Name: 人脑脊液 Endopeptidomic 分析的样品制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习人脑脊液内源性肽的质谱分析方法，通过分子量截留过滤和色谱预分级技术，显著扩展已知脑脊液肽组，有助于发现神经退行性疾病的新型低丰度生物标志物。

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非常感谢Tanveer Batth及其同事在建立预分级分离方法过程中提供的建议。
本工作获得了瑞典研究理事会、Wallström和Sjöblom基金会、Gun和Bertil Stohne基金会、Magnus Bergwall基金会、Åhlén基金会、Alzheimerfonden、Demensförbundet、Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor、Knut和Alice Wallenberg基金会、Frimurarestiftelsen以及FoU-Västra Götalandsregionen的资助。
本项目的主要资助对象为 Kaj Blennow、Henrik Zetterberg 和 Johan Gobom。

&#160;以下所述方案是对先前研究中所用方法的优化版本，此前研究已从人脑脊液中鉴定出大量内源性肽段15。相较于原始方案，更新内容包括对脑脊液化学预处理步骤的微小调整，以及对离线高pH反相高效液相色谱预分离所用梯度的优化。
伦理考量
所有关于瑞典患者和对照材料的研究均已获得伦理委员会的批准：St. Göran（参考编号 2005-554-31/3）。阿姆斯特丹痴呆队列的脑脊液样本以及在伦敦国家神经病学和神经外科医院采集的样本，均在获得所有参与患者书面知情同意及地区伦理委员会批准后用于研究。本研究所使用的材料主要为出于诊断目的采集后剩余的脑脊液，且在纳入研究前已去标识化。无法追溯任何样本至特定个体或捐赠者群体。
1. 人脑脊液（CSF）的提取：
<ol>
	<li>采用标准化方案通过腰椎穿刺（必须由经过培训的医师操作）采集脑脊液22。</li>
	<li>以 2,500 × g 离心 20 分钟，去除细胞碎片及其他不溶性物质。</li>
	<li>目视检查脑脊液样本是否变色，以判断是否存在穿刺出血导致的血液污染。血液中蛋白质浓度显著较高，且含有蛋白酶，可能对分析结果产生重大影响。</li>
</ol>
2. 脑脊液预处理（1.5 mL 样品体积，无需定量）：
<ol>
	<li>在室温（RT）下解冻1.5 mL脑脊液（CSF）分装样品，将内容物转移至10 mL聚丙烯管中，并加入80 µL 1 M三乙基铵碳酸氢盐（TEAB）作为缓冲剂。</li>
	<li>加入0.65 mL 8 M盐酸胍（GdnHCl）（终浓度GdnHCl：2.4 M），在室温下轻轻涡旋振荡10分钟。 
	注意：变性剂GdnHCl既影响溶剂黏度，又与多肽链相互作用，从而使蛋白质解折叠在能量上更为有利23。因此，GdnHCl可溶解蛋白质聚集体，并在后续过滤过程中提高内源性肽段的回收率。</li>
	<li>加入60 µL 200 mM水溶液三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）（终浓度TCEP：6 mM），在55 °C孵育1小时，以还原半胱氨酸二硫键。</li>
	<li>加入35 µL 400 mM碘乙酰胺（IAA）（终浓度IAA：4 mM），在室温避光条件下孵育30分钟，以烷基化半胱氨酸。烷基化基团的引入可确保半胱氨酸残基在后续样品处理过程中的任何阶段均不会自发形成新的二硫键。</li>
	<li>加入3.25 mL去离子水，短暂涡旋混匀，以在进行分子量截留（MWCO）过滤前稀释样品，最终样品体积为5.5 mL。此步骤可将GdnHCl浓度稀释至1 M以下，因较高浓度有时会导致滤器装置中的聚合物物质发生渗漏。</li>
</ol>
3. 脑脊液预处理（10 个 150 µL 样品体积，等压标记定量）：
<ol>
	<li>在室温下解冻10名个体的脑脊液（CSF）分装样品各150 µL，随后将样品分别转移至10个1.5 mL低吸附微量离心管中，并加入8 µL 1 M TEAB作为缓冲剂。</li>
	<li>加入65 µL 8 M 盐酸胍（GdnHCl）（实际浓度GdnHCl：2.4 M），在室温下轻轻涡旋振荡10分钟。</li>
	<li>加入6 µL 200 mM水溶液TCEP（实际浓度TCEP：6 mM），于55 °C孵育1小时，以还原半胱氨酸二硫键。</li>
	<li>加入3.5 µL 400 mM水溶液碘乙酰胺（IAA）（实际浓度IAA：6 mM），在室温避光条件下孵育30分钟，以烷基化半胱氨酸残基。</li>
