Name: TIP60 短暂耗竭后乳腺上皮细胞迁移的活体影像学研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 了解使用活细胞成像技术实时监测TIP60耗竭的MCF10A乳腺上皮细胞迁移的方法。该技术可动态观察单细胞运动，为癌症转移研究提供重要工具。

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感谢Jha实验室成员提供的有益讨论和意见。S.J.的研究得到了新加坡国家研究基金会和新加坡教育部卓越研究中心计划资助，项目包括新加坡癌症科学研究所（R-713-006-014-271）、新加坡国家医学研究委员会（CBRG-NIG；BNIG11nov001 和 CS-IRG；R-713-000-162-511）以及教育部学术研究基金（MOE AcRF 第一层次 T1-2012 Oct-04）的支持。Y.Z.、G.S.C. 和 C.Y.T. 获得了新加坡国立大学癌症科学研究所颁发的研究生奖学金资助。

1. 准备
<ol>
	<li>准备 MCF10A 培养基：DMEM/F12 (1:1) 培养基，添加 5% 马血清、20 ng/mL 表皮生长因子、0.5 mg/mL 氢化可的松、100 ng/mL 霍乱毒素和 10 µg/mL 胰岛素。</li>
	<li>准备无血清培养基：DMEM/F12 (1:1) 培养基，添加 20 ng/mL 表皮生长因子、0.5 mg/mL 氢化可的松、100 ng/mL 霍乱毒素和 10 µg/mL 胰岛素。</li>
	<li>使用以下 siRNA 序列： 
	siControl： 
	正向链：5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' 
	反向链：5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' 
	siTIP60： 
	正向链：5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' 
	反向链：5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>使用 10 cm 细胞培养皿和 24 孔板。</li>
</ol>
2. 使用 siRNA 瞬时耗竭 TIP60
<ol>
	<li>第1天，取15 µL转染试剂（例如， Lipofectamine RNAiMAX) 和 2 mL 低血清培养基（例如， Opti-MEM）分别与10 µL的每种siRNA（10 µM储存液）混合。</li>
	<li>将混合物在室温下孵育20分钟。</li>
	<li>接种 1 × 106 在10 cm培养皿中加入MCF10A细胞和3 mL培养基。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将siRNA混合物逐滴加入10 cm培养皿中。</li>
	<li>轻轻摇晃培养皿，确保细胞均匀分布，然后放入37 °C培养箱中。</li>
	<li>孵育6小时后，将含有siRNA的培养基更换为8 mL新鲜培养基。</li>
	<li>第2天，配制另一批siRNA混合物，室温孵育20分钟。</li>
	<li>吸出第1天加入的8 mL培养基，更换为3 mL新鲜培养基。</li>
	<li>将第二批siRNA混合物逐滴加入培养皿中。轻轻晃动培养皿，确保试剂充分混匀后再放入培养箱。</li>
	<li>6小时后，将含有siRNA的培养基更换为8 mL新鲜培养基。</li>
</ol>
3. 用于伤口愈合实验的种子细胞
<ol>
	<li>第3天，弃去培养基，用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次，弃去PBS缓冲液。</li>
	<li>向培养板中加入1 mL 1×&#160;胰蛋白酶-EDTA缓冲液，对siControl和siTIP60处理的细胞进行消化，放回培养箱中孵育20分钟。</li>
	<li>每块培养板中加入4 mL完全培养基，用移液器吹打重悬细胞，并转移至15 mL离心管中。</li>
	<li>以200 g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用5 mL无血清培养基重悬细胞，使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将siControl和siTIP60组细胞均配制成6 × 105 个细胞/mL的细胞悬液，确保细胞充分混匀。每孔加入500 µL细胞悬液至24孔板中，以保证达到100%融合度。siControl和siTIP60组各接种5至6孔。</li>
	<li>轻轻前后摇动培养板，再左右摇动，以确保细胞均匀分布，避免画圈式摇动。将培养板置于培养箱中培养24小时。</li>
	<li>收集剩余细胞以检测TIP60的敲低效率：将剩余的细胞悬液以200 g离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>使用商品化试剂按照生产商说明书提取RNA，并进行实时定量PCR分析，以评估敲低效率。</li>
</ol>
4. 创造伤口
<ol>
	<li>在相差显微镜下观察，确保细胞已完全贴壁。在显微镜下（4X、10X 和 20X&#160;放大倍数）观察细胞，确认细胞已完全贴附并形成融合的单层。
	 
