糖注射水凝胶的制备及其在3D 细胞培养中的应用

该方案的总体目标是制备用于三维细胞培养的可注射壳聚糖水凝胶，最终用于治疗。这种方法可以回答自修复水凝胶领域的问题，例如如何通过完全浸泡来制备自修复水凝胶以及如何将其用于 3D 细胞培养。这项技术的优点是，通过相容的自修复水凝胶，可以通过非常简单的方式制备，并使用 3D 细胞培养物。

这种水凝胶也是可注射的，因此可以用作细胞疗法的载体。现在 Yongsan Li 先生将向您展示如何制作水凝胶以及如何使用这种水凝胶进行 3D 细胞培养。Yongsan Li 是我们实验室的研究生。

要制备水凝胶，首先合成 DF PEG。在通风橱中，称取 4 克分子量为 4， 000 PEG 的 4， 000 PEG 放入圆底培养瓶中，并加入 100 毫升甲苯。然后，要溶解聚合物，请加热溶液。

所有聚合物溶解后，使用蒸发器去除所有溶剂。然后，重复加入甲苯并再蒸发两次的过程，以制备干燥的 PEG 聚合物。接下来，使用磁力搅拌器和 100 毫升 DHF，溶解聚合物。

然后，将 0.9 克 4-羧基苯甲醛溶解到溶液中。接下来，将 0.07 克二甲氨基吡啶溶解到溶液中。现在在装有无水氯化钙的干燥管中加入 1.25 克 DCC。

现在让反应物在室温下搅拌约 12 小时。第二天，使用 500 毫升冷二乙醚沉淀白色固体，并使用真空过滤收集固体。丢弃溶质，并在良好的通风下晾干固体。

接下来，将白色固体溶解在 100 毫升 THF 中。在继续之前，必须过滤掉任何不溶性白色固体。现在使用新鲜的冷二乙醚沉淀溶解的固体。

然后使用真空过滤收集固体，并让它们再次干燥。重复此过程两到三次，然后将白色固体放入真空干燥箱中以完全干燥。所得白色粉末是最终产品：苯甲醛封端的 DF PEG。

为了将细胞封装在水凝胶中进行培养，首先将 0.44 克 DF PEG 溶解到 4 毫升试管中的 2 毫升细胞生长培养基中。将混合物涡旋成 20% 重量的溶液。接下来，对溶液进行消毒。

将其装入 10 毫升注射器中，然后压入 0.22 微米的细菌截留过滤器。现在将 0.165 克乙二醇壳聚糖与 4 毫升细胞培养基混合，使用涡旋制成 4%（重量比）壳聚糖溶液。然后，使用另一个 0.22 微米的细菌截留过滤器对溶液进行消毒。

接下来，使用胰蛋白酶收获细胞，例如 L929 细胞。洗涤收集的细胞，并以每毫升 375 万个细胞的浓度重悬于培养基中。在以下步骤中，将细胞植入 3D 矩阵中。

精确遵循这些步骤对于取得成功至关重要。现在使用涡旋将 0.4 毫升细胞悬液与 0.4 毫升壳聚糖溶液混合。将这种混合物移液到直径为 2 厘米的培养皿的中心，然后将 0.2 毫升 DF PEG 溶液移液到培养皿中。

然后，使用轻柔的移液诱导水凝胶的形成。通过倾斜培养皿并观察溶液的粘度来评估水凝胶的形成。为了测试封装细胞的可注射性，请在 10 毫升注射器中进行相同的制备。

然后，在水凝胶形成后，通过 48 号针头将水凝胶缓慢排出到培养皿中。接下来，将 1 毫升培养基添加到板中的水凝胶-细胞混合物中，然后将板转移到培养箱中进行培养。每隔一天更换一次培养基，覆盖 3D 水凝胶细胞培养物。

为了制备封装在水凝胶中的细胞用于成像，首先用 1 毫升 PBS 冲洗水凝胶两次。然后，用荧光素-二乙酸酯溶液和碘化丙啶溶液对水凝胶进行染色。将 0.5 毫升两种溶液覆盖在水凝胶上，并在室温下孵育水凝胶 15 分钟。

与染色溶液短暂孵育后，吸出所有溶剂。现在使用共聚焦显微镜观察水凝胶，在 488 纳米处激发以查看活细胞，在 543 纳米处激发以查看死细胞。收集具有 2 微米切片的图像堆栈，以验证细胞在水凝胶中的分布。

L929 细胞。将体内环境组织刚度约为 5， 600 Pascals 的典型小鼠玻璃纤维细胞系封装在水凝胶中。它们在整个培养过程中的活力极高，并且实现了显著的细胞密度。

在水凝胶中培养 7 天后，细胞数量增加了 200%通过 48 号针头喷出到细胞培养皿上的水凝胶可以在大约 1 小时后自我修复以重组集成水凝胶。培养 7 天后，这些细胞也急剧增殖。可以找到细胞裂变事件的证据，其中一些细胞似乎一分为二。

活死测定显示出非常高的活力，证明注射后 3D 水凝胶中的细胞增殖成功。培养 7 天后，该细胞增殖率约为未注射细胞的 3/4。因此，尽管注射过程中的剪切力具有可测量的负面影响，但注射的细胞仍然相当增殖。

观看此视频后，您应该知道如何制备自修复水凝胶，如何使用该水凝胶进行 3D 细胞培养，以及如何使用该水凝胶递送细胞。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。按照最佳程序，可以进行其他方法，例如用于细胞治疗的体内注射或药物输送。