的实验方案。我们以两种不同的膜蛋白为例进行说明：内质网转运子的一个组分sec61β，以及定位于质膜的电压门控L型Ca2+通道（CaV1.2）。文中讨论了具体的显微镜参数设置、固定方法、光切换缓冲液的配制，以及图像处理中的注意事项与挑战。

如引言中所述，目前存在多种不同的超分辨率显微成像模式。本实验方案重点介绍GSD超分辨率成像。代表性图像及定位图如图2和图3所示。
图2 显示一个转染了内质网蛋白mCherry-Sec61β的COS-7细胞，该细胞经上述方法处理。 图2A-2B 允许使用全内反射荧光（TIRF）模式下的超分辨率显微镜对内质网（ER）图像进行比较A）并使用GSD采集模式（B）。图像显示，在GSD模式下成像时，轴向分辨率得到改善。这一结果在随附的图像剖面图中进一步得到证实，该图可使用ImageJ生成，显示了感兴趣区域（黄线）归一化强度曲线分...

本文概述了一种利用基态耗尽（GSD）超分辨率显微技术在哺乳动物细胞中检测一种或多种血浆和/或细胞内膜蛋白的实验方案。本文讨论了采用此类方法在细胞蛋白可视化与定量分析中的优势及注意事项。

荧光显微镜技术与细胞生物学的进步密切相关，可视化细胞事件能力的提升常常导致……

该荧光成像技术的总体目标是利用一种称为基态耗尽显微成像与单分子返回（ground state depletion microscopy and individual molecule return）的超分辨率显微技术，在固定细胞中以突破衍射极限分辨率的方式可视化并定量细胞蛋白。该方法有助于回答细胞生物学与膜生物物理学领域中的关键问题，因为它克服了衍射极限分辨率的限制，使研究人员能够更精确地定义、可视化和定量细胞蛋白的分布。本方案的主要优势在于，其获得的图像分辨率相较于传统的荧光显微成像方法（如共聚焦显微镜）可提高约十倍。本实验操作将由我实验室的博士后研究员 Oscar Vivas 和 Rose Dixon 实验室的博士后研究员 Karen Hannigan 演示。首先，按照随附的文字实验方案准备盖玻片和细胞。随后固定样品，并进行免疫细胞化学染色，以标记目标细胞膜蛋白和/或细胞内膜蛋白。接下来，通过在1.5毫升微量离心管中加入12.5 µL过氧化氢酶储备液、3.5 mg葡萄糖氧化酶和0.5 µL 1 M Tris，再加入49.5 µL PBS，配制氧气清除用Glock溶液。盖紧管盖，短暂涡旋振荡以溶解各组分，然后将溶液离心3分钟。现在，通过将β-巯基乙胺溶液溶解于PBS中，配制成100毫摩尔浓度，并调节pH至8.0，以制备光转换诱导用硫醇溶液。分装后将硫醇溶液保存于冰箱中，可稳定保存长达一周。成像前立即取用，将硫醇溶液与氧气清除组分混合于生理缓冲液中，并将混合溶液置于冰上保存。使用 100 微升制备好的光转换缓冲液，将带有染色细胞的盖玻片封固在凹面载玻片上。接着，用硅胶密封盖玻片边缘，以防止成像缓冲液快速氧化。在成像前，等待数分钟，直至硅胶完全固化。否则，盖玻片会发生漂移。首先，根据所选的荧光染料选择合适的激光器来照射样品。对于 Alexa 647 荧光染料，使用 642 纳米激光器。接下来，选择合适的二向色成像镜组和物镜。打开成像软件，选择二维采集模式，然后将曝光时间设置为11毫秒。同时，将EM增益设置为300，并选择适当的检测阈值。接下来，开启自动事件控制，并将每幅图像的事件数设置为8个。将像素大小设为20纳米。在 GSD 工具选项卡中，进入高分辨率图像计算选项，并确保选择直方图模式。为对质膜上的蛋白质进行成像，请选择全内反射荧光（TIRF）模式，并调整入射角度以确定穿透深度。然后，将激光强度设置为 100%，以使电子进入暗态。接下来，在泵送的同时选择单分子检测模式，并设置当帧相关性为 0.20 时自动开始采集。采集时，将激光强度设为 50%，采集帧数设为 60,000。然后开始采集图像。为了量化蛋白质簇的大小，使用 ImageJ 打开一张10纳米直方图的单分子定位图图像文件。在“图像”菜单中，进入“调整”选项，使用“自动”功能优化图像的亮度和对比度。然后，在“类型”菜单下选择8位。接下来，打开“分析”菜单，点击“设置比例”，并输入此处所示的数值。然后，在“分析”菜单中选择“设置测量”，并勾选“面积”选项旁边的复选框。返回“图像”菜单，选择“调整”、“阈值”，然后选择“超出/低于”。将最大值调整为255，最小值调整为1，然后点击应用。最后，打开分析菜单并选择分析颗粒。勾选像素单位、显示结果和汇总选项。然后将大小设置为4至无穷大，选择“Bare Outlines”选项，点击确定。此处成像的细胞转染了内质网蛋白mCherry-Sec61 beta，并分别使用衍射极限下的全内反射荧光显微镜（TIRF）和全内反射模式下的超分辨率GSD显微镜进行成像。这些曲线代表内质网小管的直径。右侧图像显示了横向分辨率的提升，更准确地反映了内质网小管的结构。通过超分辨率 GSD 成像所实现的分辨率提升在这些图像中得到了进一步展示，图像显示了使用抗 CAV 1.2 抗体标记的心肌细胞。采用 GSD 模式后，横向分辨率显著提高，离子通道的各个簇更容易被分辨。一旦掌握该技术，本实验方案可在三天内完成。单个细胞的超分辨率成像需要10至30分钟，具体时间取决于所需的图像帧数。完成该操作后，可进一步采用其他方法（如电子显微镜技术），以探究更多科学问题，例如目标荧光蛋白如何与复杂的细胞环境相互作用。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备、采集和分析样品，从而利用基态耗尽后单分子返回技术，对一种或多种细胞蛋白进行超分辨率显微成像。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

