Name: 亚甲蓝染料注射液评价泌尿道结肠梗阻的缺陷 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: 学习使用亚甲蓝染料注射技术评估小鼠胚胎期泌尿道连接处梗阻缺陷的方法。该技术通过向肾盂注射染料，可直观显示肾脏、输尿管和膀胱结构，为研究先天性泌尿道发育异常提供简单有效的可视化手段。

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感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症发育生物学实验室（CDBL/NCI/NIH）的Alan O. Perantoni博士对本论文提交工作的支持。同时感谢CDBL/NCI/NIH的Michael Hall博士和Nirmala Sharma对本文稿的编辑。感谢SAIC的Lai Thang在小鼠饲养方面提供的出色支持。本研究工作由美国国立卫生研究院、国家癌症研究所及癌症研究中心资助。

小鼠（Wnt5a flox/flox 小鼠 (Wnt5atm1.1Tpy) 和 Dll1Cre 品系，UVJO 小鼠模型）7 的饲养管理遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南，并在经国家癌症研究所-Frederick 动物护理与使用委员会批准的方案下进行研究。
1. 亚甲蓝染料溶液的制备
<ol>
	<li>称取0.1 g亚甲蓝粉末。</li>
	<li>将亚甲蓝加入10 mL生理盐水或1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，通过涡旋充分溶解。</li>
	<li>使用注射器滤器（膜孔径0.45 µm）过滤10 mg/mL的亚甲蓝溶液，以防止注射时发生堵塞。</li>
	<li>将无菌头皮静脉输液套件（27G×3/4″）与一支3 mL一次性注射器组装，并用3 mL过滤后的亚甲蓝溶液充满注射器。 
	注意：为防止静水压力导致染料自行流出，应将针尖置于盛有亚甲蓝溶液的注射器上方。</li>
</ol>
2. 产前胚胎的解剖
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁解剖剪和镊子。</li>
	<li>为在E18.5或E19.5收集围产期胚胎，首先使用CO2吸入法对怀孕小鼠实施安乐死，然后根据NIH指南进行颈椎脱位。 
	注意：怀孕雌性小鼠通常从E18.5开始分娩，但较大的肾脏更易于操作。因此，接近出生时间的E19.5肾脏更便于进行本项分析。然而，双侧尿路梗阻的仔鼠在出生后会死亡。应根据实验小鼠的具体特征，通过实验经验确定合适的采集时间点。</li>
	<li>在腹部腹侧表面喷洒70%乙醇，然后使用解剖剪和镊子沿腹侧打开腹腔。</li>
	<li>提起整个子宫，并用解剖剪在子宫角末端处剪断，将其从体内分离。</li>
	<li>在培养皿中用1×PBS冲洗整个子宫。</li>
	<li>用解剖剪将子宫分段剪开，并用解剖镊子去除胎盘蜕膜，以暴露卵黄囊中的胚胎。</li>
	<li>先去除卵黄囊，再用解剖镊子去除羊膜，从而释放出围产期胚胎。</li>
	<li>用解剖剪将胚胎头部剪除。用无菌纱布擦去多余血液。将胚胎腹面朝上固定于配备数码相机的解剖显微镜下进行成像。如有需要，取其尾部用于基因型鉴定。 
	注意：每次仅对一个胚胎进行注射操作。</li>
	<li>用镊子轻轻撕开胚胎皮肤，小心打开其腹腔。然后，用镊子剪断或拉出肝脏、胃和肠道等多余器官和组织，以暴露位于背部的肾脏、输尿管和膀胱（图1A）。如有必要，用无菌纱布吸除解剖后胚胎上的多余血液。 
	注意：过多血液会影响肾盂的识别，从而干扰染料注射。</li>
</ol>
3. 向肾盂注射亚甲蓝染料并监测染料流动
<ol>
	<li>通过静水压力将亚甲蓝溶液从针尖排出，以去除针头和管路中的气泡。将装有染料溶液的注射器抬高至针尖水平以上以启动液体流动，然后降低注射器以停止流动。</li>
	<li>将针头插入靠近近端输尿管的肾盂部位，注意一旦放置到位后避免扰动。向肾脏注射染料以确定其尿路是否阻塞。 
	注意：应首先以相同方法对任何异常肾脏7进行染料注射，以评估其尿路阻塞情况。</li>
	<li>将注射器抬高约 20 cm 以提供静水压力，使 15 µL - 60 µL 的染料溶液流出。若注射器抬高至此高度，则流速约为 3 µL/s。</li>
	<li>观察染料的蓝色显色过程：首先出现在肾盂，随后沿输尿管延伸，最终进入膀胱腔。 
	注意：若输尿管正确插入膀胱，约 5 秒后可在膀胱腔内观察到微弱的染料着色。若膀胱腔内未出现染料着色，应让染料在阻塞部位积聚约 15 秒。</li>
	<li>放下注射器以停止染料流动，并将针头从肾脏中取出。</li>
	<li>使用连接体视显微镜的相机和成像程序，拍摄被染料标记的肾脏、输尿管和膀胱的图像。</li>
	<li>在实验记录本中记录肾脏的肾积水情况、输尿管扩张程度以及染料溶液的最终分布位置。</li>
	<li>按照步骤 3.1) 至 3.5) 所述方法对对侧肾脏进行注射，总染料流动时间约为 20 秒。 
	注意：若输尿管正确插入膀胱腔，膀胱腔将充满染料溶液，表现为明显的蓝色。完成尿路连接处阻塞评估后，可将输尿管和膀胱固定，用于后续切片处理。</li>
</ol>

