Name: 用于研究铁 (氧) 氢氧化物、微量元素和细菌之间厌氧生物地球化学相互作用的实验柱装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解用于研究厌氧环境中砷和汞等微量元素生物地球化学行为的实验柱装置方法。该技术通过连续水流和采样端口，可追踪微生物活动驱动的铁还原与硫酸盐还原条件下痕量金属的动态归趋。

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本工作由法国地质矿产调查局（BRGM）、卢瓦雷省总议会的博士后资助以及卡诺研究所共同资助。我们还衷心感谢中央-卢瓦尔河谷大区为PIVOTS项目提供的财政支持。

1. 实验准备
<ol>
	<li>将所有与样品接触的材料（玻璃、聚四氟乙烯（PFTE））用酸清洗（20% 硝酸（HNO3）v/v 浸泡 5 天），随后用 10% 盐酸（HCl）v/v 浸泡 5 天。用超纯水冲洗数次，并在使用前于层流罩下干燥。</li>
	<li>所有涉及化学品的操作步骤均需佩戴聚乙烯手套（或类似材质手套）并在通风橱中进行。</li>
</ol>
2. 制备加标无定形铁氧化物（Hg 和 As）
<ol>
	<li>准备约 20 g 的水合氧化铁（Fe(OH)3）：在玻璃反应器中，将 50 g FeCl3-6H2O 溶于 500 mL 超纯水（电阻率 &gt;18 MΩ cm-1），使用不锈钢搅拌桨或磁力搅拌器搅拌。初始 pH 值 &lt;2。</li>
	<li>手动加入 10 M NaOH 溶液以沉淀水合氧化铁。 
	注意：沉淀全部铁（氧）氢氧化物约需 50 mL。调节 pH 至 6，并持续搅拌 1 小时以使其稳定。
	<ol>
		<li>对于加标 Hg 的（氧）氢氧化物：配制 10 mL 浓度为 10 g L-1 的 HgNO3 溶液，取 350 µL 加入（氧）氢氧化物悬液中。 
		注意：这将使湿态（氧）氢氧化物中的最终 Hg 含量约为 ~4 µg g-1（氧）氢氧化物。</li>
		<li>对于加标 As 的（氧）氢氧化物：配制 100 mL 浓度为 10 g L-1 的 As2O325 溶液，取 70 mL 加入氧化铁溶液中。这将使（氧）氢氧化物中的最终 As(III) 含量约为 ~70 mg/g（氧）氢氧化物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>继续使用不锈钢搅拌桨或磁力搅拌器搅拌 3 小时，随后在 2,000 × g 条件下离心 20 分钟。弃去上清液，并将（氧）氢氧化物重新悬浮于 500 mL 超纯水中。重复离心和洗涤步骤两次。回收湿润的（氧）氢氧化物（固体含水量为 85–90% wt.），并于 4 °C 保存备用。</li>
	<li>通过伽马辐射对湿润的加标 Hg 或 As 氧化铁进行灭菌处理，吸收辐射剂量至少为 25 kGy。</li>
	<li>检测 Hg 和 As（氧）氢氧化物的含量
	<ol>
		<li>测定沉淀物中的 Hg 含量26。 
		注意：我们测得固体中 Hg 含量为 3.90 ± 0.08 µg Hg g-1。因此，在每根柱中加入的 18.3 g 氧化铁所含总汞量为 71.4 ± 1.51 µg。</li>
