一种通用的大规模gRNA文库制备方案：适用于任何DNA来源

该方法的总体目标是从任意来源的纯化 DNA 构建全面的向导 RNA 文库。gRNA 文库是用于基于 CRISPR 筛选的质粒集合。CORALINA 方法利用酶消化纯化的 DNA，将产生的片段克隆到向导 RNA 文库载体中。

该技术的主要优势在于，它能够从输入序列中产生所有可能的向导RNA，并且成本效益非常高。尽管本视频演示了如何从细菌人工染色体中构建CORALINA文库，但原则上，该方法可应用于任何生物来源的各类输入DNA。每次使用新的一批微球菌核酸酶时，都必须对其进行消化条件的优化。

为每个反应体系设置以下组分：1 微升 10x 微球菌核酸酶缓冲液、1x 牛血清白蛋白、1 微克目标 DNA、1 微升微球菌核酸酶，加水至总体积 10 微升。在 37 摄氏度孵育 15 分钟。

通过加入一微升500毫摩尔的EGTA立即灭活酶。向DNA样品中加入含上样染料的上样缓冲液，并在20%聚丙烯酰胺凝胶中每孔上样一微克DNA。同时加载合适的DNA分子量标记物以进行片段大小测定。

在1×TBE电泳缓冲液中以150伏电压电泳约1.5小时，或直至下层染料前沿迁移至凝胶底部。使用超敏核酸染料对凝胶进行染色，并在紫外光下观察。在此示例中，将DNA消化至20至30个碱基对大小的最佳微球菌核酸酶浓度为10单位。

使用该最适浓度的微球菌核酸酶，以与优化反应相同的方法消化10至12微克的目标DNA。通过PAGE分离DNA片段后，使用无菌手术刀在marker条带旁切割凝胶，并仅用含有超敏核酸染料的新鲜1x TBE电泳缓冲液对含有DNA梯度条带的凝胶部分进行染色。观察DNA梯度条带，并使用剃刀片切下大小约为18至30个碱基对之间的微球菌核酸酶消化的DNA片段。

将凝胶切片转移至微量离心管中。用核酸染料对剩余的凝胶进行染色，方法如前所述。将凝胶暴露于紫外光下，并获取图像以记录凝胶切取步骤。

开始此操作时，使用无菌移液器吸头将切下的凝胶片在微量离心管管壁上压碎。加入两倍凝胶体积的PAGE溶解缓冲液，在37摄氏度旋转平台上孵育16小时。次日，在微量离心机中以最大速度离心样品1分钟。

将上清液转移至新的微量离心管中，注意避免转移任何破碎的凝胶碎片。向凝胶沉淀中加入0.5倍体积的PAGE溶解缓冲液，涡旋振荡并重复离心。合并上清液，并按照文本方案中所述的标准酚-氯仿提取方法提取DNA片段。

在分离DNA片段的同时，使用标准PCR方法从向导RNA表达载体中扩增接头序列。为确保定向克隆，随后根据文本方案所述，用相应的限制性内切酶对接头进行消化。将接头的限制性内切酶消化产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳。

切下正确的条带，并使用胶回收试剂盒从切下的凝胶片段中纯化DNA。末端修复反应使用DNA平端化试剂盒。将以下成分加入微量离心管中。

10 微升纯化的 DNA，1.5 微升 10x 平端化缓冲液，1.5 微升 1 毫摩尔的 dNTP 混合物，1.4 微升水和 0.6 微升平端化酶。在 22 摄氏度孵育 30 分钟，然后在 70 摄氏度孵育 10 分钟以加热并激活酶。加入 85 微升水，并按照文本方案中所述进行反应纯化。

按照文本方案所述，使用等摩尔量的微球菌核酸酶消化并修复的片段与接头序列，设置一个14微升的连接反应。在完成切刻平移后，通过PCR扩增连接产物。为了分离正确连接了5'端和3'端接头的微球菌核酸酶片段与带有两个5'端或两个3'端接头的片段，将所有15个循环的PCR反应产物合并，加入DNA上样染料，并在0.8%琼脂糖凝胶上电泳分离。

切下869个碱基对处明显的条带，使用凝胶回收试剂盒纯化DNA。使用分光光度计测定DNA的含量。随后，按照文本方案中的说明，通过Gibson组装将PCR扩增的片段克隆至向导RNA表达载体中。

开始此操作时，将纯化的载体插入片段构建物分装至无菌且预冷的PCR管中，并置于冰上保存。将1毫米间隙的电穿孔杯置于冰上预冷。取25微升 freshly prepared TG1细胞直接加入一份DNA样品中，并立即将混合物转移至电穿孔杯中。

轻弹或轻触比色皿，确保细胞与DNA混合物均匀分布于比色皿腔室的全长，无任何滞留空气或气泡。将比色皿放入电穿孔仪的样品槽中，并启动相应的电穿孔程序。立即向比色皿中加入475 µL室温2TY培养基。

将电穿孔后的细菌转移至一个50毫升离心管中。重复单次电穿孔操作，将使用同一文库转化的所有细胞收集到同一个50毫升离心管中，并记录总体积。为估算整个文库的总菌落数，取已用该文库转化的少量细菌，定量接种于含适当抗生素筛选的10厘米琼脂平板上。

为减少剩余细菌的体积，在约 4,000 g 条件下离心 10 分钟，直至形成可见的沉淀且上清液变得澄清。保留数毫升上清液，其余全部弃去，并重新悬浮细胞。将细菌接种至含有适当抗生素筛选的 2TY 琼脂包被的生物测定培养皿中。

将适量的pUC19对照电转化反应液涂布于另一块含有适当抗生素筛选的10厘米琼脂平板上。将琼脂平板置于37°C过夜培养。次日，计数对照平板上的菌落数量，以估算每微克DNA的菌落形成单位数（CFU/μg DNA），从而评估细菌的转化效率及文库复杂度。

最后，从平板上刮取细菌用于质粒DNA提取。经凝胶纯化后，取六分之一纯化的微球菌核酸酶片段上样至20% PAGE凝胶，以确认大小选择和纯化成功。连接子扩增产物经限制性内切酶消化，以确保连接子以正确方向连接至微球菌核酸酶消化的片段上。

该代表性凝胶图像的左侧显示了五个引物和三个引物连接子在分别用 HindIII 和 SacII 消化前后的结果，表明连接子已完全消化为预期的 637 个碱基对和 295 个碱基对。凝胶图像的右侧记录了消化后连接子片段的切除情况。通过增加 PCR 循环次数的 PCR 方法分析连接子与 DNA 片段的成功连接。

对照组包括一个无模板对照，该对照使用上一步nick translation中的无模板对照作为输入，以及一个无微球菌核酸酶片段对照。只有将微球菌核酸酶片段与接头DNA结合的样品，才能产生预期的869个碱基对扩增子。一旦掌握，若操作正确，该技术可在五天内完成。

在进行该实验操作时，保持文库的复杂性并进行其他对照反应非常重要。观看本视频后，您现在应该已充分了解如何通过将DNA切割成小片段并将其克隆至文库载体骨架中，从而构建用于CRISPR筛选的向导RNA文库。