瞬时耗竭TIP60后乳腺上皮细胞迁移的活体成像

本实验的总体目标是观察特定目的基因耗竭对细胞迁移的影响。该方法有助于我们回答癌症转移中的关键问题，例如癌细胞的迁移行为。该技术的主要优势在于能够实时监测细胞动态迁移过程。

当我们观察TIP60（一种肿瘤抑制因子）患者细胞形态变化时，首次提出了该方法的设想。首先，在每个10厘米培养皿中接种一百万个乳腺上皮细胞，并加入3毫升培养基。然后将室温孵育20分钟的SRINA混合物逐滴加入实验组细胞培养物中。

手动轻轻摇晃两个培养皿，确保细胞均匀分布，然后将其放入37摄氏度的培养箱中。六小时后，将上清液更换为每皿8毫升的新鲜培养基，并将培养物放回培养箱。次日早晨，将上清液更换为每皿3毫升的新鲜培养基，并向实验组细胞培养物中加入第二轮SIRNA混合物（操作如前所述），轻轻摇晃培养皿以确保试剂充分混匀，然后将细胞放回培养箱。

6小时后，将上清液更换为8毫升新鲜培养基，继续过夜培养。第3天，每孔用2毫升BPS洗涤细胞一次，然后每孔加入1毫升含EDTA的胰蛋白酶溶液，在37摄氏度下消化20分钟以消化细胞。孵育结束后，每孔加入4毫升完全培养基终止反应。

用移液器重悬细胞，并将细胞悬液分别转移至若干个15毫升离心管中。通过离心收集细胞，并将沉淀物按每管加入5毫升无血清培养基重悬。计数后，将两种细胞培养物稀释至浓度为每毫升600,000个细胞，然后从每种培养物中取500微升细胞悬液加入24孔板的同一孔中，以确保达到100%汇合度。

当所有细胞接种完成后，轻轻前后左右摇动培养板以确保细胞均匀分布，并将培养板放入细胞培养箱中孵育24小时。为检测目的基因的敲低效率，将收集管中剩余的细胞再次离心，从细胞沉淀中提取RNA，并根据试剂生产商的说明书，使用商业试剂进行实时定量PCR分析。次日早晨，在开始活细胞成像至少一小时前，打开显微镜和温度控制系统。

将温度设置为 37°C，二氧化碳气体供应设置为 5%。当培养箱温度达到 37°C 时，使用相差显微镜确认细胞已融合并完全贴附于孔板底部。然后使用 200 微升移液枪头轻轻在每孔中央沿直线划痕，贯穿整个孔的长度，并用无血清培养基轻轻洗涤所有孔 5 次，以去除脱落的细胞。最后一次洗涤后，向每孔加入 1 毫升无血清培养基。

将培养板置于显微镜载物台上，使用10倍物镜观察，并将发射光引导至目镜而非相机。手动调节焦距，定位每个伤口及其周围的细胞。然后将发射光重新导回相机，利用活细胞观察系统标记伤口位置并设定时间条件。

根据相应的实验时间对细胞进行成像，然后在合适的成像软件中打开第一个 avi 视频，并打开 m track j 插件。单击“添加”选项卡以添加单个细胞的轨迹，选择位于侵袭前沿的一个细胞以及一个能够独立迁移的细胞。使用 mtrackJ 跟踪视频中所选细胞的运动轨迹。

然后点击测量选项卡，测量细胞移动的距离，并将带有轨迹的视频以 avi 格式保存。在 TIP60 耗竭后，乳腺上皮细胞相较于对照培养的细胞表现出更强的间充质特性。事实上，经 siTIP60 处理后，TIP60 的表达以及上皮细胞黏附分子的表达均显著下降。

另一方面，TIP60 耗竭后，特定的上皮-间质转化驱动基因的表达增加。伤口处理后对细胞培养物进行活细胞成像显示，与对照siRNA（siControl）处理的培养物相比，siTIP60处理的细胞迁移速度更快，且在TIP60耗竭后，迁移细胞的比例显著增加。此外，siControl细胞以片层形式移动，而在siTIP60处理的培养物中则观察到更多的单细胞迁移现象。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用活细胞成像技术来监测细胞迁移过程中的动态变化。