Name: 一种从任意 DNA 源进行大规模 gRNA 库生产的通用协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习CORALINA方法，通过微球菌核酸酶酶切纯化DNA，构建全面的CRISPR gRNA文库。该技术可从任何DNA来源生成所有可能的向导RNA，成本低廉，适用于各种生物体的基因筛选研究。

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作者感谢Stephan Beck教授和Magdalena Goetz教授在开发CORALINA方法过程中提供的意见、帮助与支持，感谢Maximilian Wiessbeck和Valentin Baumann提出的有益建议。本工作得到了德国研究基金会（DFG）（STR 1385/1-1）的资助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CORALINA 可通过受控的核酸酶消化靶 DNA 并对产生的双链片段进行大规模克隆，从而构建大规模的 gRNA 文库。统计推断表明，使用本方案已成功克隆的独立 gRNA 序列数量远超 107 个9。CORALINA 可在多个方面进行定制。模板 DNA 的选择决定了目标区域以及所生成文库的最大复杂度。使用本方案，此前已从人和小鼠的基因组 DNA 成功构建 CORALINA 文库9。本文展示的代表性结果描述了从纯化的 BAC DNA 构建 CORALINA 文库的过程。通过选择不同的 gRNA 表达载体和连接子序列，可进一步实现定制化。我们此前已测试了三种不同长度的连接子组合用于 Gibson 组装，其效率差异较小9。
由于CORALINA gRNA的间隔序列源自整体消化的DNA，其长度通常并非精确的20 bp，而是呈现一定的长度分布，其均值取决于MNase消化的参数以及从PAGE凝胶中切取的片段大小。图2B 和 C 所示的代表性示例中，片段的中位长度介于19至27 bp之间。根据我们的经验，所生成的gRNA间隔序列能够忠实地保留原始片段的长度9。由于过短的片段（短于20 bp）会导致gRNA的脱靶率升高，应予以避免；而较长的片段在后续应用中通常问题较小，已有研究表明，间隔序列长达45 bp的gRNA仍具有功能活性9。
CORALINA 实验方案中最关键的两个步骤是 MNase 消化片段的大小选择和克隆步骤。若产生的片段过短（例如，平均长度低于 18 bp），或引入过多空的 gRNA 表达载体，则会导致文库失效。因此，优化 MNase 消化步骤（图 2A）、监测片段切离情况（图 2B、C）、确认 gRNA 载体骨架被完全消化，并在整个实验流程中设置不含片段的对照组，均至关重要。同时必须特别注意保持 gRNA 文库的代表性。文库构建过程中常见的瓶颈之一是将质粒高效转入细菌以进行扩增。因此，需要大量具有高转化效率的感受态细菌以及大量的独立电穿孔操作，才能获得足够数量的 gRNA 克隆。
在未来几十年内，为了充分挖掘基于CRISPR的筛选方法的全部潜力，必须开发新的gRNA文库构建策略。目前迫切需要成本低廉、操作简便且可定制的方法来生成大规模文库，这是使筛选技术能够应用于更多模式系统以及不同CRISPR工程方法的前提条件。CORALINA为此迈出了第一步。其潜在应用十分广泛，尤其适用于构建基因组的全面文库、来源于非主流模式生物的cDNA文库、高度特异性的文库，以及联合使用多种具有不同PAM要求的CRISPR蛋白的实验设计。
与其他方法不同，CORALINA 能够从输入的 DNA 中生成所有可能的 gRNA。然而，该方法的一个缺点是文库中也包含了缺乏所需 PAM 序列的 gRNA，这一特点与另一种用于生成 gRNA 文库的酶法 CRISPR-EATING 共有（表 1）。选择理想的 gRNA 文库构建方法取决于计划进行的筛选实验的具体要求，尤其是目标区域的性质（基因区、调控区、基因间区）和大小（单个位点、多个区域或全基因组范围）。我们认为，在需要分析大量非编码区或调控区、序列信息不完整或不可靠（如非传统模式系统、物种混合样本（例如 微生物组）或实验获得的输入材料）、联合使用不同的 CRISPR 核酸内切酶，或对较短且明确的位点进行饱和分析（例如 由 BAC 克隆代表的区域）时，使用 CORALINA 具有特殊优势。