		<li>测定沉淀物中的 As 含量。采用热酸消解法（5 N HCl 8 mL，50 °C 下反应 4 小时），并通过原子吸收光谱法（AAS）进行分析。 
		注意：我们测得固体中 As 含量为 70 mg As g-1。因此，在 18.3 g 氧化铁中加入柱内的总 As 量约为 1.3 g。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 准备硅胶和沙基质
注意：使用疏松的硅胶基质可防止细铁氧化物在水流作用下从砂/铁氧化物混合物中迁移。最终的凝胶基质为6%硅胶，以避免形成堵塞，仅使氧化物松散聚集。
<ol>
	<li>在加热板上将4 g硅胶加入40 mL 7% KOH溶液中，用磁力搅拌子搅拌至溶解，制备10%硅胶混合液。</li>
	<li>加入60 mL超纯水，然后将溶液冷却至约20 °C。用稀释的磷酸（20%）迅速滴定至pH 7.5。在硅胶溶液凝固前，迅速将其与320 g无菌沙子以及先前加入的18.3 g加标汞或加标砷的铁氧化物混合。</li>
	<li>用刮勺将“凝胶化”的混合物打散，并在使用前保持无菌状态，用于步骤4。</li>
</ol>
4. 装填色谱柱
<ol>
	<li>使用带有水夹套冷却系统的玻璃柱（内部体积 = 400 mL，高度 = 30 cm，直径 3.5 cm），并在柱体上每隔 5 cm 均匀设置五个硅胶隔垫，以便沿柱体全程取样。</li>
	<li>截取足够长度的 PTFE 管（PTFE 内径 Ø 3 mm），确保柱体进、出口端均有足够长度。将进水管连接至蠕动泵管，再连接至水或培养基供应系统。</li>
	<li>通过高压灭菌（110 °C 下 1 小时）对所有材料（玻璃器皿、管道）进行灭菌。</li>
	<li>将柱体垂直固定。</li>
	<li>将水夹套连接至水冷系统，以维持平均温度为 20 °C。</li>
	<li>从顶部填充柱体，步骤如下： 
	- 铺一层湿润的岩棉，以防止固体流失； 
	- 加入 320 g 无菌砂（枫丹白露砂，D50 = 209 µm）； 
	- 加入 320 g 无菌砂，与 18.3 g 水合无定形氧化铁混合，氧化铁中掺入 Hg 或 As（见步骤 1），并固定于 6% 硅胶基质中（见步骤 2）。</li>
	<li>将柱体垂直固定，并连接持续通入经 N2 鼓泡的超纯无菌水的上升流，流速保持较低（约 2 mL h-1）。</li>
	<li>用铝箔包裹柱体，以避光保护。</li>
</ol>
<img alt="柱层析装置示意图与照片；砂子、氧化铁；细菌接种过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56240/56240fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 柱装置的示意图与照片。 <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56240/56240fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