<ol><li>Rasouly, H. M., Lu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+urinary+tract+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lower urinary tract development and disease.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5, 307-342 (2013).</li>
<li>Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Box+Genes+in+the+Kidney+and+Urinary+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Box Genes in the Kidney and Urinary Tract.</a> Curr Top Dev Biol. 122, 245-278 (2017).</li>
<li>Bohnenpoll, T., Kispert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ureter+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ureter growth and differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 36, 21-30 (2014).</li>
<li>Nicolaou, N., Renkema, K. Y., Bongers, E. M., Giles, R. H., Knoers, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic%2C+environmental%2C+and+epigenetic+factors+involved+in+CAKUT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Genetic, environmental, and epigenetic factors involved in CAKUT.</a> Nat Rev Nephrol. 11, 720-731 (2015).</li>
<li>Tripathi, P., Wang, Y., Casey, A. M., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absence+of+canonical+Smad+signaling+in+ureteral+and+bladder+mesenchyme+causes+ureteropelvic+junction+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Absence of canonical Smad signaling in ureteral and bladder mesenchyme causes ureteropelvic junction obstruction.</a> J Am Soc Nephrol. 23, 618-628 (2012).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Id2+haploinsufficiency+in+mice+leads+to+congenital+hydronephrosis+resembling+that+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Id2 haploinsufficiency in mice leads to congenital hydronephrosis resembling that in humans.</a> Genes Cells. 9, 1287-1296 (2004).</li>
<li>Yun, K., Perantoni, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydronephrosis+in+the+Wnt5a-ablated+kidney+is+caused+by+an+abnormal+ureter-bladder+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Hydronephrosis in the Wnt5a-ablated kidney is caused by an abnormal ureter-bladder connection.</a> Differentiation. 94, 1-7 (2017).</li>
<li>Uetani, N., Bouchard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plumbing+in+the+embryo%3A+developmental+defects+of+the+urinary+tracts%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Plumbing in the embryo: developmental defects of the urinary tracts.</a> Clin Genet. 75, 307-317 (2009).</li>
<li>Murawski, I. J., Watt, C. L., Gupta, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+urinary+tract+defects+in+mice%3A+methods+to+detect+the+presence+of+vesicoureteric+reflux+and+urinary+tract+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing urinary tract defects in mice: methods to detect the presence of vesicoureteric reflux and urinary tract obstruction.</a> Methods Mol Biol. 886, 351-362 (2012).</li>
<li>Weiss, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephric+duct+insertion+requires+EphA4%2FEphA7+signaling+from+the+pericloacal+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nephric duct insertion requires EphA4/EphA7 signaling from the pericloacal mesenchyme.</a> Development. 141, 3420-3430 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠肾脏自E16.5开始具备功能，理论上从该时间点起即可进行染料注射检测。然而，此时肾脏体积过小，难以注射染料溶液，且诸如肾积水和输尿管积水等表型尚不明显，因为这些表型是由于尿液运输异常导致尿液积聚所引发的继发性效应。由输尿管肾盂连接部梗阻（UPJO）或输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO）等阻塞引起的上述表型，在E18.5时已可通过膨大的肾脏和输尿管清晰观察到。E19.5胚胎或新生幼鼠的肾脏体积更大，较E18.5或更早期胚胎更易于操作。然而，双侧尿路梗阻的幼鼠在出生后会死亡。因此，应根据实验小鼠的特性，合理选择围产期胚胎或幼鼠进行实验，以验证CAKUT表型。
在进行染料注射以检测潜在缺陷之前，需仔细解剖以保持泌尿系统的完整。这对于异常的肾积水肾脏和输尿管尤为重要，因为这些组织在去除周围多余组织以暴露肾脏和尿路时极易扩张且容易受损。若在解剖过程中损伤这些器官，将无法全面判断真实的缺陷情况。例如，图2显示了输尿管的明显扩张，但由于染料泄漏，未能显示出远端输尿管积水的末端位置。
<p class="jove_content"...