将细菌的 CRISPR/Cas9 系统改造为一种分子靶向工具，引发了分子生物学领域最近的一场革命。以往从未有过如此简便的方法可在基因组特定位点上操控染色质。CRISPR 的常见应用包括靶向基因突变1、基因组编辑2、表观基因组编辑3、转录激活以及基因沉默4。CRISPR 系统的一个显著优势在于，其应用并不局限于已被深入研究的候选位点，因为 gRNA 文库使得无偏倚的筛选成为可能。这有助于在无需任何先验实验知识的情况下发现基因组中的功能位点。然而，目前 gRNA 文库的构建主要依赖于寡核苷酸合成，且可供购买的非人源或非小鼠来源的 gRNA 文库，或靶向开放阅读框以外区域的文库选择十分有限。因此，尽管 CRISPR 筛选已展现出极强的应用潜力5,6,7,8，但其全部潜力尚未被充分挖掘。
为了克服传统gRNA生成方法的局限性，近年来已发展出两种新策略。这两种策略均基于对目标DNA进行可控的酶切消化，而非依赖定制寡核苷酸合成。CORALINA9采用微球菌核酸酶，而目前唯一可替代的方法CRISPR-EATING10则利用限制性内切酶（HpaII、ScrFI、BfaI和MmeI）。重要的是，这两种技术均可应用于任意输入DNA，将其作为gRNA原间隔序列的来源。尽管CRISPR-EATING方法采用策略减少了克隆的gRNA中其靶位点后不含有必需的S.pyogenes PAM（原间隔序列邻近基序）的数量，但它仅能生成特定区域内所有可能功能性gRNA的一小部分。相比之下，CORALINA能够生成来源于序列的所有潜在gRNA，但也包含更高比例的非功能性向导序列。通过可控核酸酶活性进行gRNA文库构建，可简便且经济地为任何物种、任何Cas9蛋白或效应系统生成全面的gRNA文库。此外，CORALINA具有良好的可定制性，通过选择合适的输入材料和载体即可决定文库的类型、大小和内容。本文提供了一套详细的实验方案，可用于从多种DNA来源（图1）——包括细菌人工染色体（BACs）或基因组DNA9——构建全面的gRNA文库。本方案所附的代表性结果是将CORALINA方法应用于BAC DNA后获得的。

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4.，Mnase 的失活</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE 上样缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&amp;reg; TBE 凝胶，20%，10 孔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1.，预制 20% PAGE 凝胶</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA 标准品</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&amp;reg; TBE 电泳缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1.，PAGE 凝胶电泳缓冲液</td></tr><tr><td>一次性无菌手术刀</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>233-5363&amp;nbsp;</td><td>2.3.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>SYBR Green I 核酸染料（DMSO 中 1000 倍浓缩液）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>&lt;br/&gt; S9430</td><td>2.3. + 2.5.，Thermo Fisher Scientific 亦有供应（S7563）</td></tr><tr><td>UltraPure 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>糖原</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>3M 乙酸钠，pH 5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&amp;nbsp; R1181</td><td>3.6.4.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8.，分子生物学级</td></tr><tr><td>快速平末端修复试剂盒&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; A1542</td><td>3.1.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>乙酸镁</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; M5661</td><td>3.1.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA（pH 8.0）</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp; MOLEM37465520（或 Promega V4231）</td><td>2.2. + 3.1.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7. + 7.1. + 8.4.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>高浓度 T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>&amp;nbsp;M0202T</td><td>6.1. + 8.1.2.</td></tr><tr><td>Long Amp Taq 2X 预混液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>含 HF 缓冲液的 Phusion 高保真 PCR 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6.，可使用其他等效试剂</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl₂</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP、dATP、dCTP、dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; DTT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>T5 核酸外切酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion DNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>TG1 感受态细胞</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>1 mm 间隙电穿孔比色皿&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&amp;nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>生物检测皿（聚苯乙烯，245 mm × 245 mm × 25 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&amp;nbsp;</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653&amp;nbsp;</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>&lt;br/&gt; G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>全文</td></tr><tr><td>MicroPulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>732-2267&amp;nbsp;</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>250 ml 离心管</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1–9.9.</td></tr></tbody></table>