实验柱装置被证明是一种方便的实验室设备，可用于在连续条件下研究厌氧生物地球化学过程。与泥浆批量系统或微宇宙系统相比，连续柱系统能够更接近真实含水层的条件进行操作。连续系统可模拟地下水通过含水层沉积物的运动。
该方案中最关键的步骤是制备TE-铁（氧）氢氧化物及其与硅胶和沙子的混合物，必须快速完成以获得均匀的质地。除这一总体关键步骤外，还需谨慎设计污染物加标（氧）氢氧化物的制备过程，以使其能够充分代表所研究自然系统的合适模型17。
该柱体设计为可在不同深度进行取样，从而获取物理-化学及生物参数的剖面信息。因此，该系统可包含多个模拟层 原位 非均质性。此处模拟了天然含水层中铁浓度的非均质性；然而，通过调整硅胶中添加的合成矿物类型，也可研究其他类型的矿物学非均质性。硅胶基质有效阻止了铁（氧）氢氧化物细小颗粒的移动。在所述示例中，柱体接种了来自地下水的天然微生物群落19然而，由于色谱柱及所有相关设备均可灭菌，因此可考虑使用纯...

了解和预测环境中痕量元素（TE）的迁移性及生物地球化学行为，对于监测、制定和实施污染场地的适当管理措施至关重要。这一点尤其适用于砷（As）和汞（Hg）等有毒痕量元素。这些痕量元素在土壤或含水层中的归趋和形态与其所处的理化条件（如Eh和pH）密切相关，同时也受到微生物活动的影响，微生物可能直接改变其形态，或间接影响其迁移性。
事实上，某些细菌能够直接将As(III)氧化为As(V)，或将As(V)还原为As(III)。这一过程影响砷的毒性，因为As(III)是砷最具毒性的形态；同时也影响其迁移性，因为As(III)比As(V)更具移动性，而As(V)容易吸附在铁（氧）氢氧化物或有机质上1,2。同样，细菌在汞的循环中也起着重要作用，一方面通过硫酸盐还原菌和铁还原菌主导的甲基化作用3,4，生成神经毒素甲基汞（易在食物链中生物富集），另一方面通过将其还原为易挥发的单质汞（Hg°）5。
砷（As）和汞（Hg）的环境归宿也与土壤或含水层的组成密切相关，因为有机质或铁（氧）氢氧化物等化合物会影响它们的固定和生物可利用性。As(V) 能很好地吸附在铁（氧）氢氧化物上6，而 Hg 对有机质（OM；主要为巯基）具有极高的亲和力，在缺乏有机质的环境中，也可与胶体态的铁或锰（氧）氢氧化物强烈结合7,8,9,10,11。
细菌活动可通过还原铁（氧）氢氧化物或矿化有机质，影响吸附在（氧）氢氧化物或有机质上的痕量元素（TEs）的归趋。在硫缺乏区域，细菌直接还原铁是铁还原的主要途径12,13，其中Fe(III)作为末端电子受体；而间接途径中，Fe(III)可被细菌硫酸盐还原所产生的硫化物还原为Fe(II)14。此外，硫酸盐的存在还可通过形成硫代砷酸盐15（与As）或硫汞矿（与Hg）等络合物，改变Hg和As的形态分布。
因此，更深入地理解铁和硫酸盐循环对痕量元素（如 Hg 和 As）归趋的影响，有助于我们更好地管理污染场地，并维持土壤和水质。相关数据还可用于完善现有的金属迁移模型。微生物介导的 Fe(III) 还原16,17,18 可导致痕量元素的解吸。理论上，由硫酸盐微生物还原产生的硫化物对铁（氧）氢氧化物的间接还原也可能影响痕量元素的迁移性。然而，这些反应的程度和动力学通常在均质批量体系或批量微宇宙系统中进行研究16,18,19,20。批量实验的局限性在于无法区分所发生的各种现象；实际上，反应活性依赖于且受限于体系中存在的资源，仅能提供物种形态变化和吸附行为的最终结果。采用柱实验方法则可实现流入介质的持续更新，并能够对痕量元素在时间和空间上的归趋进行监测。与含水层实际情况相比，这些条件更具代表性，因为真实环境中的过程与连续渗透条件密切相关。此外，含水层沉积物中铁（氧）氢氧化物的非均质分布十分常见21,23，固相矿物学和化学组成的空間变化无疑会驱动微生物活性。
为了阐明这些非均质性对地球微生物现象及铁相关痕量元素（TE）归趋的影响，我们开发了一种实验室连续进料柱装置，用以模拟简化的含水层模型。该柱体填充方式可在柱体入口处形成一个缺铁区，而在顶部形成一个富铁区。规则分布的取样口使我们能够分别研究各个区域以及与界面相关的过程。该实验装置在研究汞（Hg）的归趋与形态转化方面的应用实例已有报道24。本文将详细描述该实验系统的构建，并提供其应用于研究砷（As）在污染含水层中行为的第二个实例。