	<li>准备等重标记试剂盒（例如，Tandem Mass Tag 10plex等重标记试剂）。在打开前使等重标记试剂小瓶恢复至室温，以避免试剂吸潮；加入41 µL高效液相色谱级乙腈（AcN），轻轻振荡5分钟以溶解试剂。</li>
	<li>将30 µL等重标记试剂溶液转移至对应的样品中，在室温下轻柔振荡孵育1小时。该等重标记试剂含有NHS-酯基团，可与肽段N端的伯胺以及赖氨酸残基发生反应。</li>
	<li>加入8 µL 5%羟胺溶液（实际浓度羟胺：0.16%），在室温下轻轻振荡20分钟以淬灭标记反应。由于各单独标记的样品将被合并，必须确保标记反应完全终止。通过加入过量的羟胺（提供大量伯胺基团），使剩余的等重标记试剂发生反应而失活。</li>
	<li>将10个单独标记的样品全部转移至一个15 mL聚丙烯管中合并。</li>
	<li>向合并后的样品中加入6.4 mL去离子水，短暂涡旋混匀，使乙腈（AcN）浓度从12%降至3%，盐酸胍（GdnHCl）浓度降至1 M以下；较高浓度的盐酸胍有时会导致过滤装置中的聚合物物质溶出。</li>
</ol>
4. 分子量截留过滤
<ol>
	<li>为去除潜在污染物，先用 10 mL 含 1 M 盐酸胍和 25 mM TEAB 的水溶液润洗 MWCO 滤膜，于 2,500 × g 和室温下离心 15 分钟，弃去滤过液（FT）。</li>
	<li>将全部样品体积加载至滤膜上（5 mL 未标记 CSF（步骤 2.5）或 10 mL 等压标记 CSF（步骤 3.9）），于 2,500 × g 和室温下离心 30 分钟，将滤过液（FT）保留在收集管中。过滤的结果是将肽段和小分子蛋白与大分子蛋白及残留细胞碎片分离。此步骤可视为肽组学中相当于蛋白质组学实验中利用蛋白酶解产生肽段的操作。</li>
	<li>向滤膜中加入 5 mL 25 mM TEAB 水溶液，于 2,500 × g 和室温下离心 15 分钟，以提高肽段回收率。</li>
	<li>涡旋振荡前两步合并的滤过液（共 10 mL 未标记样品或 15 mL 等压标记样品），随后进行样品酸化处理。</li>
</ol>
5. 通过固相萃取进行脱盐和样品纯化
<ol>
	<li>在进行固相萃取（SPE）之前，将步骤4.4中获得的滤液样品酸化。酸化处理旨在增强溶质（肽段）与SPE小柱固定相之间的相互作用。</li>
	<li>对于未标记样品（体积10 mL）：加入550 µL的1%三氟乙酸（TFA），最终样品体积为10.55 mL，含0.05% TFA。</li>
	<li>对于等压标记样品（体积15 mL）：加入20 mL的0.1% TFA以实现酸化，并将乙腈（AcN）浓度从3%降低至1%，最终样品体积为30 mL，含0.066% TFA。 
	注意：TFA还作为离子对试剂发挥作用，可改善那些自身无法与SPE小柱填料产生足够强疏水相互作用而被保留的肽段的保留效果。</li>
	<li>若pH &#62;3，用20%磷酸滴定样品，直至样品pH &#60;3。</li>
	<li>通过加入1 mL的84%乙腈（AcN）和0.1%甲酸（FA）对SPE小柱进行活化，并弃去穿流液（FT）。重复一次。活化小柱滤膜的目的是去除可能在后续步骤中随肽段一同洗脱的杂质；此外，活化还能提高滤膜的通透性。</li>
	<li>通过加入1 mL的0.1% TFA对SPE小柱进行平衡，并弃去穿流液（FT）。重复一次。确保在最后一次平衡步骤后滤膜不干燥——在滤膜上方保留少量液体。平衡处理的目的是去除活化步骤中残留的疏水性物质（乙腈），从而使滤膜处于适合保留肽段的状态。</li>
	<li>将全部样品体积（未标记样品为10.55 mL，等压标记样品为30 mL）分多次上样至小柱，让穿流液流入废液。确保在每次上样之间以及最后一次上样后小柱不干燥——在滤膜上方保留少量液体。</li>
	<li>用1 mL的0.1% TFA冲洗滤膜，以去除盐类和试剂，并弃去穿流液（FT）。重复一次。每次洗涤后均需确保小柱不干燥——在小柱上方保留少量液体。</li>
	<li>在小柱下方放置1.5 mL低吸附微量离心管，通过向小柱中加入1 mL的84%乙腈（AcN）和0.1%甲酸（FA）进行洗脱。</li>
	<li>使用真空离心浓缩仪在不加热的条件下蒸发去除脱盐后样品中的溶剂，直至干燥。干燥后的样品可储存于-80 °C，或立即进行高pH分级分离。</li>
</ol>
6. 离线高pH反相高效液相色谱样品分组
<ol>
	<li>配制高pH水相流动相（HpH）： 
	HpH缓冲液A：纯水 
	HpH缓冲液B：84%乙腈（AcN） 
	HpH缓冲液C：25 mM NH4OH 
	HpH上样缓冲液：2.5 mM NH4OH，2%乙腈（AcN） 
	注：HpH上样缓冲液用作转移溶液和样品缓冲液</li>
	<li>将样品在16 µL HpH上样缓冲液中轻轻振荡重悬，持续20分钟</li>