一种从任意dna来源大规模制备grna文库的通用方案

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

CRISPR/Cas9 系统在基因组和表观基因组编辑中的广泛应用源于其简单性和可适应性。一种效应分子（Cas9 核酸酶或无核酸酶活性的 dCas9 融合蛋白）通过一种称为向导 RNA（gRNA）的小型合成 RNA 被靶向至基因组中的特定位点。CRISPR 系统的双组分特性使其可用于筛选研究，因为含有数千个独立 gRNA 表达盒的质粒文库可在单次实验中对基因组中多个不同位点进行功能探究。
迄今为止，用于文库构建的gRNA序列几乎完全依赖于寡核苷酸合成，这种方法限制了文库中序列的复杂性，且成本相对较高。本文详细介绍了一种名为CORALINA（通过可控核酸酶活性实现全面gRNA文库生成）的方法，这是一种简单且经济高效的gRNA文库构建技术，基于对输入DNA的酶切消化来生成高度复杂的gRNA文库。由于CORALINA文库可由任何来源的DNA制备，因此具备丰富的定制化选择，能够支持多种多样的CRISPR相关筛选实验。

利用本实验方案，已从人和小鼠基因组DNA中构建出CORALINA gRNA文库9 和 BAC DNA（图1）。为了获得适合克隆至gRNA表达载体中的输入DNA片段，必须确定可控核酸酶消化的最佳条件。图中展示了一个典型的微球菌核酸酶消化优化结果。 图2A. 核酸酶用量不足（0.1、2、3、4、4.5 或 5 单位）时，在目标大小范围（10–100 bp）内未产生明显产物；而使用 5.5–7.5 单位时，产生的片段平均长度仍然过长。当酶用量较大（50 单位）时，10 分钟后会导致输入 DNA 过度降解。因此，选择了一个中间用量（10 单位）。随后将消化反应放大，以获得足量的消化片段用于后续纯化与克隆图2B）。尽管建议根据大小盲选DNA片段，并仅依靠DNA marker进行定位，以尽量减少DNA片段暴露于紫外光下，但凝胶可在后续染色，以对酶切和切割效果进行质量控制。 图2B 展示了一个典型的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶示例，其中已切取20至30 bp之间的DNA片段。将凝胶纯化的MNase片段上样至20% PAGE凝胶，以检测MNase消化片段的大小选择和纯化是否成功。图2C）。本方案可兼容定制的连接子序列，从而能够将MNase消化的片段克隆至选定的gRNA表达载体中。此处使用gRNA-PLKO9 用作骨架。使用标准PCR从gRNA表达载体中扩增连接子。 图 2D 展示了一个扩增接头序列的代表性示例，其中不含额外的、错误的或无模板的扩增产物。随后，使用限制性内切酶对接头扩增产物进行消化，以确保接头以正确的方向连接到MNase消化的片段上。 图2D 显示5'和3'接头在用限制性内切酶消化前后的琼脂糖凝胶电泳结果 后肢III 和 SacII，表明接头已完全消化为预期的637 bp和295 bp片段。凝胶图像右侧部分显示了消化后接头片段的切除情况。在通过凝胶回收消化后的接头片段后，下一步是将接头连接至末端修复的MNase消化片段。由于接头序列是通过PCR使用未磷酸化的引物扩增获得，因此接头自身不会发生自连。只有经过末端修复的MNase消化DNA片段才能提供连接反应所需的磷酸基团。在完成切口平移后，通过PCR扩增连接产物。为避免过度PCR扩增可能引起的偏差，进而影响文库中gRNA序列的代表性，总扩增循环数限制在20个循环以内。PCR完成后，扩增产物在琼脂糖凝胶上难以观察，因此需另设32个循环的对照PCR以检测产物（但该对照PCR产物不用于文库构建）。该对照PCR的结果如图所示 图2E这有助于优化连接反应，并确保反应中不存在PCR伪影，这些伪影有时会出现在“无片段对照”（NFC）中。 图 2E 显示在使用片段与接头序列等摩尔比（1:1）进行连接反应扩增后，获得的目标扩增子（5'接头 + DNA片段 + 3'接头，长度：869 bp）。
<img alt="CRISPR 工作流程示意图；DNA 提取、扩增、电穿孔；向导 RNA 文库制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：gRNA 文库制备建议时间线。 CORALINA 提供了一种简单且成本效益高的策略，可从任何生物体的多种不同 DNA 来源中构建全面的 gRNA 文库。本方案可在一周的工作时间内完成。接头生成可与 DNA 末端修复并行进行。制备电转化感受态细菌需要两天时间，包括过夜培养步骤，因此应在组装反应设置之前开始。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA片段化的电泳结果；凝胶实验中可见MNase单位和bp梯度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：实验方案中的关键步骤。 (A) 对BAC DNA进行可控消化，可产生不同大小的片段。图中展示了MNase消化的优化结果。纯化的BAC DNA用不同量的MNase处理10分钟。10 U的MNase可生成所需长度（20–30 bp）的DNA片段。(B) 通过从聚丙烯酰胺凝胶中切胶，选择20至30 bp大小的片段。纯化的BAC DNA用10 U MNase处理10分钟。图像为切胶后记录。(C) 对凝胶纯化片段的质量控制。凝胶纯化后，取六分之一纯化的MNase片段上样至20% PAGE凝胶，以检测片段大小选择和纯化是否成功。(D) 扩增用于组装的接头序列，并用限制性内切酶消化接头以确保定向克隆。5'和3'接头分别经HindIII和SacII酶切。设置无模板对照（NTC），以排除PCR假象和DNA污染。左侧：分析样品上样；右侧：制备样品上样。图像为凝胶切胶后记录。(E) 可通过增加PCR循环数（32个循环）进行PCR分析，以检测接头与DNA片段的连接是否成功，并设置以H2O作为模板的无模板对照（NTC），或以前一步缺口平移反应的NTC作为输入（NTC NT）进行对照。必须包含无片段对照（NFC），即在连接和缺口平移反应中省略MNase片段的扩增对照。只有将MNase片段与接头DNA结合的样品才能扩增出预期产物（869 bp）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

