哺乳动物细胞基态衰竭超分辨成像

这种荧光成像技术的总体目标是使用一种称为基态耗竭显微镜和单个分子返回的超分辨率显微镜，以亚衍射极限分辨率可视化和定量固定细胞中的细胞蛋白质。这种方法有助于回答细胞生物学和膜生物物理学领域的关键问题，因为它规避了衍射极限分辨率，这有助于研究人员更精确地定义、可视化和量化细胞蛋白质的分布。该协议的主要优点是，与传统的荧光显微镜成像方法（例如共聚焦显微镜）相比，它能够以大约 10 倍的分辨率获取图像。

演示该程序的是我实验室的博士后 Oscar Vivas 和 Rose Dixon 实验室的博士后 Karen Hannigan。首先，按照随附的文本方案中的说明准备盖玻片和单元格。然后固定样品并进行免疫细胞化学，以标记感兴趣的质膜和/或细胞内膜蛋白。

接下来，首先在 1.5 毫升微量离心管中加入 12.5 微升过氧化氢酶储备液、3.5 毫克葡萄糖氧化酶和 0.5 微升一摩尔 Tris 到 49.5 微升 PBS 中，以制备除氧 Glock 溶液。关闭试管并短暂涡旋以溶解组分。然后将溶液离心 3 分钟。

现在，通过将 β-巯基乙胺溶液溶解到 PBS 中至浓度为 100 毫摩尔并将 pH 值调节至 8.0 来制备光转换诱导硫醇溶液。将硫醇溶液分装并储存在冰箱中长达一周。在成像之前，将硫醇和氧清除组分与盐水缓冲液混合在一起，并将溶液储存在冰上。

使用 100 微升准备好的照片切换缓冲液，将含有染色细胞的盖玻片安装到凹陷载玻片上。接下来，用硅胶密封盖玻片的边缘，以防止成像缓冲液快速氧化。等待几分钟，直到硅胶完全固化，然后再进行成像。

否则，盖玻片会漂移。首先，根据所选的荧光基团选择合适的激光器来照射样品。对于 Alexa 647 荧光基团，请使用 642 纳米激光器。

接下来，选择合适的二向色成像立方体和物镜。打开成像软件。选择 2D 采集模式，然后将曝光时间设置为 11 毫秒。

此外，将 EM Gain 设置为 300 并选择合适的检测阈值。接下来，打开 Auto Event Control 并将 Events Per Images 的数量设置为 8。输入 像素大小 为 20 纳米。

在 GSD Tools 选项卡中，转到 High Resolution Image Calculation 选项并确保选择 Histogram Mode。要在质膜上对蛋白质进行成像，请选择 TIRF 模式并修改入射角以确定穿透深度。然后，将激光强度设置为 100%，以便将电子发送到暗态。

接下来，选择 Single Molecule Detection while pumping（泵送时单分子检测），并设置为在帧相关性为 0.20 时自动采集。对于采集，将激光强度设置为 50%，并将采集帧数设置为 60， 000。然后开始拍摄图像。

要量化蛋白质簇的大小，请在 ImageJ 中打开 10 纳米直方图单分子定位图的图像文件。在 图片 菜单，转到 调整 并使用 自动 选项来优化图像的亮度和对比度。然后，在 类型 菜单下，选择 8 位。

接下来，打开 Analyze（分析）菜单，单击 Set Scale（设置比例）并输入此处显示的值。然后，在 Analyze 菜单中，选择 Set Measurements 并选中 Area 选项旁边的框。返回 图像 菜单，选择 调整、阈值，然后选择 高/小.

将最大值移动到 255，将最小值移动到 1，然后单击 Apply。最后，打开 Analyze 菜单并选择 Analyze Particles。勾选以选择 Pixel units（像素单位）、Display results（显示结果）和 Summarize（汇总）。

然后将大小设置为 4 到无穷大，选择 裸轮廓 选项并单击 OK.用内质网蛋白 mCherry-Sec61 β 转染此处成像的细胞，并在 TIRF 模式下使用折差限制 TIRF 显微镜和超分辨率 GSD 显微镜进行成像。这些曲线代表 ER 小管的直径。右图显示了横向分辨率的提高，并代表了 ER 小管结构的更准确表示。

这些图像进一步证明了超分辨率 GSD 成像提供的分辨率改进，显示了具有抗 CAV 1.2 抗体的标记心肌细胞。使用 GSD 模式，横向分辨率的改进非常明显，并且更容易识别单独的通道集群。一旦掌握，该方案可以在三天内完成。

单个细胞的超分辨率成像需要 10 到 30 分钟，具体取决于所需的帧数。按照此程序，可以执行其他方法（如电显微镜）来回答其他问题，例如感兴趣的荧光蛋白如何与复杂的细胞环境相互作用。观看本视频后，您应该对如何制备、采集和分析样品有很好的了解，以使用基态耗尽和单个分子返回来可视化一种或多种细胞蛋白，以便进行超分辨率显微镜检查。