	<li>将15 µL样品上样至配备内置96深孔板馏分收集器的高效液相色谱（HPLC）系统，系统配置参照Batth 等20的方法并稍作修改。以100 µL/min流速在pH稳定的C18反相色谱柱（3.5 µm，2.1 mm × 250 mm）上进行分离，并在60分钟线性梯度内每分钟收集一个馏分</li>
	<li>采用以下梯度时间点：t = 0 min，B = 1%，C = 10%；t = 4 min，B = 1%，C = 10%，开始馏分收集；t = 76 min，B = 70%，C = 10%，结束馏分收集；t = 76.5 min，B = 85%，C = 10%；t = 80 min，B = 85%，C = 10%；t = 80.5 min，B = 1%，C = 10%；t = 90 min，B = 1%，C = 10%</li>
	<li>以环形模式在12个孔中重复收集馏分，使间隔12分钟的馏分依次合并，最终获得12个馏分，每个馏分包含6个合并的子馏分</li>
	<li>在室温下以3000 rpm转速通过真空离心浓缩去除样品中的溶剂至干燥，并在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析前将样品保存于-80 °C</li>
</ol>
7. 液相色谱-质谱联用（LC-MS）
<ol>
	<li>配制水相流动相： 
	缓冲液A：0.1% FA 
	缓冲液B：0.1% 甲酸，84% 乙腈 
	上样缓冲液：0.05% 三氟乙酸，2% 乙腈 
	注意：上样缓冲液用作上样泵的运输溶液、样品缓冲液和流动相。</li>
	<li>将12个组分分别加入6 µL上样缓冲液，在室温下振荡20分钟，重新溶解。</li>
	<li>将5 µL样品加载至纳米流速HPLC系统，采用捕获柱配置（捕获柱：75 µm × 2 cm，C18，100 Å 孔径，3 µm 粒径；分离柱：C18，75 µm × 500 mm，100 Å 孔径，2 µm 粒径；以 150 nL/min 流速进行肽段分离，梯度设置如下：t = 0 min，B = 2%；t = 10 min，B = 2%；t = 11 min，B = 7%；t = 100 min，B = 26%；t = 170 min，&#160;B = 45%；t = 175 min，B = 80%；t = 181 min，B = 2%&#160;且 t = 210 min 时，B = 2%。</li>
	<li>通过纳米电喷雾电离（nano-ESI）接口将高效液相色谱仪与高分辨率杂交质谱仪连接，进行质谱分析。在MS模式下，以120,000分辨率（AGC目标值2.0e5）记录全扫描谱图 m/z 范围 350 - 1,400。
	<ol>
		<li>以数据依赖性采集模式运行质谱仪，从强度最高的前十个峰中选择进行二级质谱（MS/MS）分析 m/z &#62; 150，且在碎片离子分析中强度范围为1.0e4–1.0e5。使用1的四极杆隔离窗口隔离前体离子 m/z，最大注入时间为100 ms，射频透镜设置为60%。</li>
		<li>采用动态排除，排除时间为15 s，且 m/z 耐受度为±10 ppm。在高能碰撞解离（HCD）池中进行碎裂，并在轨道阱中以50,000分辨率（AGC目标值5.0e4）记录二级质谱（MS/MS）采集数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 肽段鉴定
<ol>
	<li>进行肽段鉴定时，将质谱分析得到的 .raw 文件提交至蛋白质组学搜索引擎，并应用以下设置： 
	注意：在我们之前的研究15中，同时使用了三种搜索引擎：Mascot v2.4、Sequest HT 和 PEAKS v7.5，此处指定的参数在三种引擎中均被采用，除非另有说明。大多数可调参数在肽段/蛋白质鉴定中具有通用性，任何给定的搜索引擎中都应有对应的设置选项。 
	谱图选择器： 
	前体离子最小质量：350 Da 
	前体离子最大质量：5,000 Da 
	扫描类型：全扫描（Full） 
	信噪比阈值：1.5 
	序列数据库搜索 
	数据库：UniProt_SwissProt [版本2015_11] 
	物种分类：Homo sapiens 
	酶解酶：无 
	最大漏切位点数：0 
	仪器类型（仅 Mascot）：ESI-Trap 
	最短肽段长度（仅 SequestHT）：6 
	最长肽段长度（仅 SequestHT）：144 
	前体离子质量容差：15 ppm 
	碎片离子质量容差：0.05 Da 
	固定修饰：Carbamidomethyl (C)；[若标记] TMT10plex (N端) 
	可变修饰：Oxidation (M)；[若标记] TMT10plex (K) 
	肽谱匹配（PSM）验证器 
	Percolator（仅 Mascot 和 Sequest HT）或 Decoy Fusion（仅 PEAKS） 
	目标错误发现率（FDR）：0.01 
	验证依据：q值</li>
</ol>