生成大规模gRNA文库的方法应具备简单、高效且成本低廉的特点。本文介绍了一种基于靶DNA酶切的gRNA文库制备方案。该方法称为CORALINA（通过可控核酸酶活性实现全面gRNA文库构建），为昂贵的定制寡核苷酸合成提供了替代方案。

一种从任意DNA来源大规模制备gRNA文库的通用方案

CRISPR/Cas9 系统在基因组和表观基因组编辑中的广泛应用源于其简单性和可适应性。效应蛋白（Cas9）...

本方法的总体目标是从任意来源的纯化 DNA 构建全面的向导 RNA 文库。gRNA 文库是用于基于 CRISPR 筛选的质粒集合。CORALINA 方法利用酶消化纯化的 DNA，将产生的片段克隆至向导 RNA 文库载体中。该技术的主要优势在于能够从输入序列中产生所有可能的向导RNA，且成本效益非常高。尽管本视频演示了如何从细菌人工染色体中构建CORALINA文库，但原则上该方法可应用于任何生物来源的任何类型输入DNA。每次使用新的微球菌核酸酶批次时，都必须对该酶的消化条件进行优化。为每个反应体系设置以下组分：1 微升 10x 微球菌核酸酶缓冲液、1x 牛血清白蛋白、1 微克目标 DNA、1 微升微球菌核酸酶，加水至总体积 10 微升。在 37 摄氏度孵育 15 分钟。通过加入一微升500毫摩尔的EGTA立即灭活酶。向DNA样品中加入含上样染料的上样缓冲液，并在20%聚丙烯酰胺凝胶中每孔上样一微克DNA。同时加载合适的DNA分子量标记物用于片段大小分析。在1×TBE电泳缓冲液中以150伏电压电泳约1.5小时，或直至下层染料前沿迁移至凝胶底部。使用超敏核酸染料对凝胶进行染色，并在紫外光下观察。本示例中，将DNA消化至20至30个碱基对大小的最佳微球菌核酸酶浓度为10单位。使用该最适浓度的微球菌核酸酶，以与优化反应相同的方法消化10至12微克的目标DNA。通过PAGE分离DNA片段后，使用无菌手术刀在标记物泳道附近切割凝胶，并仅用含有超敏核酸染料的新鲜1x TBE电泳缓冲液对含有DNA梯形条带的部分进行染色。观察DNA梯形条带，并使用刀片切下大小约为18至30个碱基对之间的微球菌核酸酶消化的DNA片段。将凝胶切片转移至微量离心管中。用核酸染料对剩余的凝胶进行染色，方法如前所述。将凝胶暴露于紫外光下，并成像以记录凝胶切取步骤。使用无菌移液器吸头将切下的凝胶片在微量离心管管壁上压碎，开始此操作。加入两倍凝胶体积的PAGE溶解缓冲液，在37摄氏度旋转平台上孵育16小时。次日，在微量离心机中以最大速度离心样品一分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，注意避免转移任何破碎的凝胶碎片。向凝胶沉淀中加入0.5倍体积的PAGE溶解缓冲液，涡旋振荡后重复离心。合并上清液，并按照文本方案中所述的标准酚-氯仿提取方法提取DNA片段。在分离DNA片段的同时，使用标准PCR方法从向导RNA表达载体扩增接头序列。为确保定向克隆，随后根据文本方案所述，用相应的限制性内切酶对接头进行消化。将接头的限制性内切酶消化产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。切下正确的条带，并使用胶回收试剂盒从切下的凝胶片段中纯化DNA。末端修复反应使用DNA平端化试剂盒。将以下组分加入微量离心管中。10 µL 纯化的 DNA，1.5 µL 10× 平末端缓冲液，1.5 µL 1 mM dNTP 混合物，1.4 µL 水和 0.6 µL 平末端酶。在 22 °C 下孵育 30 分钟，然后在 70 °C 下孵育 10 分钟以加热并激活酶。加入 85 µL 水，并按照文本方案中所述进行反应纯化。按照文本方案所述，使用等摩尔量的微球菌核酸酶消化并修复的片段与接头序列，设置一个14微升的连接反应。在完成切口平移后，通过PCR扩增连接产物。