<table><tbody><tr><td>玻璃柱</td><td>博卡维尔，法国</td><td>具体要求</td><td>色谱柱由三个独立部分组成：主柱体，包含冷却套和5个取样口（GL14规格，带橄榄形接头），以及顶部和底部部件，它们与主柱体相连接，并通过硅胶接头和螺钉（RIN F 40x38）固定 &amp;以及 SVL 42）。注意：此设计已与公司直接讨论。我们建议寻找当地的玻璃安装商。</td></tr><tr><td>聚四氟乙烯/硅胶隔垫，直径 20 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>508608</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 管道内径 3 mm</td><td>VWR</td><td>228-0745</td><td></td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>多米尼克·杜舍尔股份有限公司</td><td>66493</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump tubing LMT 55</td><td>VWR</td><td>224-2250</td><td>Tygon&amp;reg; LMT 55&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fontainbleau 砂，D50=209 &amp;micro;m</td><td>法国西贝尔科</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 用于产生气泡</td><td>法国液化空气集团，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伽马辐照</td><td>Ionisos，Dagneux，法国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动汞分析仪（AMA 254）</td><td>法国 Courtage Analyses 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Varian SpectrAA 300 Zeeman</td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 超纯</td><td>VWR</td><td>1.00441.1000</td><td>制造商：Merck</td></tr><tr><td>HCl 30% Supra pur</td><td>VWR</td><td>1.00318.1000</td><td>制造商：Merck</td></tr><tr><td>Hg(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>516953</td><td></td></tr><tr><td>作为&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>默克</td><td>202673</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-6H₂O</td><td>默克</td><td>207926</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>336815-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

研究铁（氧）氢氧化物、微量元素与细菌之间厌氧生物地球化学相互作用的实验柱装置设置

Experimental Column Setup for Studying Anaerobic Biogeochemical Interactions Between Iron (Oxy)Hydroxides, Trace Elements, and Bacteria

微量元素（如砷（As）和汞（Hg））在含水层中的归趋与形态转化与其所处的物理化学条件（如氧化还原电位（Eh）和pH值）密切相关，同时也受到微生物活动的影响，这些活动可能直接或间接地影响其形态和/或迁移性。事实上，某些细菌可直接将As(III)氧化为As(V)，或将As(V)还原为As(III)。同样，细菌在汞的循环中也起着关键作用，既可通过甲基化作用生成神经毒素——一甲基汞，也可通过还原作用将汞转化为单质Hg°。As和Hg的归趋还与土壤或含水层的组成密切相关；例如，As和Hg可与有机化合物或（氧）氢氧化物结合，从而影响其迁移能力。此外，细菌介导的过程，如铁（氧）氢氧化物的还原或有机质的矿化，也可能间接影响As和Hg的固定。硫酸盐/硫化物的存在亦可通过形成硫代砷酸盐（与As）或黑辰砂（与Hg）等络合物，显著影响这些元素的行为。
因此，关于砷和汞在环境中的归趋与形态转化，以及如何限制其毒性，人们提出了许多重要问题。然而，由于它们与含水层组分具有较高的反应活性，难以明确区分所发生的生物地球化学过程及其对这些痕量元素归趋的不同影响。
为此，我们开发了一种原创的、可模拟含水层的实验柱装置，该装置包含富砷或汞的铁氧化物区域以及缺铁区域，有助于更好地理解在缺氧条件下痕量元素的生物地球化学行为。以下方案逐步介绍了针对砷或汞的实验柱构建方法，并提供了在铁和硫酸盐还原条件下砷的示例实验。

示例1. 铁还原对砷迁移性和形态的影响
As 柱直接接种了来自某地下水位点的水样，该水样中砷浓度高于饮用水标准（Bracieux，卢瓦尔-谢尔省，法国）。地下水采集至无菌瓶中，并在 5 °C 下保存直至使用。该柱从底部以较低流速（2 mL h-1）持续供给含有天然内源微生物群落的地下水，以促进细菌在砂粒表面的附着。实验初期温度设定为 25 °C，以利于微生物生长；在连续运行 54 天后，温度降低至 14 °C，即含水层的实际温度。在初始接种阶段（第 0 天至第 17 天），向进水液中添加硫酸盐、乳酸盐和酵母提取物（分别为 370 mg L-1、830 mg L-1 和 250 mg L-1），以激活硫酸盐的生物还原过程。
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砷和汞在含水层中的归趋与形态转化与其物理化学条件及微生物活性密切相关。本文介绍了一种原创的实验柱装置，可模拟含水层环境，有助于深入理解厌氧条件下痕量元素的生物地球化学行为。文中展示了两个结合地球化学与微生物学方法的研究实例。

