通过亚甲蓝染料注射评估尿路连接处梗阻缺陷

本实验的总体目标是通过向肾脏注射亚甲蓝染料，以确定泌尿道连接处的梗阻情况。该方法有助于解答肾脏及下尿路发育领域的关键问题，例如输尿管与膀胱的连接方式。该技术的主要优势在于，它提供了一种简便的方法，可在严重异常的大体发育情况下可视化泌尿道结构，从而实现对泌尿道发育的分析。

开始实验时，称取0.1克亚甲蓝粉末。将亚甲蓝溶于10毫升1×磷酸盐缓冲液（PBS）中，并涡旋混合。接着，使用注射器滤器过滤10毫克/毫升的亚甲蓝溶液，以防止注射过程中发生堵塞。

然后，将无菌头皮静脉输液套件与一支3 mL一次性注射器组装，并用3 mL过滤后的亚甲蓝溶液充满注射器。用70%乙醇清洁解剖剪刀和镊子。为在E18.5或E19.5阶段收集围产期胚胎，首先使用二氧化碳吸入法处死怀孕小鼠。

然后根据美国国立卫生研究院（NIH）指南实施颈椎脱位。接着在动物腹部腹侧表面喷洒70%乙醇。随后使用无菌解剖剪和镊子从腹侧打开腹腔。

提起整个子宫，并在子宫角尖端处将其从体内分离。然后在培养皿中用1×PBS冲洗整个子宫。用解剖剪将子宫分段剪开，并用解剖镊去除胎盘蜕膜，以暴露胚胎和卵黄囊。

先移除卵黄囊，然后用解剖镊去除羊膜，以分离出围产期胚胎。使用解剖剪将胚胎头部剪下。将胚胎腹面朝上固定，在配备数码相机的解剖显微镜下进行成像。

采集其尾部用于基因型鉴定。用镊子小心撕开皮肤，打开胚胎的腹腔。然后用镊子剪除或取出肝脏、胃和肠道等多余器官和组织，以暴露位于背部的肾脏、输尿管和膀胱。

用无菌纱布吸去解剖后胚胎上多余的血液，然后继续进行染料注射。通过静水压力将亚甲蓝溶液从针尖推出，以排除针头和管路中的气泡。将装有染料溶液的注射器抬高至针尖水平以上，以启动液体流动。

然后降低注射器以停止液体流动。接着将针头插入近端输尿管附近的肾盂，注意一旦放置到位后避免扰动。向肾脏内注射染料以评估其尿路是否阻塞。

将一根针插入肾盂后，该测试的成功在于：应将针插入肾盂朝向输尿管的方向，既不能穿过肾脏实质，也不能朝向血管。将注射器抬高约20厘米以提供静水压，使15至16微升的染料溶液流入。随后观察染料的蓝色，首先出现在肾盂，然后沿输尿管全长，最后进入膀胱腔内。

将注射器放下以停止染料流动，并从肾脏中移除针头。在实验记录本中记录肾脏的肾盂积水、输尿管积水以及染料溶液的最终位置。最后对对侧肾脏进行注射，并让染料流动总计20秒。

使用连接到体视显微镜的相机和成像程序，拍摄经染料溶液示踪的肾脏、输尿管和膀胱的图像。将亚甲蓝染料注入一侧肾脏后，染料从肾盂经输尿管流入膀胱，使输尿管和膀胱腔呈现可见的蓝色。当双侧肾脏均注射染料后约20秒，由于染料流动时间较长，膀胱腔内蓝色更为明显，表明第二套泌尿系统不存在尿路连接处梗阻。

当注射异常扩张的输尿管时，染料溶液的最终位置不明确。即使膀胱腔内无染料，也无法确认是否存在输尿管膀胱连接部梗阻（UVJO），因为异常扩张的输尿管在中段已受损。在进行该操作时，重要的是要记住计算染料囊的数量，以获得完整的围产期胚胎泌尿系统。

并去除气泡，以免阻碍染料流动。