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<li>Hölttä, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li>
</ol>

作者之间未报告存在任何竞争利益，无论是经济上的还是其他方面的。

在先前开发的通过分子量超滤回收内源性肽的方案中引入高pH反相高效液相色谱预分级步骤11 降低了相对样本复杂性，从而允许研究体积大5倍的样本。这进一步提高了每个组分中肽段亚群的浓度，进而增加了检测低丰度肽段的可能性。
通过采用三种蛋白质组学软件并行进行内源性肽段鉴定的策略，可将已知的脑脊液内肽组扩大十倍以上。在对一份混合脑脊液样本材料进行的初步试验中，共鉴定出16,395种内源性肽段。其中包含大量来源于先前在神经退行性疾病相关研究中被报道过的蛋白质的内源性肽段。上述研究中鉴定出的多个肽段目前正于本实验室被评估作为生物标志物的潜力。该过程包括多个步骤：通过向脑脊液中添加带有重同位素标记的合成类似物来验证肽段的身份，建立靶向质谱检测方法，评估肽段在储存及冻融循环过程中的稳定性，以及分析不同临床队列样本。
对原始方案进行了修改，以避免在MWCO过滤过程中由于样品中GdnHCl浓度过高而引入污染物（步骤2.5和3.5）。对预分离梯度（步骤6.3.1）进行了优化，延长了载样量，并采用线性梯度...