	注意：siControl 细胞通常比 siTIP60 细胞贴壁更好。这是预期现象，因为 TIP60 的缺失会使细胞更倾向于呈现间充质样表型20。此处使用的是普通的台式白光相差显微镜。</li>
	<li>用 200 µL 移液枪头轻轻在孔板中央划一条直线以制造伤口；所产生的划痕长度与孔板直径相同。对所有剩余的孔重复此步骤。每个孔均需使用新的移液枪头。</li>
	<li>用无血清培养基轻轻洗涤每个孔 5 次，以去除脱落的细胞。</li>
	<li>向每个孔中加入 1 mL 无血清培养基，并立即进行活细胞成像。</li>
</ol>
5. 活细胞成像的设置
<ol>
	<li>在进行活细胞成像实验前至少1小时打开显微镜和温控装置，以确保培养腔内的温度达到37 °C。</li>
	<li>开始活细胞成像前打开二氧化碳（CO2）气体供应，将CO2浓度设定为5%。</li>
	<li>将24孔板放置在显微镜载物台上，选择10X&#160;倍率的物镜进行成像。将发射光引导至目镜而非相机，并调节焦距以定位伤口及其周围的细胞。 
	注意：本实验中使用了带相差的白光照明。</li>
	<li>使用活细胞观察系统标记每个孔中伤口的位置。 
	注意：活细胞成像系统的自动载物台支持在多个位置采集图像，系统将在每个标记位置按设定的时间间隔进行成像。</li>
	<li>设置时间条件：时间间隔为1小时，总时长为72小时；根据此设置，系统将每小时在每个标记位置拍摄一次图像，持续72小时。可根据需要设定合适的时间间隔和监测时长。 
	注意：此处选择72小时的监测时长最为合适，因为这些细胞在无血清培养基中培养超过72小时后开始死亡。</li>
</ol>
6. 单细胞运动追踪
<ol>
	<li>72 小时后导出数据，以 JPEG 格式导出图像，以 AVI 格式导出视频。 
	注意：这一点非常重要，因为 ImageJ 软件仅能识别 AVI 格式的视频。siTIP60 细胞与 siControl 细胞之间不同的迁移速度可在视频中清晰观察到。</li>
	<li>在 ImageJ 软件中打开 AVI 视频。</li>
	<li>打开 MTrackJ 插件（该插件需单独下载并安装）：插件 &#62; MtrackJ。</li>
	<li>在 MtrackJ 工具栏中点击 &#34;添加&#34; 选项卡，从视频中选择单个细胞并添加轨迹。选择位于侵袭前沿的一个细胞以及能够独立迁移的细胞（单细胞迁移）。在视频中跟踪所选细胞的运动，并使用 MtrackJ 进行轨迹绘制。</li>
	<li>点击工具栏上的 &#34;测量&#34; 选项卡，测量细胞移动的距离。 
	注意：在此处，siControl 组中几乎没有任何细胞以单细胞形式移动，因此难以测量单细胞迁移；而 siTIP60 组中有大量细胞以单细胞形式迁移。然而，在 siControl 和 siTIP60 细胞中，仍可对位于侵袭前沿的细胞运动进行追踪和计算。</li>
	<li>以 AVI 格式保存带有轨迹的视频。</li>
</ol>
7. 细胞迁移能力的定量分析
<ol>
	<li>进行定量分析时，选择 0 h 的图像和 &#34;n&#34; h 的图像，其中 &#34;n&#34; 表示 siTIP60 或 siControl 细胞的伤口完全闭合的时间点。 
	注意：此处选择 48 h，因为 siTIP60 细胞的伤口已几乎完全闭合。</li>
	<li>使用 ImageJ 和以下公式计算迁移百分比：(0 h 时的伤口面积 - &#34;n&#34; h 时的伤口面积) / 0 h 时的伤口面积 × 100。</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

已知在细胞迁移过程中，细胞可以以贴壁的细胞片层、松散的细胞簇或单个孤立细胞的形式移动。细胞侵袭的方式和动态会因条件不同而有所差异，且表型可能在数小时内发生变化。传统的伤口愈合实验依赖于显微镜下间隔较长时间（如12或24小时）拍摄的静态图像，这使得难以捕捉伤口闭合的动态过程以及细胞运动的模式。
另一方面，活细胞成像系统可在较短的时间间隔内（30分钟或1小时）对同一位置进行连续监测，这是手动拍摄图像所无法实现的。该系统具有自动化特性，研究人员只需在实验结束时导出数据即可。这使得实时监测细胞运动模式以及伤口闭合过程成为可能。在本研究中，将定量活细胞成像系统应用于伤口愈合实验，可捕捉对照细胞或TIP60缺失细胞中细胞动态迁移及伤口闭合的全过程。通过活细胞成像系统拍摄的视频可见，大多数siControl细胞以贴壁细胞片层的形式移动，而TIP60缺失细胞则以孤立的单个细胞形式移动（图3 和 图5）。
细胞增殖和细胞死亡可...

