糖注射水凝胶的制备及其在3D 细胞培养中的应用
2017年9月29日
在这里, 我们描述了一个轻便的制备糖注射水凝胶使用动态胺化学。介绍了水凝胶的机械强度调整方法及其在3D 细胞培养中的应用。
该方案的总体目标是制备用于三维细胞培养的可注射壳聚糖水凝胶，最终用于治疗。这种方法可以回答自修复水凝胶领域的问题，例如如何通过完全浸泡来制备自修复水凝胶以及如何将其用于 3D 细胞培养。这项技术的优点是，通过相容的自修复水凝胶，可以通过非常简单的方式制备，并使用 3D 细胞培养物。
这种水凝胶也是可注射的，因此可以用作细胞疗法的载体。现在 Yongsan Li 先生将向您展示如何制作水凝胶以及如何使用这种水凝胶进行 3D 细胞培养。Yongsan Li 是我们实验室的研究生。
要制备水凝胶，首先合成 DF PEG。在通风橱中，称取 4 克分子量为 4， 000 PEG 的 4， 000 PEG 放入圆底培养瓶中，并加入 100 毫升甲苯。然后，要溶解聚合物，请加热溶液。
所有聚合物溶解后，使用蒸发器去除所有溶剂。然后，重复加入甲苯并再蒸发两次的过程，以制备干燥的 PEG 聚合物。接下来，使用磁力搅拌器和 100 毫升 DHF，溶解聚合物。
然后，将 0.9 克 4-羧基苯甲醛溶解到溶液中。接下来，将 0.07 克二甲氨基吡啶溶解到溶液中。现在在装有无水氯化钙的干燥管中加入 1.25 克 DCC。
现在让反应物在室温下搅拌约 12 小时。第二天，使用 500 毫升冷二乙醚沉淀白色固体，并使用真空过滤收集固体。丢弃溶质，并在良好的通风下晾干固体。
接下来，将白色固体溶解在 100 毫升 THF 中。在继续之前，必须过滤掉任何不溶性白色固体。现在使用新鲜的冷二乙醚沉淀溶解的固体。
然后使用真空过滤收集固体，并让它们再次干燥。重复此过程两到三次，然后将白色固体放入真空干燥箱中以完全干燥。所得白色粉末是最终产品：苯甲醛封端的 DF PEG。
为了将细胞封装在水凝胶中进行培养，首先将 0.44 克 DF PEG 溶解到 4 毫升试管中的 2 毫升细胞生长培养基中。将混合物涡旋成 20% 重量的溶液。接下来，对溶液进行消毒。
将其装入 10 毫升注射器中，然后压入 0.22 微米的细菌截留过滤器。现在将 0.165 克乙二醇壳聚糖与 4 毫升细胞培养基混合，使用涡旋制成 4%（重量比）壳聚糖溶液。然后，使用另一个 0.22 微米的细菌截留过滤器对溶液进行消毒。
接下来，使用胰蛋白酶收获细胞，例如 L929 细胞。洗涤收集的细胞，并以每毫升 375 万个细胞的浓度重悬于培养基中。在以下步骤中，将细胞植入 3D 矩阵中。
精确遵循这些步骤对于取得成功至关重要。现在使用涡旋将 0.4 毫升细胞悬液与 0.4 毫升壳聚糖溶液混合。将这种混合物移液到直径为 2 厘米的培养皿的中心，然后将 0.2 毫升 DF PEG 溶液移液到培养皿中。
然后，使用轻柔的移液诱导水凝胶的形成。通过倾斜培养皿并观察溶液的粘度来评估水凝胶的形成。为了测试封装细胞的可注射性，请在 10 毫升注射器中进行相同的制备。
然后，在水凝胶形成后，通过 48 号针头将水凝胶缓慢排出到培养皿中。接下来，将 1 毫升培养基添加到板中的水凝胶-细胞混合物中，然后将板转移到培养箱中进行培养。每隔一天更换一次培养基，覆盖 3D 水凝胶细胞培养物。
为了制备封装在水凝胶中的细胞用于成像，首先用 1 毫升 PBS 冲洗水凝胶两次。然后，用荧光素-二乙酸酯溶液和碘化丙啶溶液对水凝胶进行染色。将 0.5 毫升两种溶液覆盖在水凝胶上，并在室温下孵育水凝胶 15 分钟。
与染色溶液短暂孵育后，吸出所有溶剂。现在使用共聚焦显微镜观察水凝胶，在 488 纳米处激发以查看活细胞，在 543 纳米处激发以查看死细胞。收集具有 2 微米切片的图像堆栈，以验证细胞在水凝胶中的分布。
L929 细胞。将体内环境组织刚度约为 5， 600 Pascals 的典型小鼠玻璃纤维细胞系封装在水凝胶中。它们在整个培养过程中的活力极高，并且实现了显著的细胞密度。
在水凝胶中培养 7 天后，细胞数量增加了 200%通过 48 号针头喷出到细胞培养皿上的水凝胶可以在大约 1 小时后自我修复以重组集成水凝胶。培养 7 天后，这些细胞也急剧增殖。可以找到细胞裂变事件的证据，其中一些细胞似乎一分为二。
活死测定显示出非常高的活力，证明注射后 3D 水凝胶中的细胞增殖成功。培养 7 天后，该细胞增殖率约为未注射细胞的 3/4。因此，尽管注射过程中的剪切力具有可测量的负面影响，但注射的细胞仍然相当增殖。
观看此视频后，您应该知道如何制备自修复水凝胶，如何使用该水凝胶进行 3D 细胞培养，以及如何使用该水凝胶递送细胞。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。按照最佳程序，可以进行其他方法，例如用于细胞治疗的体内注射或药物输送。
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概述
本文描述了一种使用动态亚胺化学制备注射式壳聚糖基水凝胶的方法。重点是调整水凝胶的机械强度以适用于三维细胞培养。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物材料
- 水凝胶
- 细胞培养
背景
- 壳聚糖是一种具有生物医学应用潜力的生物聚合物。
- 注射式水凝胶可以促进微创疗法。
- 3D细胞培养模型对于研究细胞行为至关重要。
- 自愈合特性增强了水凝胶的功能性。
研究目的
- 开发一种简单的方法来创建注射式壳聚糖水凝胶。
- 探索这些水凝胶在3D细胞培养中的应用。
- 研究水凝胶的自愈合能力。
使用的方法
- 用于水凝胶制备的动态亚胺化学。
- 通过配方变化调整机械强度。
- 水凝胶在3D细胞培养设置中的应用。
- 研究生展示了制备过程。
主要结果
- 水凝胶表现出可调节的机械性质。
- 在3D细胞培养中成功应用。
- 自愈合特性得到确认。
- 该方法被证明简单有效。
结论
- 壳聚糖基水凝胶可以轻松制备用于生物医学。
- 这些水凝胶适用于细胞治疗应用。
- 该研究为自愈合材料领域做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables the rapid preparation of injectable, self-healing chitosan hydrogels for 3D cell culture, offering a tunable platform that mimics physiological tissue stiffness. The dynamic imine chemistry allows for adjustable gelation kinetics and mechanical properties, supporting reproducible encapsulation of cells such as L929 fibroblasts. This approach addresses early-stage challenges in biomaterial design by providing a versatile, biocompatible system for evaluating cell behavior in a controlled 3D microenvironment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of cellular responses in a tunable 3D matrix that mimics native tissue stiffness (~5,600 Pa), supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Facilitates rapid hydrogel formation at room temperature within minutes, allowing high-throughput preparation of standardized 3D culture systems.