泌尿系统由一对肾脏和输尿管，以及一个共用的膀胱和尿道组成。泌尿系统的主要功能是通过调节血液中的水分和电解质平衡来维持机体的稳态。肾脏过滤血液，以调控电解质浓度和酸碱平衡，并生成尿液以排出多余的水分以及包括溶质和代谢产物在内的废物。尿液随后从肾脏的肾盂经输尿管单向输送至膀胱，在膀胱中储存，最终通过尿道排出体外1。
输尿管是起源于肾管的直管状结构。在小鼠胚胎发育第10.5天（E10.5）自肾管出芽后，输尿管茎逐渐伸长，并分化为一种多层结构，称为尿路上皮，该结构在小鼠E12.5至E16.5期间具有不透性。包围输尿管茎的间充质细胞也分化为三层，分别为内层的间质细胞、中间较厚的平滑肌细胞以及外层的外膜成纤维细胞。起始于肾盂的输尿管节律性蠕动波通过输尿管壁的平滑肌层向膀胱传播，以输送尿液2,3，尿液的生成始于小鼠E16.5时期1。
肾脏和尿路先天性畸形（CAKUT）是最常见的遗传性疾病之一，约存在于1%的人类胎儿中1,4，其表型多样，包括肾积水和输尿管积水。尿液在肾脏和输尿管中的异常积聚导致肾积水和输尿管扩张的形成。肾积水和/或输尿管积水形成的原因之一是尿路梗阻。输尿管肾盂连接部梗阻（UPJO）是由于近端输尿管与肾盂之间发生阻塞，导致尿液流动异常，从而引起肾积水以及近端输尿管狭窄，并伴有成角或持续性折叠5,6。此外，远端输尿管异位插入膀胱壁或生殖道称为输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO）。UVJO也可诱发肾积水和巨输尿管扩张的形成7,8。另一种输尿管膀胱连接部（UVJ）缺陷为膀胱输尿管反流（VUR）。VUR的特征是在输尿管膀胱连接部处尿液从膀胱向肾脏逆流。与UVJO相比，患有VUR的围产期胚胎通常不表现出明显的肾扩张性积水或严重的输尿管扩张表型9。
在实验小鼠中，可通过向肾盂注射染料（如亚甲蓝）来观察尿液流动9。注射的亚甲蓝溶液将沿尿液路径从肾盂经输尿管进入膀胱。肾积水可通过肾脏内染料的扩张现象识别。输尿管肾盂连接部梗阻（UPJO）表现为近端输尿管处染料流动受阻，并伴有肾盂扩张5。若输尿管出现管径增宽，则表明存在输尿管积水。最后，若染料在膀胱壁或生殖道部位积聚，则提示存在膀胱输尿管反流（UVJO），并伴有扩张的积水肾和扩张的巨输尿管7,10。为检测膀胱输尿管反流（VUR），可将染料溶液注入膀胱，并监测其在肾脏中的逆行流动情况9。
本文介绍了一种将亚甲蓝染料注入围产期胚胎肾盂的实验方案。该方案可用于示踪尿液从肾盂经输尿管流入膀胱的过程，并验证是否存在输尿管肾盂连接部梗阻（UPJO）或输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO）等泌尿道连接处阻塞问题。