HIV-Tat 相互作用蛋白 60 kDa（TIP60）是一种赖氨酸乙酰转移酶，能够乙酰化组蛋白和非组蛋白1,2。研究表明，TIP60 在多种信号通路中发挥功能，包括转录调控、DNA 损伤修复以及细胞凋亡1,3,4,5,6,7,8。此外，TIP60 在多种癌症中常呈下调表达，其表达降低与肿瘤转移及较差的生存率相关9,10,11,12,13,14。肿瘤转移是癌症相关死亡的主要原因，该过程包含多个步骤，其中转移的初始阶段涉及肿瘤细胞向邻近组织的迁移和侵袭15,16。为此，肿瘤细胞首先必须从原发性肿瘤团块中脱离，可表现为集体侵袭的细胞片层形式，或以单个游离细胞的形式脱离17。在此过程中，肿瘤细胞常经历上皮-间质转化（EMT），从而导致细胞形态和细胞黏附能力的改变17,18。
已开发出一些技术用于研究肿瘤细胞的迁移和侵袭能力 体外其中，伤口愈合实验是最高效且经济的方法19首先，该方法涉及在融合的单层细胞上人为制造一个间隙，从而允许细胞迁移并闭合该间隙。其次，可在实验开始和结束时拍摄间隙的图像。最后，通过比较间隙闭合程度来确定细胞迁移速率。通常使用相差显微镜采集传统伤口愈合实验的图像。伤口愈合实验的另一优势在于其在一定程度上模拟了 体内 肿瘤细胞迁移。类似于 体内 肿瘤转移，通过伤口愈合实验可观察到上皮细胞片层的集体迁移以及脱离的单个细胞的迁移。
然而，细胞迁移具有动态性，因此需要实时记录细胞的运动过程。例如，传统的伤口愈合实验无法实现对单个细胞运动的分析。另一方面，用于伤口愈合实验的细胞在培养时常需进行血清饥饿处理，以抑制细胞增殖。这样做的目的是排除因细胞增殖导致的间隙闭合。尽管如此，实验过程中仍会存在一定程度的细胞增殖和细胞死亡，而实验前后拍摄的相差显微图像无法区分这两种情况。
活细胞成像技术克服了传统伤口愈合实验的这一局限性。通过将活细胞成像显微镜与CO2培养箱及适当的温度控制系统相结合，研究人员能够随时间测量间隙大小及其闭合速率，同时追踪位于侵袭前沿尖端的活跃迁移细胞的运动。因此，采用活细胞成像技术监测细胞迁移不仅能够更清晰地可视化细胞迁移过程，还能区分细胞迁移与细胞增殖，从而实现对细胞迁移更为可靠的分析。
本研究采用MCF10A乳腺上皮细胞，演示了划痕愈合实验与活细胞成像相结合的方法，用于研究TIP60在细胞迁移中的作用。TIP60的缺失会导致MCF10A细胞的迁移能力增强。

<table><tbody><tr><td>MCF10A 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>乳腺上皮细胞</td></tr><tr><td>DMEM/F12 培养基 (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>MCF10A 培养用培养基</td></tr><tr><td>表皮生长因子 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>霍乱毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>MCF10A 培养基添加剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>用于 MCF10A 细胞从培养皿脱离</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>用于细胞计数</td></tr><tr><td>Opti-MEM 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>用于 siRNA 混合物配制</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>用于 mRNA 提取</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>用于 cDNA 合成</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>用于实时定量 PCR</td></tr><tr><td>7500 Fast 实时定量 PCR 系统</td><td>Biosystems</td><td></td><td>实时定量 PCR 仪器</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>用于基因敲低实验</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>用于伤口愈合实验</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>自行设计</td><td>自行设计</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>自行设计</td><td>自行设计</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>活细胞观察系统</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss 倒置活细胞观察系统，用于活细胞实验</td></tr></tbody></table>

