清醒啮齿类动物经颅电脑刺激

该手术操作的总体目标是实现对清醒啮齿类动物进行可靠且可重复的经颅电刺激脑部。该方法可通过靶向电刺激脑网络以改善运动功能或纠正功能缺陷，从而回答神经调节和神经可塑性领域中的一些关键问题。该技术的主要优势在于，可在不对动物造成不适且对其行为学测量干扰最小的情况下，对清醒啮齿类动物进行多次无创性电刺激脑部干预。

初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为在电极插座植入前寻找从胸部至头部的正确穿行路径以及进行骨组织准备，对于缺乏经验的研究者而言往往具有挑战性。本方法的可视化演示至关重要，因为电极插座植入的手术步骤，以及用于刺激的电极制备与放置，均对实验成功与否起着关键作用。我们的博士候选人Stephanie Haschka将协助完成清醒大鼠的NEBS操作。

演示者}首先将啮齿类动物胸部朝下放置于手术台上。用浸有消毒剂的棉签擦拭已剃毛的头皮区域，随后使其自然风干。

然后确认麻醉深度后，用手术刀从眼睛前部水平位置至耳中部水平位置沿一条直线切开皮肤。接着将大鼠转为仰卧位，暴露胸部并消毒胸区。用两根手指拉伸右侧胸部的侧向皮肤，沿头侧方向做一直线矢状切口。

通过反复张开小剪刀，无创地将皮肤与左侧胸大肌分离，形成皮下囊袋。接着将动物翻转至右侧卧位，从头部开放皮肤的左枕角开始，沿颈部皮下隧道将电缆引线穿至胸大肌囊袋内，并使用止血钳穿透浅筋膜完成通路建立。

小心打开止血钳，夹住连接至铂电极的电极导线末端，注意避免尖锐的金属丝外露。将导线穿过隧道，直至电极进入囊袋，并使灼烧端朝向啮齿类动物的左后肢。随后将动物恢复至俯卧位。

接下来，使用无菌合成编织的不可吸收缝线将铂金板固定在胸肌筋膜上，缝合位置为对角的两个角孔。同样，通过松散结扎在组织隧道入口前形成轻微环状，将电缆固定于筋膜。最后，根据切口大小，使用三到四针皮肤缝线关闭皮肤。

首先用手术刀刮除颅骨侧面的骨膜（即颅骨表面的结缔组织），并用棉签彻底擦拭干净。用鳄鱼夹将切口四角的结缔组织固定，然后将其向侧方牵拉，以保持手术视野开放。接着用0.9%生理盐水浸湿棉签，清洁骨面及周围组织。

然后用3%过氧化氢清洁骨面。使用棉签清除任何可见的残余骨膜。由于固定螺钉可增强镇静剂的附着效果，应选择与螺钉尺寸相匹配的钻头。

在两块不同的骨板上，先用手钻预钻孔，再用骨钻施加轻微颗粒压力，钻出两个骨孔。若存在植入电极（如本视频所示），则在右侧顶骨后部钻第三个孔，用于将来固定穿隧道的电缆。将塑料螺钉插入骨孔并旋入，直至感受到初次摩擦阻力。

然后额外进行三次180度的螺钉旋转。使用镊子检查螺钉的稳定性，若不够牢固，则再增加一次旋转。打开电凝器并预热约五分钟。

将从枕部组织隧道穿出的电缆绕至右侧顶骨螺钉上，随后剪断电缆，保留绕线后约一厘米长的电缆尾端。用手术刀小心剥离电缆末端的绝缘层。然后用氰基丙烯酸酯胶将绕好的电缆固定在螺钉和骨头上。

接下来，将少量无铅焊锡涂于连接器及对电极电缆的裸露导线上，然后将两个预先上锡的部分短暂地压在一起，同时用焊笔接触直至焊锡熔化，从而完成连接。应立即移开焊笔，以避免电缆金属过度受热，导致后续组织损伤。刺激运动皮层时，使用直径为4毫米的插座。

使用带有细锯齿尖头的镊子夹取定制的经颅电刺激（tES）电极套管，在套管底部边缘涂上一层薄薄的氰基丙烯酸盐胶水。套管的内侧边缘应正好位于矢状缝处，而套管内缘的后部应位于前囟点（bregma）处。随后将套管短暂按压在骨面上，直至胶水硬化。

使用光源确保窝洞区域内的骨组织上没有反光的胶水。待窝洞就位且未来的刺激区域无胶水残留后，用少量氰基丙烯酸酯胶水将窝洞的侧缘与邻近组织密封，以避免形成可能导致此处电流分流的液体桥。随后，用氰基丙烯酸酯胶水覆盖所有螺钉。

接下来，将两种组分混合至丙烯酸水泥中，置于小型硅胶管或玻璃器皿内。一旦混合物变得黏稠，立即使用牙科抹刀将其涂抹于骨窗剩余边缘，以实现与骨组织的密封。最后，用牙科丙烯酸水泥覆盖整个颅骨、螺丝、参考电极导线以及植入插座的至多1/3部分。

当所有骨骼被覆盖且骨水泥完全硬化后，移除血管夹，并重新定位皮肤。首先，在经颅电刺激（tES）电极插座中注入一半体积的0.9%生理盐水，并去除气泡。在进行阴极tES实验前，检查银/氯化银电极的氯化状态，必要时重新氯化银/氯化银电极。

在进行阳极经颅电刺激（tES）之前，使用砂纸清除之前刺激留下的过量氯化银沉积物，以确保刺激期间良好的导电性。然后拧紧tES电极帽。将电缆连接到头部的两个连接器上。

然后将啮齿类动物放入实验笼中，电缆连接至笼子上方的旋转连接器，以允许其自由活动。打开刺激器并调整刺激参数。最后，在刺激结束后，断开电缆连接，拧下头部的电极帽，并用棉签清洁并擦干插座。

结果表明，通过形态学改变评估的小胶质细胞激活最早出现在 31.8 安培每平方米，而神经退行性变的最初迹象则在 47.8 安培每平方米时被检测到。样品一至四被评定为阳性。麻醉影响了对直流电刺激（DCS）反应的强度，因为在清醒大鼠中，出现氟标-JC阳性退变神经元的脑片百分比在 47.8 安培每平方米时更高。

此外，高强度刺激下的行为学或分子效应在机制上预期与低强度刺激效应有所不同。一旦掌握，若操作得当，包括胸部电极放置在内的整个技术过程可在40至45分钟内完成。若不进行手术放置对侧电极，则通常仅需10至15分钟。

观看本视频后，您应能够充分理解如何为不同的 NEBS 刺激技术建立永久性电极装置，以及如何在清醒啮齿类动物中实施 eTS。请务必注意，若电极在刺激前未充分制备，使用电流可能对动物造成伤害。因此，在实施该操作前，必须采取相应预防措施，例如在阴极刺激前对电极进行重新氯化处理，或在阳极刺激前清除电极表面碎屑。