壳聚糖基可注射水凝胶的制备及其在三维细胞培养中的应用

本实验方案的总体目标是制备一种可注射的壳聚糖水凝胶，用于三维细胞培养，并最终应用于治疗性治疗。该方法可回答自愈合水凝胶领域的相关问题，例如如何通过完全浸没的方法制备自愈合水凝胶，以及如何将其用于三维细胞培养。该技术的主要优势在于，可通过一种极为简单的方法制备具有良好生物相容性的自愈合水凝胶，并可用于三维细胞培养。

这种水凝胶还具有可注射性，因此可用作细胞治疗的载体。现在，Yongsan Li 先生将向您演示如何制备该水凝胶，以及如何利用这种水凝胶进行三维细胞培养。Yongsan Li 是我们实验室的研究生。

制备水凝胶时，首先合成DF PEG。在通风橱中，称取4克分子量为4,000的PEG放入圆底烧瓶中，加入100毫升甲苯。然后加热溶液以溶解聚合物。

待所有聚合物溶解后，使用旋转蒸发仪除去全部溶剂。随后，再重复加入甲苯并蒸发的过程两次，以制备干燥的聚乙二醇（PEG）聚合物。接下来，使用磁力搅拌器和100毫升二甲基甲酰胺（DHF），将聚合物溶解。

然后，将0.9克4-羧基苯甲醛溶解于该溶液中。接着，将0.07克二甲基氨基嘧啶溶解于溶液中。现在，在装有无水氯化钙的干燥管中加入1.25克DCC。

现在让反应在室温下搅拌约12小时。第二天，使用500毫升冷的乙醚沉淀白色固体，并通过真空过滤收集固体。弃去溶质，在通风良好的条件下干燥固体。

接下来，将白色固体溶于100毫升四氢呋喃（THF）中。任何不溶的白色固体必须在继续操作前过滤除去。然后，使用新鲜的冷乙醚沉淀已溶解的固体。

然后使用真空过滤收集固体，并使其再次干燥。重复此过程两到三次，然后将白色固体放入真空干燥箱中彻底干燥。所得白色粉末即为最终产物：苯甲醛封端的DF PEG。

为了将细胞包埋于水凝胶中进行培养，首先在4毫升离心管中将0.44克DF PEG溶解于2毫升细胞培养基中。通过涡旋振荡使混合物形成质量分数为20%的溶液。接着，对溶液进行灭菌处理。

将其装入一个10毫升注射器中，并通过0.22微米的细菌截留滤器过滤。然后，将0.165克的乙二醇壳聚糖与4毫升细胞培养基混合，使用涡旋振荡器制备成重量百分比为4%的壳聚糖溶液。随后，使用另一个0.22微米的细菌截留滤器对该溶液进行灭菌处理。

接下来，使用胰蛋白酶消化收集细胞，例如L929细胞。洗涤收集的细胞，并将其重悬于培养基中，浓度为每毫升375万个细胞。随后将细胞接种至三维基质中。

准确遵循这些步骤对于成功至关重要。现在使用涡旋振荡器将0.4毫升细胞悬液与0.4毫升壳聚糖溶液混合。将此混合液滴加至直径为2厘米的培养皿中央，再向培养皿中滴加0.2毫升DF PEG溶液。

然后，通过轻柔吹打诱导水凝胶的形成。通过倾斜培养皿并观察溶液的黏度来评估水凝胶的形成情况。为测试包封细胞的可注射性，可在10毫升注射器中进行相同的制备。

然后，待水凝胶形成后，通过48号针头将水凝胶缓慢推出至培养皿中。接着，向培养板中的水凝胶-细胞混合物加入1毫升培养基，并将培养板转移至培养箱中进行培养。每隔一天更换一次培养基，覆盖于3D水凝胶细胞培养物上。

为准备用于成像的水凝胶包封细胞，首先用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗水凝胶两次。然后，用荧光素二乙酸酯溶液和碘化丙啶溶液对水凝胶进行染色。将0.5毫升上述两种溶液覆盖于水凝胶上，在室温下孵育15分钟。

短暂孵育染色液后，吸除所有溶剂。随后使用共聚焦显微镜观察水凝胶，以488纳米激发光观察活细胞，以543纳米激发光观察死细胞。采集层厚为2微米的图像序列，以验证细胞在水凝胶中的分布情况。

L929细胞。一种典型的小鼠成纤维细胞系，在体内环境中的组织硬度约为5,600帕斯卡，被包埋于水凝胶中。在整个培养过程中，其细胞活力极高，并达到了显著的细胞密度。

在水凝胶中培养七天后，细胞数量增加了200%。通过48号针头挤出到细胞培养皿中的水凝胶，约一小时后可自我修复，重新形成完整的水凝胶。这些细胞在培养七天后也表现出显著增殖。可观察到细胞分裂事件的证据，部分细胞呈现出分裂为两个的状态。

活死染色实验显示细胞存活率非常高，表明细胞在注射后于三维水凝胶中成功增殖。该细胞增殖速率约为未注射细胞在培养七天后的四分之三。因此，尽管注射过程中的剪切力对细胞产生可测量的负面影响，注射后的细胞仍保持了较强的增殖能力。

观看本视频后，您应掌握如何制备自愈合水凝胶，如何利用该水凝胶进行三维细胞培养，以及如何通过该水凝胶递送细胞。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在一小时内完成。在遵循最佳操作流程的基础上，还可进一步开展其他方法，例如用于细胞治疗或药物递送的体内注射。