瞬时耗竭tip60后乳腺上皮细胞迁移的活体成像

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

划痕愈合实验是体外研究细胞迁移的一种高效且最经济的方法之一。in vitro。传统方法通常使用相差显微镜在实验开始和结束时拍摄图像，并通过伤口闭合程度来评估细胞的迁移能力。然而，细胞运动是一种动态现象，传统方法无法追踪单个细胞的运动过程。为了改进现有的划痕愈合实验，我们采用活细胞成像技术对细胞迁移进行实时监测。该方法使我们能够基于细胞追踪系统确定细胞迁移速率，并更清晰地区分细胞迁移与细胞增殖。本文中，我们展示了在划痕愈合实验中应用活细胞成像技术，研究TIP60的存在对乳腺上皮细胞不同迁移能力的影响。由于细胞运动具有高度动态性，与传统划痕愈合实验所采用的静态图像记录相比，本方法可提供关于伤口愈合过程更深入的见解。

基于活细胞成像的细胞迁移实验通用示意图 
图1A为本实验方案的示意图。转染siControl的MCF10A细胞呈现典型的上皮细胞形态。在TIP60蛋白被敲低后，MCF10A细胞相较于对照组细胞表现出更明显的间充质样特征（图1B）。
检测 TIP60 沉默效率 
图 2 展示了 TIP60 的沉默效率。经 siTIP60 处理后，TIP60 的表达水平显著降低。除了 TIP60 外，还检测了多种与细胞迁移相关蛋白的表达20。例如，上皮标志物上皮细胞黏附分子（EpCAM）的表达减少，而两种 EMT 驱动因子纤连蛋白（FN1</e...

本文展示了利用TIP60缺失的MCF10A乳腺上皮细胞在伤口愈合实验中对细胞迁移进行实时监测。本方案中采用的活细胞成像技术使我们能够实时并跨时间分析和可视化单个细胞的运动。

瞬时耗竭TIP60后乳腺上皮细胞迁移的活体成像

伤口愈合实验是一种高效且最经济的体外研究细胞迁移的方法之一。传统上，图像在……时采集。

本实验的总体目标是观察特定目的基因缺失对细胞迁移的影响。该方法有助于我们回答癌症转移领域中的关键问题，例如癌细胞的迁移行为。该技术的主要优势在于能够实时监测细胞动态迁移过程。我们最初产生该方法的想法，是在观察TIP60（一种肿瘤抑制因子）患者细胞形态变化时。首先，在每个10厘米培养皿中加入三毫升培养基，接种一百万个乳腺上皮细胞。将室温孵育20分钟的SRINA混合物逐滴加入实验细胞培养物中。手动轻轻摇晃两皿，确保细胞均匀分布，然后将培养皿放入37摄氏度培养箱中。六小时后，将上清液更换为每皿8毫升新鲜培养基，并将培养物放回培养箱。次日早晨，将上清液更换为每皿3毫升新鲜培养基，并向实验组细胞培养物中加入第二轮SIRNA混合物，操作方法如前所述，轻轻摇晃培养皿以确保试剂充分混匀，然后将细胞放回培养箱。6小时后，将上清液替换为8 mL新鲜培养基，继续培养过夜。第3天，用2 mL BPS每孔洗涤细胞一次，每孔加入1 mL胰蛋白酶EDTA溶液，在37°C下消化20分钟以消化细胞。消化结束后，每孔加入4 mL完全培养基终止反应。用移液器重悬细胞，并将细胞悬液分别转移至若干个15毫升离心管中。通过离心收集细胞，然后每管用5毫升无血清培养基重悬细胞沉淀。计数后，将两种细胞培养物分别稀释至浓度为600,000个细胞/毫升，再从每种培养物中取500微升细胞悬液加入24孔板的一个孔中，以确保达到100%汇合度。当所有细胞接种完毕后，轻轻前后左右摇晃培养板以确保细胞分布均匀，并将培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。为检测目的基因的敲低效率，将收集管中剩余的细胞再次离心，从细胞沉淀中提取RNA，并根据试剂生产商的说明书，使用商业试剂进行实时定量PCR分析。次日早晨，在开始活细胞成像至少一小时前，开启显微镜及温度控制系统。将温度设置为37摄氏度，二氧化碳气体供应设置为5%。当培养箱温度达到37摄氏度时，使用相差显微镜确认细胞已融合并完全贴附于孔板底部。然后使用200微升移液枪头在每个孔的中央位置沿直线轻轻划痕，贯穿整个孔的长度。随后，用无血清培养基轻轻洗涤每个孔5次，以去除脱落的细胞。最后一次洗涤后，向每个孔中加入1毫升无血清培养基。将培养板置于显微镜载物台上，在10倍物镜下观察，并将发射光导向目镜而非相机。手动调节焦距，定位每个伤口及其周围的细胞。随后将发射光重新导回相机，利用活细胞观察系统标记伤口位置并设定时间条件。根据相应的实验时间对细胞进行成像，然后在合适的成像软件中打开第一个 avi 视频，并打开 m track j 插件。单击“添加”选项卡以添加单个细胞的轨迹，选择位于侵袭前沿的一个细胞以及一个能够自主迁移的细胞。使用 mtrackJ 跟踪视频中所选细胞的运动轨迹。然后点击测量标签，测量细胞移动的距离，并将带有轨迹的视频以 avi 格式保存。在 TIP60 耗竭后，乳腺上皮细胞