- Predictive Value: Self-healing and injectable properties enable assessment of cell resilience under mechanical stress, relevant for delivery-focused target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Hydrogels support live/dead staining and confocal imaging, enabling quantitative viability and proliferation readouts in 3D.
- Reproducibility: Consistent gelation via defined glycol chitosan to benzaldehyde-terminated PEG ratios ensures batch-to-batch uniformity for assay standardization.
- Scalability: Simple mixing and vortex-based preparation allows adaptation to multi-well formats for compound screening in 3D environments.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Demonstrated compatibility with L929 fibroblast encapsulation and sustained proliferation supports use in preclinical models of tissue repair.
- Risk-Adjusted Advancement: Self-healing after injection (recovery within ~1 hour) reduces concerns about delivery-induced damage, improving confidence in translational potential.
- Biomaterial Platform: Adjustable stiffness and responsiveness to bioactive stimuli allow modeling of disease-relevant microenvironments for preclinical screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early evaluation of cell-material interactions before advancing to in vivo models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell proliferation and viability in a defined 3D hydrogel system with tunable mechanical cues.
- Screening: Hydrogel formation is rapid and reagent-efficient, enabling preparation of standardized 3D matrices for compound or genetic perturbation screens.
- Analytics: Compatible with live/dead assays and confocal imaging, providing quantitative, spatially resolved readouts on cell distribution and viability.
- Translational Research: Demonstrated cell proliferation post-injection supports evaluation of delivery strategies in regenerative medicine contexts.
- Enterprise Reuse: The hydrogel platform is reusable across cell types and stimuli, serving as a modular tool for multiple projects in biomaterials and cell therapy research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides a tunable, biomimetic 3D environment that reduces reliance on artificial 2D culture systems, improving physiological relevance.
- Operational Value: Room-temperature gelation, simple mixing, and sterilization via filtration enable rapid, GMP-adaptable preparation without complex equipment.
- Strategic Value: Enables early assessment of delivery-related cell stress, informing go/no-go decisions for cell therapy candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by validating cell survival and function in injectable, self-healing matrices before in vivo investment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in polymer chemistry and sterile technique for synthesis of benzaldehyde-terminated PEG and hydrogel formulation.
- Needs access to standard lab equipment: vortex mixer, syringe filters, centrifuge, and confocal microscopy for validation.
- Standardization of glycol chitosan and DF PEG ratios is critical for reproducible gelation time and stiffness across batches.
- Adaptation to other cell types may require optimization of encapsulation density and crosslinking kinetics.
- While injectable, shear forces during delivery may affect cell viability, necessitating empirical validation for each therapeutic cell type.