为了分离正确连接了5'端和3'端接头的微球菌核酸酶片段与含有两个5'端或两个3'端接头的片段，将所有15个循环的PCR反应产物合并，加入DNA上样染料，并在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离。切下869个碱基对处的明显条带，使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。使用分光光度计测定DNA含量。随后，按照文本方案中的说明，通过Gibson组装将PCR扩增的片段克隆至向导RNA表达载体中。开始此实验步骤时，将纯化的载体插入片段构建物分装至无菌且预冷的 PCR 管中，并置于冰上保存。将 1 毫米间隙的电穿孔比色皿置于冰上预冷。取 25 µL 新鲜制备的 TG1 感受态细胞直接加入一份 DNA 样品中，并立即将混合物转移至电穿孔比色皿中。轻弹或轻触比色皿，确保细胞与DNA混合物均匀分布于比色皿腔室中，无残留气泡或空气。将比色皿放入电穿孔仪样品槽中，并启动相应的电穿孔程序。立即向比色皿中加入475 μL室温2TY培养基。将电穿孔后的细菌转移至一个50毫升离心管中。重复单次电穿孔操作，将同一文库转化的所有细胞收集到同一个50毫升离心管中，并记录总体积。为估算整个文库的总菌落数，取一定量经文库转化的细菌，接种于含适当抗生素筛选的10厘米琼脂平板上。为减少剩余细菌的体积，在约 4,000 g 条件下离心 10 分钟，直至形成可见的沉淀并使上清液变得澄清。除去上清液，仅保留数毫升，然后重新悬浮细胞。将细菌接种至含有适当抗生素筛选的 2TY 琼脂包被的生物测定培养皿中。将适量的pUC19对照电转化反应液涂布于另一块含有适当抗生素筛选的10厘米琼脂平板上。将琼脂平板置于37摄氏度过夜培养。次日，计数对照平板上的菌落数量，以估算每微克DNA的菌落形成单位数，从而评估细菌的转化效率及文库复杂度。最后，从平板上刮取细菌用于质粒DNA提取。经凝胶纯化后，取六分之一纯化的微球菌核酸酶片段上样至20% PAGE胶，以确认大小选择和纯化成功。连接子扩增产物经限制性内切酶消化，以确保连接子以正确方向连接至微球菌核酸酶消化的片段上。该代表性凝胶图像的左侧显示了五个5'端和3'端接头在分别用HindIII和SacII消化前后的结果，表明接头已完全消化为预期的637个碱基对和295个碱基对。凝胶图像右侧记录了消化后接头片段的切除情况。通过增加PCR循环次数的PCR方法分析接头与DNA片段连接的成功与否。对照组包括：以先前切刻平移步骤中的无模板对照作为输入的无模板对照，以及无微球菌核酸酶片段对照。只有将微球菌核酸酶片段与接头DNA混合的样品，才能扩增出预期的869碱基对扩增子。若操作得当，掌握该技术后可在五天内完成。在进行该实验操作时，保持文库的复杂性并进行其他对照反应非常重要。观看本视频后，您应已充分了解如何通过将DNA切割成小片段并将其克隆至文库载体骨架中，从而构建用于CRISPR筛选的向导RNA文库。

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遗传学

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关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

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基于CRISPR的模块化组装法用于高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒文库

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