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

TIP60 短暂耗竭后乳腺上皮细胞迁移的活体影像学研究

介绍了一种用于研究癌症干细胞迁移的分区化微流控装置。该新型平台可构建可存活的细胞微环境，并实现对活细胞运动的显微可视化观察。通过分离出高迁移活性的癌细胞，可用于研究其侵袭性浸润的分子机制，有望为未来开发更有效的治疗策略提供依据。...

利用分区化微流控装置和活细胞成像评估癌干细胞迁移

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。...

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

采用延时成像技术来评估源自乳腺癌风险转基因小鼠模型的原发性癌前乳腺上皮细胞的行为，以确定特定行为参数与不同基因损伤之间是否存在相关性。...

乳腺癌基因工程小鼠模型来源的原发性癌前乳腺上皮细胞的延时成像

结合细胞移植、细胞骨架标记以及基因功能缺失/获得实验方法，本实验方案描述了如何利用迁移中的斑马鱼前脊索板前体细胞来分析候选基因的功能 体内 细胞迁移...

分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

本文介绍了一种长期延时显微镜方法，用于纵向追踪单个细胞对抗癌治疗药物的反应。...

透过表象：利用延时显微镜与单细胞纵向追踪研究抗癌治疗药物

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本文中，我们报告了一种描述的实验方案 体内 测定多西他赛耐药乳腺癌细胞（MCF-7）中微管动态不稳定性的一种方法TXT). 在该方法中，采用去卷积显微成像系统检测目标细胞中GFP-微管蛋白的表达。...

活体成像研究紫杉烷耐药性乳腺癌中微管动态不稳定性

本文介绍了活细胞成像技术，用于在不同处理条件下，随时间定量测量胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移和侵袭能力。...

活细胞成像实验用于研究胶质母细胞瘤脑肿瘤干细胞的迁移与侵袭

本方案描述了一种集成化方法，可在单一平台上实时研究癌细胞的迁移与侵袭，为细胞运动性及形态学研究提供了一种易于重复且高效省时的选择。...

使用自动化活细胞成像仪的简单迁移/侵袭实验流程

本文介绍了一种评估纺锤体形成和有丝分裂进程动态变化的实验方案。通过应用延时成像技术，使用者能够识别处于有丝分裂不同阶段的细胞，追踪并鉴定有丝分裂缺陷，并分析在抗有丝分裂药物处理下纺锤体的动态行为及有丝分裂细胞的命运。...

活细胞成像评估有丝分裂纺锤体扰动后中期持续时间动态变化及细胞命运

我们报道了一种可在胶质母细胞瘤（GBM）细胞侵袭脊椎动物脑组织过程中实现微管动态活体成像的技术。通过将荧光标记的GBM细胞正位注射至透明的斑马鱼脑中，并结合高分辨率的活体成像，可实现对细胞骨架动态变化的观测 原位...

活体成像斑马鱼脑内侵袭性胶质母细胞瘤细胞中微管的动态变化

了解使用活细胞成像技术实时监测TIP60耗竭的MCF10A乳腺上皮细胞迁移的方法。该技术可动态观察单细胞运动，为癌症转移研究提供重要工具。

瞬时耗竭TIP60后乳腺上皮细胞迁移的活体成像

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