脑脊液（CSF）中的生物标志物目前正在改变神经退行性疾病的科研方向。在阿尔茨海默病——这种全球影响超过6000万人的最常见神经退行性疾病中1,2由肽类物质β-淀粉样蛋白、微管稳定蛋白tau以及一种磷酸化tau形式组成的生物标志物三联组，能够以高灵敏度和特异性检测该疾病，并已被纳入诊断研究标准3在其他神经退行性疾病中，例如帕金森病和多发性硬化症，蛋白质组学研究已鉴定出大量生物标志物候选分子，其中部分分子目前正在临床研究中接受评估。4,5,6.
除了蛋白质外，脑脊液（CSF）还含有大量内源性肽7,8,9,10,11,12。这些肽是多种脑源性蛋白质的裂解产物，也可能是疾病生物标志物的重要来源。为了增加已鉴定的人类脑脊液内源性肽的数量，并推动在临床研究中开展脑脊液内肽组学分析，研究人员建立了一种样本制备与液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法（简要的实验流程见图1）。在最近的一项研究中应用该方法后，从多名非特异性诊断个体的混合脑脊液样本中鉴定出近16,400种内源性脑脊液肽，使已知的脑脊液内肽组规模扩大了十倍13。该方法可选择性地结合等重标记技术用于定量分析。
样品制备
脑脊液（CSF）中蛋白质质量的主要来源是穿过血脑屏障的血浆成分（例如白蛋白和免疫球蛋白）14,15。这些高丰度蛋白会阻碍对低丰度、脑源性样本组分的检测。内源性肽可轻松与高丰度蛋白分离，从而可显著增加用于液相色谱-质谱（LC-MS）分析的脑脊液肽提取物体积，进而实现对低丰度肽的检测。
在本方案中，采用分子量截断（MWCO）过滤法将脑脊液（CSF）肽段与蛋白质组分分离；该方法已在多项先前研究中被使用8,9,10,11,12,16。过滤步骤之后进行离线反相高效液相色谱（RP HPLC）预分级，使用高pH流动相梯度完成。通过串联进行两次RP HPLC步骤，并以pH为主要区别，两个步骤之间的选择性差异主要源于肽段电荷状态不同所导致的保留行为改变。在酸性条件下的LC-MS分析之前应用高pH肽段预分级，已被证明可有效提高肽段鉴定数量17,18，甚至在复杂生物样品中比其他正交分离模式（如强阳离子交换（SCX）和RP）更具优势19,20。为了缩短分析时间，采用了合并策略，将每第12个馏分进行合并（例如，第1、13、25、37和49馏分），由于RP HPLC具有高分辨能力，在LC-MS步骤中仍能很大程度上避免不同馏分中肽段的共洗脱20,21。
多肽鉴定
肽组学研究中的肽段鉴定与蛋白质组学研究不同，因为在数据库搜索中无法指定酶切位点，因此鉴定率通常较低11. 最近的一项研究13&#160;结果表明，当使用自适应评分算法 Percolator 修改 Sequest 和 Mascot 软件的默认评分算法后，内源性肽段的鉴定率显著提高，提示针对内源性肽段的最优评分算法与胰蛋白酶肽段的不同13. 在该研究中，基于自动肽的鉴定 从头合成 使用 PEAKS（BSI）软件进行测序，结果表明其与两种基于碎片离子指纹图谱的搜索引擎具有互补性，从而获得了数量显著更多的已鉴定肽段。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1 M 三乙基碳酸氢铵</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich</td><td>17902-100ML</td><td>TEAB</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;8 M 盐酸胍</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7294-100ML</td><td>GdnHCl</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐</td><td>Pierce</td><td>20490</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>SIGMA</td><td>I1149-5G</td><td>IAA</td></tr><tr><td>羟胺 50% (w/w)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457804-50ML</td><td></td></tr><tr><td>乙腈，远紫外级，HPLC梯度纯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-2L</td><td>AcN</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>56302-1mL-F</td><td>FA</td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>TFA</td></tr><tr><td>氢氧化铵溶液</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>30501-1L-1M</td><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置，含 Ultracel-30 膜</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td>MWCO-过滤器</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18，100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT023590</td><td>SPE-柱</td></tr><tr><td>Resprep 12-通道固相萃取装置&amp;nbsp;</td><td>Restek</td><td>26077</td><td>真空装置</td></tr><tr><td>TMT10plex 同重同位素标记试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90110</td><td>TMT10plex</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano 液相色谱系统</td><td>Dionex</td><td>5200.0356</td><td>在线样品分离</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RPLC 快速分离二元系统</td><td>Dionex</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td><td>离线高pH值分级分离</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid 质谱仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>样品分析用质谱仪</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td><td>蛋白质组学搜索平台</td></tr><tr><td>Mascot v2.4</td><td>Matrix Science</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>蛋白质组学搜索引擎</td></tr><tr><td>Sequest HT</td><td>Thermo</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>蛋白质组学搜索引擎</td></tr><tr><td>PEAKS v7.5&amp;nbsp;</td><td>Bioinformatic Solutions Inc.)</td><td>&amp;nbsp;-&amp;nbsp;</td><td>蛋白质组学搜索引擎</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap 100，75 &amp;micro;m × 2 cm，C&lt;sub&gt;18&lt;/sub&gt;，100 &amp;Aring; 孔径，3 &amp;micro;m 粒径</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>捕获柱（纳米液相色谱）</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap C18，75 &amp;micro;m × 500 mm，100&amp;Aring; 孔径，&amp;nbsp;2 &amp;micro;m 粒径</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164942</td><td>分离柱（纳米液相色谱）</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac 高容量浓缩仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SC210A-230</td><td>SpeedVac/真空浓缩仪</td></tr><tr><td>XBridge 肽段 BEH C18 柱，130&amp;Aring;，3.5 &amp;micro;m，2.1 mm × 250 mm</td><td>Waters</td><td>186003566</td><td>分离柱（微米液相色谱）</td></tr></tbody></table>