地下含水层中砷（As）和汞（Hg）等微量元素的归趋与形态分布与其所处的物理化学条件密切相关，例如……

本实验设计的总体目标是研究在微生物活动诱导的硫酸盐和/或铁还原条件下痕量金属的归趋。该方法有助于回答生物地球化学领域中的关键问题，例如汞和砷等关键生物地球化学循环之间的相互作用。该技术的主要优势在于，由于持续的水流，生物地球化学反应的动力学过程以及痕量元素的活性可通过取样口分别进行解析和监测。因此，该方法可以揭示汞和砷的归趋，如本实验所示，它们最终结合到铁氧化物上。该方法也可应用于其他痕量元素或载体基质。本实验操作将由本实验室的技术员Hafida Tris演示。开始此操作时，将 500 毫升超纯水加入装有磁力搅拌子的玻璃反应器中。在搅拌的同时，加入 50 克六水合三氯化铁。手动加入约 50 毫升 10 摩尔的氢氧化钠溶液，以开始生成针铁矿沉淀。接下来，将pH值调节至6，并继续搅拌1小时以达到稳定。对于加标砷的氢氧化物和羟基氧化物，配制100毫升浓度为10克/升的三氧化二砷溶液，然后向氧化铁溶液中加入70毫升该溶液。继续搅拌三小时。之后，在2,000 G条件下离心20分钟。弃去上清液，并用50毫升超纯水重悬沉淀。再重复离心和重悬步骤两次。按照文本方案中所述方法回收并储存湿润的氢氧化物和羟基氧化物。将四克硅胶置于40毫升7%氢氧化钾溶液中，放在加热板上，用磁力搅拌子搅拌至完全溶解。加入60毫升超纯水。将溶液置于冰上冷却至约20摄氏度，以防止凝胶过快固化。用20%磷酸对硅胶混合物滴定至pH 7.5。然后，趁液体硅胶尚未凝固，迅速将其与320克无菌沙混合，该沙子事先已与18.3克掺汞或掺砷的氧化铁混合均匀。使用刮刀将凝固的混合物捣碎。开始组装玻璃柱时，将水套连接至水冷系统。将系统设置为维持平均20摄氏度的温度。使用内径为三毫米的聚四氟乙烯（PTFE）管，截取适当长度，确保其足以连接色谱柱的入口和出口。然后，从顶部向色谱柱中加入一层湿润的岩棉。加入320克无菌沙。添加最上层，该层由先前混合的无菌沙和固定在硅胶基质中的加标水合无定形氧化铁组成。接着，将进液管连接至蠕动泵管路。将蠕动管的另一端连接到水培养基供应装置。连接持续通入氮气的超纯无菌水，以约每小时两毫升的低流速进行上行流动。此后，用铝箔包裹柱体以避光。两周后，在两层沙子的界面处观察到黑色沉淀物。该黑色区域逐渐侵入上层富含氢氧化铁和羟基氧化铁的区域，到实验结束时，整个上层均变为黑色。连续运行35天后，硫酸盐浓度下降，随后总溶解铁含量出现短暂上升。从第60天开始，总溶解砷浓度显著上升。在第54天对物理和化学参数进行了表征。尽管沿柱体pH值始终保持在接近7的水平，但氧化还原电位发生显著变化：在铁耗尽的区域，硫酸盐还原发生处，氧化还原电位接近负200毫伏；而在柱体上部，细菌和化学铁还原发生处，氧化还原电位接近负毫伏。在底层，溶解态硫酸盐浓度约为每升20毫克，并在富铁区域降低至每升1毫克以下。在缺铁区与富铁区的界面处，硫酸