哺乳动物细胞基态衰竭超分辨成像

我们描述了一种超分辨率成像方法，用于研究细菌FtsZ环的结构组织，该结构是细胞分裂所必需的重要装置。该方法基于对光激活定位显微镜（PALM）图像的定量分析，可应用于其他细菌细胞骨架蛋白的研究。...

细菌分裂机器的超分辨率成像

活细胞内动态蛋白质的时空信息对于理解生物学过程至关重要。一种称为快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）的超分辨率显微技术能够揭示细菌细胞分裂Z环的独特信息：不仅呈现其珠状结构，还能展示FtsZ蛋白在环内的快速动态行为。...

利用快速三维结构光照明显微镜（f3D-SIM）对活体细菌中细胞分裂Z环进行超分辨率成像

本文介绍了一种将玻璃支撑脂质双层技术与受激发射损耗（STED）超分辨率成像技术相结合的方法，用于形成免疫突触。本实验方案的目的是为使用者提供成功实施这两种技术所必需的操作步骤和指导。...

在玻璃支撑的平面脂双层上对自然杀伤细胞免疫突触进行超分辨率成像

利用新型荧光探针对质膜中磷脂酰肌醇4,5-二磷酸进行单分子超分辨率成像

磷脂酰肌醇4,5-二磷酸，质膜，单分子成像，超分辨率显微镜，荧光探针

传统的BODIPY偶联物可通过利用其瞬时形成的、红移的基态二聚体，用于活细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像。本文提供了一种优化的SMLM实验方案，可在纳米尺度上对活体哺乳动物细胞和酵母细胞内的亚细胞中性脂质和脂肪酸进行追踪与高分辨率成像。...

用于活细胞超分辨率显微镜和单分子示踪的传统BODIPY缀合物

本文介绍了一种在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的实验方案。我们已标准化了在其原生组织环境中对高度敏感的成体干细胞群体进行成像的条件。该技术通过平衡时间分辨率与空间分辨率，实现在活体组织中直接观察生物学现象。...

超分辨率活细胞成像观察亚细胞结构

基底膜在发育过程中对组织和器官的形态发生至关重要。为了更好地理解导致该结构正确定位的机制，本文介绍了一种利用共聚焦显微镜和超分辨率显微镜观察和表征上皮细胞中基底膜蛋白的细胞内转运与分泌的方法。...

共聚焦与超分辨率成像技术揭示基底膜蛋白极化性细胞内运输及分泌过程 黑腹果蝇 卵子发生

超分辨率显微镜可提供减数分裂中联会复合体内部组分排列的详细信息。在此，我们展示了一种用于解析秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 生殖系中联会复合体的超分辨率显微成像

本文提供了一种简单明了的实验方案，利用遗传密码子扩展技术（GCE）对Salmonella分泌的效应蛋白进行位点特异性标记，并通过直接随机光学重建显微镜（dSTORM）在HeLa细胞中成像观察分泌蛋白的亚细胞定位。...

利用遗传密码子扩展技术对细菌分泌蛋白进行超分辨率成像

本方案概述了使用配备光学光子重分配功能的转盘共聚焦显微镜进行深层全细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像的实验步骤，从而无需定制光学元件或复杂照明即可实现DNA-PAINT成像。...

全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

本方案详细介绍了集成多路阵列探测器的激光扫描共聚焦显微镜系统在高级成像中的应用及其共享资源管理，适用于高分辨率的细胞及亚细胞成像。该工作流程可在同一平台上实现从共聚焦到超分辨率（约120...

超分辨率成像与共享管理：一种用于多通道检测共聚焦显微镜的实验方案

学习使用基态衰竭超分辨显微技术对哺乳动物细胞中的膜蛋白进行高分辨率成像和定量分析。该方法突破衍射极限，分辨率比传统荧光显微镜提高约十倍，有助于精确研究细胞生物学和膜生物物理学中的蛋白质分布。

基态耗尽超分辨率成像在哺乳动物细胞中的应用

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