人脑脊液中内肽组学分析的样品制备

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

本方案描述了一种用于鉴定人脑脊液（CSF）中内源性肽段的方法。为此，将一种基于分子量截断（MWCO）过滤和质谱分析的既往方法，与一个离线的高pH反相高效液相色谱预分离步骤相结合。
脑脊液分泌是清除中枢神经系统细胞脱落分子的主要途径。因此，中枢神经系统的许多生理过程都会在脑脊液中有所反映，使其成为一种有价值的诊断性液体。脑脊液成分复杂，所含蛋白质的浓度范围跨越8至9个数量级。除蛋白质外，先前的研究还证实脑脊液中存在大量内源性肽段。尽管这些肽段的研究尚不如蛋白质深入，但它们也可能具有作为生物标志物的潜在价值。
通过分子量截留过滤（MWCO）将内源性肽从脑脊液（CSF）的蛋白质成分中分离出来。通过去除样品中大部分蛋白质成分，可增加被检测样品的体积，从而提高内源性肽的总检测量。为应对滤过后的肽混合物复杂性，在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析之前，采用了在碱性pH条件下进行的反相（RP）高效液相色谱预分离步骤。该分离步骤结合了一种简单的合并策略，将60个组分合并为12个，从而在很大程度上避免共洗脱的同时显著减少了分析时间。
采用三种不同的多肽/蛋白质鉴定软件进行自动化多肽鉴定，并对结果进行整合。这些软件之间具有互补性而非可比性，三者之间的鉴定结果重叠部分不足15%。

此处所述方法在引入样品预分级之前，已在三项研究中得到应用与评估（表1）。第一项研究采用离线液相色谱法将脑脊液组分点样至MALDI靶板，共鉴定出730种内源性肽段11在接下来的两项研究中，采用了等压标记法。主要应用于病例/对照研究，以同时鉴定和表征脑脊液内肽组和蛋白质组中潜在的生物标志物24，在第二项研究中，采用等压标记法监测治疗效果 体内 γ-分泌酶抑制剂对脑脊液中肽表达在36小时内的影响16在病例/对照研究中，共鉴定出437种内源性肽，其中64种在阿尔茨海默病患者与健康对照个体之间的浓度存在显著差异。第三项治疗研究鉴定出1798种内源性肽，所监测的肽中有11种可显示出对治疗的响应。
在第四项研究中，目的是增加已鉴定脑脊液肽段的数量，特别是鉴定丰度较低的肽段。因此，研究中加入了HpH反相色谱法进行肽段预分离，并使用了10倍体积的脑脊液样本，最终鉴定出16,395个肽段。该研究未进行等重标记。除样本分馏外，最近的一项研究采用...

本文介绍了一种对人脑脊液（CSF）中内源性肽进行质谱分析的方法。通过采用分子量截断过滤、色谱预分离、质谱分析以及后续多种肽段鉴定策略的组合，与以往研究相比，已知的脑脊液肽组规模几乎扩展了十倍。