<table><tbody><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc. 生理盐水 - 500 mL</td><td>Fisherscientific</td><td>50-983-204</td><td></td></tr><tr><td>带 BD Luer-Lok 接头的 3 mL 一次性注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>带 Supor 膜的 Acrodisc 注射器滤器</td><td>Pall corporation</td><td>4614</td><td></td></tr><tr><td>Exel 头皮静脉（蝴蝶型）穿刺针；27G x 3/4&quot; 12&quot;&amp;nbsp;</td><td>EXELINT</td><td>26709</td><td></td></tr><tr><td>精细手术剪</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-6702</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子；型号 #5</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 30 G x 1/2&quot;</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr></tbody></table>

通过亚甲蓝染料注射评估尿路连接处梗阻缺陷

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

泌尿道连接处梗阻缺陷是一类导致肾积水和输尿管积水的先天性畸形。可通过追踪亚甲蓝染料在泌尿系统中的流动情况来评估小鼠泌尿道连接处的梗阻缺陷。将亚甲蓝染料注入围产期胚胎肾脏的肾盂，随后施加静水压力，观察染料从肾脏肾盂经输尿管流入膀胱腔的过程。在正常的围产期泌尿道中，染料会明显积聚于膀胱腔内；若存在泌尿道梗阻，则染料将滞留在肾盂与异常输尿管的末端之间。该方法有助于确认泌尿道连接处的梗阻，并实现对肾积水和输尿管积水的可视化观察。本文描述了一种向肾盂注射亚甲蓝染料以确认泌尿道连接处梗阻的实验方案。

肾脏和下尿路位于大多数其他内脏器官（如肝脏和肠道）的背侧。在移除这些其他内脏器官后，可观察到一对肾脏和输尿管以及一个膀胱（图1A）。成功解剖后，注入肾盂的染料将通过输尿管从肾脏流向膀胱。肾盂是输尿管在肾脏内近端呈漏斗状扩张的部分。因此，染料注射点位于与肾脏相连的可见近端输尿管附近，如黑色箭头所示（图1B-1C）。向一侧肾脏注入亚甲蓝染料溶液后，若无泌尿道梗阻，染料将从肾盂经输尿管流入膀胱，使输尿管和膀胱腔呈现可见的蓝色（图1B）。在正常情况下，染料在输尿管中通常会迅速消失，甚至在成像前已不可见，且输尿管中的染料颜色较浅，因为正常的输尿管是一根细管。然而，可通过解剖显微镜观察到输尿管中的染料流动。当双侧肾脏均注射染料溶液后，染料经约20秒的总流动时间后在膀胱腔内积聚，形成明显的蓝色（图1C）。对侧注射后膀...