experimental-column-setup-for-studying-anaerobic-biogeochemical

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

用于研究铁 (氧) 氢氧化物、微量元素和细菌之间厌氧生物地球化学相互作用的实验柱装置

从含有细菌群落的湿地土壤来源富集培养物开始。该培养物表现出铁氨氧化（Feammox）活性，即铵的氧化与三价铁还原相耦合，表明已富集到能够进行此种代谢过程的细菌。使用培养基对菌液进行连续稀释。将稀释后的样品划线接种于添加了三价铁和铵盐的测试琼脂平板上。使用缺乏铁离子或铵根离子的对照平板，或含有铁离子和有机碳但不含铵根离子的对照平板，以排除通过非Feammox途径发生的铁还原反应。将所有培养皿置于含有氮气-二氧化碳混合气体的厌氧手套袋中孵育。在测试平板上，仅那些在将铵氧化的同时将三价铁还原为二价铁的细菌才会形成灰色菌落。这证实了富集培养物中存在Feammox细菌。在测试平板上利用Feammox副产物或在对照平板上利用有机碳的其他细菌不会形成灰色菌落。分离灰色菌落并进行转接培养，以供进一步分析。...

从湿地土壤富集培养物中分离氧化铵型铁还原菌

本文介绍了一种新型反应器设计，称为高密度生物反应器（HDBR），用于培养和研究高密度微生物群落。在此，HDBR成功应用于光生物反应器（PBR）构型，以研究混合高密度藻类群落的氮代谢过程。...

一种用于高密度培养多样化微生物群落的新型生物反应器

我们在实验室规模的垂直流通柱中模拟了一个前寒武纪富铁海洋上升流系统。目的是了解O₂、H₂S和Fe²⁺的地球化学剖面如何在类似前寒武纪海洋的条件下相互作用，并影响微生物群落的结构与功能。2 以及随着蓝细菌产生氧气，Fe(II) 发生演变2结果表明，由于光合作用产生的氧气氧化亚铁离子（Fe(II)），形成了化学跃层。2.

模拟富铁(II)前寒武纪海洋上升流系统以探究光合细菌的生长

自支撑电化学装置用于现场富集呼吸阳极细菌

本文介绍了通过土壤生物活动增强矿物风化的实验装置的构建与操作方法，同时调控已知可促进风化的非生物变量。讨论了该装置运行及样品分析的代表性结果，并提出了改进方向。...

设计与构建通过土壤生物活动增强矿物风化的实验装置

本文的重点是详细介绍从环境中获得的难养厌氧微生物培养基制备的最佳实践。这些方法有助于厌氧菌培养的管理，并可用于支持难以培养的未培养微生物——即“微生物暗物质”的生长。...

一套 原位 用于培养环境来源厌氧微生物的知情模拟培养基格式

本方案提供了详细的步骤，用于构建、灭菌、组装、使用以及重复利用真菌通道柱，以从多种环境基质中富集通过真菌通道相互作用的细菌-真菌配对。...

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我们提供一种保存完整树木韧皮部并对其进行观察前处理的技术。我们构建了一种称为“韧皮部三明治”的装置，可用于引入并观察栖息于韧皮部组织中的节肢动物、微生物及其他生物体。...

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评估厌氧消化与水热碳化耦合工艺在生物能源生产中的应用

了解用于研究厌氧环境中砷和汞等微量元素生物地球化学行为的实验柱装置方法。该技术通过连续水流和采样端口，可追踪微生物活动驱动的铁还原与硫酸盐还原条件下痕量金属的动态归趋。

研究铁（氧）氢氧化物、微量元素与细菌之间厌氧生物地球化学相互作用的实验柱装置设置

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