本方案描述了一种用于鉴定人脑脊液（CSF）中内源性肽段的方法。为此，采用了一种先前开发的……

本实验方案的目的是制备和分析人脑脊液样本，用于内源性肽段的液相色谱-质谱（LC-MS）分析。在LC-MS分析前进行肽段预分离步骤，可增加鉴定到的肽段数量，并实现对相对低丰度脑脊液肽段的检测。脑脊液中的内源性肽段是一类尚未被充分研究的钙结合分子，可能包含神经退行性疾病的重要新型生物标志物。该方法可利用质谱技术对脑脊液肽组进行广泛表征。该方法的主要优势在于能够富集低丰度脑脊液肽段，并兼容多重等重标记技术，因此适用于临床研究。迄今为止，我们主要将该方法应用于脑脊液样本的分析，但已有初步数据显示，经过少量修改后，该方法也可用于血浆和组织样本的分析。首先，在室温下将1.5毫升脑脊液分装样本置于滚轴混合器上解冻。解冻后，将样本转移至10毫升聚丙烯管中，并加入80微升1摩尔的三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液（TAB）作为缓冲剂。随后加入0.65毫升8摩尔的盐酸胍，以溶解蛋白质聚集体，并在室温下轻轻涡旋振荡10分钟。接下来，加入60微升200毫摩尔的水溶液三(2-羧乙基)膦（TCEP），并在55°C下孵育

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

人脑脊液 Endopeptidomic 分析的样品制备

存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）临床样本是疾病研究的宝贵材料。本文展示了一种样本制备流程，可实现对显微切割的FFPE组织进行深入的蛋白质组学分析。...

福尔马林固定及石蜡包埋组织的蛋白质组学样品制备

我们描述了一种实时PCR方案，用于分析脑脊液（CSF）中的microRNA。除RNA提取步骤外，该方法可推广应用于从其他体液、培养细胞或组织样本中提取的RNA。...

利用定量实时聚合酶链式反应进行脑脊液微小RNA谱分析

一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE...

共识脑源性蛋白质提取方案：用于人和小鼠脑蛋白质组研究的双向差异凝胶电泳与微型双向电泳免疫印迹法

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。...

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

眼微血管床的蛋白质组表征对于深入理解人类多种眼病具有重要意义。本研究展示了一种高效、快速且稳健的方法，用于从小血管中提取蛋白质并进行样品制备，以开展基于质谱的蛋白质组学分析，采用猪短后睫状动脉作为模型血管。...

基于质谱的蛋白质组学分析中眼微血管的样品制备

神经肽的质谱表征可提供序列、定量和定位信息。该优化的工作流程不仅适用于神经肽研究，也适用于其他内源性肽类。本文提供的实验方案描述了使用液相色谱-电喷雾电离质谱（LC-ESI-MS）、基质辅助激光解吸/电离质谱点样（MALDI-MS spotting）以及基质辅助激光解吸/电离质谱成像（MALDI-MS...

Callinectes sapidus 中神经肽的多维度质谱分析

这种结合质谱法蛋白质组学分析的生化纯化方法有助于对淀粉样纤维核心进行稳健表征，可能加速阿尔茨海默病防治靶点的发现。...

脑源性淀粉样纤维核心的生化纯化与蛋白质组学表征

本文建立了一种利用少量新鲜冷冻脑组织切片的实验方案，结合常规高速离心法与尺寸排阻色谱技术，以获取小细胞外囊泡作为神经系统疾病微小RNA（miRNA）生物标志物的来源。...

利用新鲜冷冻人脑组织切片释放的小细胞外囊泡中的microRNA cargo

本研究方案概述了脑脊液宏基因组高通量测序（mNGS）的优化工作流程。该方法针对低生物量样本特有的挑战进行改进，可在不同资源条件下实现可靠的病原体检测，为神经感染性疾病研究应用提供了通用的技术基础。...

脑脊液宏基因组高通量测序用于中枢神经系统病原体检测

在胚胎早期脑发育过程中，脑室脑脊液（CSF）包绕神经上皮及大脑皮层前体细胞。本文介绍了从不同发育阶段的啮齿类胚胎中分离脑室脑脊液的方法，以研究其生物学功能。此外，我们还展示了大脑皮层组织外植体的分离与培养技术，该技术可在极少量培养基或脑脊液条件下实现外植体的生长。...

从啮齿类动物胚胎中分离脑脊液并用于离体大脑皮层组织外植体研究

学习人脑脊液内源性肽的质谱分析方法，通过分子量截留过滤和色谱预分级技术，显著扩展已知脑脊液肽组，有助于发现神经退行性疾病的新型低丰度生物标志物。

人脑脊液中内肽组学分析的样品制备

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