将亚甲蓝染料注入小鼠胚胎肾盂，有助于评估泌尿系统发育过程中尿路连接处的梗阻缺陷。本文介绍了一种向肾盂注射亚甲蓝染料的实验方案。

尿路连接处梗阻缺陷是一种导致肾积水和输尿管积水的先天性畸形。小鼠尿路连接处梗阻……

本实验的总体目标是通过向肾脏注射亚甲蓝染料，以确定泌尿道连接处的梗阻情况。该方法有助于解答肾脏及下尿路发育领域的关键问题，例如输尿管与膀胱的连接方式。该技术的主要优势在于，它提供了一种简便的方法，可在严重异常的大体发育情况下可视化泌尿道结构，从而实现对泌尿道发育的分析。开始实验时，称取0.1克亚甲蓝粉末。将亚甲蓝溶于10毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，并涡旋混合。接着，使用注射器滤器过滤10毫克/毫升的亚甲蓝溶液，以防止注射过程中发生堵塞。然后，将一套无菌静脉切开套件与一个3毫升的一次性注射器组装在一起，并用3毫升过滤后的亚甲蓝溶液充满注射器。用70%乙醇清洁解剖剪刀和镊子。为在E18.5或E19.5阶段收集围产期胚胎，首先使用二氧化碳吸入法处死怀孕小鼠。然后根据美国国立卫生研究院（NIH）指南进行颈椎脱位。接着在动物腹部腹侧表面喷洒70%乙醇。随后使用无菌解剖剪和镊子从腹侧打开腹腔。提起整个子宫，并在子宫角尖端处将其从体内分离。然后在培养皿中用1×PBS冲洗整个子宫。用解剖剪将子宫分段剪开，用解剖镊去除胎盘蜕膜，以暴露胚胎和卵黄囊。先移除卵黄囊，然后用解剖镊去除羊膜，以分离出围产期胚胎。使用解剖剪将胚胎头部剪下。将胚胎腹面朝上固定，在配备数码相机的解剖显微镜下进行成像。采集其尾部用于基因分型。用镊子小心撕开皮肤，打开胚胎的腹腔。然后用镊子剪除或拔除肝脏、胃和肠道等多余器官和组织，以暴露位于背部的肾脏、输尿管和膀胱。用无菌纱布吸去解剖后胚胎上多余的血液，然后继续进行染料注射。通过静水压力将亚甲蓝溶液从针尖推出，以排除针头和管路中的气泡。将装有染料溶液的注射器抬高至针尖水平以上，以启动液体流动。然后降低注射器以停止液体流动。接下来，将针头插入近端输尿管附近的肾盂，注意一旦放置到位后避免扰动。向肾脏内注射染料以评估其尿路是否阻塞。将一根针插入肾盂后，该测试成功的标志是：将另一根针插入肾盂朝向输尿管的方向，且针头既不穿过肾脏实质，也不朝向血管。将注射器抬高约20厘米以提供静水压力，使15至16微升的染料溶液流入。随后观察染料的蓝色依次出现在肾盂、输尿管全长，最后到达膀胱腔内。将注射器放下以停止染料流动，并将针头从肾脏中取出。在实验记录本中记录肾脏的肾盂积水情况、输尿管扩张情况以及染料溶液的最终位置。最后对对侧肾脏进行注射，使染料总共流动20秒。使用连接体视显微镜的相机和成像程序，拍摄经染料溶液示踪的肾脏、输尿管和膀胱的图像。将亚甲蓝染料注入一侧肾脏后，染料从肾盂经输尿管流入膀胱，使输尿管和膀胱腔呈现可见的蓝色。在双侧肾脏注射染料约20秒后，膀胱腔内出现更明显的蓝色，表明第二套泌尿系统不存在尿路连接处梗阻。当注射异常扩张的输尿管时，染料溶液的最终位置不明确。即使膀胱腔内无染料，也无法确认是否存在输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO），因为异常扩张的输尿管在中段已受损。在进行该操作时，需注意计算染料囊用于围产期胚胎，以获得完整的泌尿系统。并去除气泡，以免阻塞染料流动。

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