Name: 大鼠部分视神经切断术: 建立一种新的手术方法评价视网膜神经节细胞二次变性的模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: 学习大鼠部分视神经切断术这一创新手术方法，用于研究青光眼视网膜神经节细胞继发性变性机制。该模型便于药物递送和示踪剂应用，有助于深入理解神经退行性疾病。

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本工作得到北京市自然科学基金（7152038）、中南大学中央高校基本科研业务费专项资金（2016zzts162）以及爱尔眼科医院集团科研基金（编号：AF156D11）的资助。最后，Fancheng Yan&#160;感谢徐一平多年来提供的宝贵支持。

涉及动物实验的操作已获得首都医科大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。所有手术器械和溶液在手术前均经过灭菌处理，以减少微生物感染的风险。
注意：手术方案包括五个部分，即麻醉、手术入路、视神经评估、关闭切口和术后恢复。为了辅助实现视神经的部分定量横断，设计了一种新型的低成本手术器械。所有操作均遵循伦理规范和手术技术要求进行。
1. 手术技术
<ol>
	<li>使用无菌技术进行实验；动物使用方案应符合各机构的具体规定。</li>
	<li>灭菌器械和材料（溶液、待测物质、示踪剂、针头、 等等。)接触活体组织，以防止感染以及对动物福利造成不良影响，并避免对研究产生潜在的负面影响。</li>
</ol>
2. 麻醉
<ol>
	<li>使用兽用异氟烷蒸发器系统麻醉SD大鼠。以1 L/min的流速使用医用级氧气汽化异氟烷气体。将动物放入连接的麻醉箱中，并以4.5%浓度通入异氟烷，直至动物呼吸变慢并进入镇静状态。</li>
	<li>将气流切换至面罩装置，并将动物置于手术台上。将异氟烷浓度降低至2%，并持续监测麻醉状态。体型较大的动物（&#62;300 g）可能需要更高浓度的异氟烷。手术过程中持续监测麻醉深度，根据需要调整异氟烷用量。持续评估呼吸深度和频率，并每5分钟进行一次足趾夹捏测试，以确保无深部疼痛反应。</li>
	<li>手术完成后，关闭异氟烷，让动物在移离手术台前吸入氧气数分钟。手术期间通过覆盖手术毯和/或使用控温加热毯维持动物体温。</li>
</ol>
3. 自主设计的外科辅助器械（SSAI）
<ol>
	<li>使用由不锈钢制成的SSAI，其主要由手持杆（长度100 mm，直径9 mm）和带槽头部组成（图1）。带槽头部的槽面呈半圆形，其垂直深度、宽度和长度分别为200 µm、500 µm和1,000 µm。两部分之间为一段长度为50 mm的连接部。带槽头部的边缘宽为300 µm。 
	注意：带槽表面可用于稳定视神经腹侧以便进行横断。当视神经腹侧位于槽内时，背侧视神经暴露于槽外；此时，当进行垂直切割时，暴露于槽缘的视神经背侧部分可被横断，而位于槽面内的视神经腹侧部分则受到带槽头部边缘的保护。</li>
	<li>通过对视神经轴突（背侧）进行定量横断，实现与之对应的RGCs的原发性损伤；而继发性损伤则发生在与未横断视神经轴突（腹侧）相对应的RGCs中，且无直接损伤。</li>
</ol>
4. 手术入路
<ol>
	<li>将大鼠右侧朝上放置于手术台上，头部朝向术者。调整右侧眼眶至手术视野中央。随后，用含0.5%氯己定的75%乙醇，沿右侧眼外眦至外耳道口方向反复清洁切口区域数次。使用虹膜剪去除眼外眦至外耳道口之间的毛发。</li>
	<li>使用虹膜剪沿眼外眦至外耳道口方向做皮肤切口，长度为0.5至1 cm。然后用带齿镊（0.12 mm齿）夹住筋膜并向上提起，形成三角形瓣。将Vannas弹簧剪的下 blade 插入切口区域，并沿相同剪切方向剪开筋膜。</li>
	<li>用Vannas弹簧剪剪开筋膜，暴露眶静脉。使用尖齿镊夹住眶静脉两侧，钝性分离切口两侧。将眶静脉置于眶肌表面的手术方向上，以利于后续操作，并避免眶静脉术中出血。</li>
	<li>使用虹膜剪沿切口线剪开右侧眼外眦，充分暴露视野，以便后续进行眶肌的钝性分离。</li>
	<li>继续夹住筋膜下眶肌的皱褶，沿皮肤和筋膜切口方向垂直进行钝性分离。逐渐向两侧分离直至达到眶深部，直至出现眶脂肪组织。</li>
	<li>暴露眶脂肪组织后，将大鼠头部方向由正对术者转至术者右侧。同时，使用含无菌PBS的手术棉签或棉拭子持续保持术区湿润。该操作可确保手术视野清晰，同时维持组织湿润柔软。</li>
</ol>
5. 暴露视神经
<ol>
	<li>剪除眼眶腔内视神经周围眼外肌锥体所覆盖的眶内脂肪组织，以充分暴露合适的手术入路。切除脂肪组织时应适度，避免造成持续性出血。</li>
	<li>剪开脂肪组织，暴露外直肌。用镊子将外直肌向外夹持并用Vannas弹簧剪剪断。若外直肌下方仍有脂肪组织残留，可用0.12 mm齿状镊提起视神经上方的脂肪组织，并用Vannas弹簧剪将其剪除。 
	注意：此时应可见视神经周围的组织鞘。</li>
	<li>沿视神经走行方向继续向眶深部分离组织鞘，直至完全暴露视神经。使用手术棉签及时清理组织去除过程中产生的少量出血，保持术区清洁。 
	注意：此时视神经应已清晰可见。</li>
	<li>为暴露视神经，需去除包绕神经的脑膜鞘，同时避免损伤眼动脉。在手术显微镜下以高倍放大仔细旋转脑膜鞘，观察其硬脑膜的血管分布模式。
	<ol>
		<li>选择无血管区域，沿纵轴方向切开硬脑膜。13 使用26G针尖或蓝宝石手术探针的刀尖，沿视神经走行方向小心撕开鞘膜，避免横向撕裂损伤血管结构。 
		注意：此时覆盖在神经上的唯一结构应为蛛网膜，其非常薄且透明。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>参照步骤5.2的方法，使用26G针尖或蓝宝石手术探针的刀尖，沿视神经走行方向轻柔地撕开蛛网膜。13</li>
	<li>将视神经轻柔地置于器械凹槽内，使视侧视神经略高于凹槽头部边缘。此时，使用26G针尖或蓝宝石手术探针的刀尖，在凹槽平台边缘上方横断视神经背侧，完成部分视神经横断术。</li>
</ol>
6. 关闭与恢复
<ol>
	<li>将器械稍向视神经的垂直方向深入，以松解视神经。然后轻柔地移除器械的沟头部分。注意避免刮伤眼外肌或其他组织，以防造成额外损伤。此时可观察到部分视神经横断后的残端。</li>
	<li>将眼球的外直肌、筋膜及其他周围组织复位至原始位置。随后依次缝合眼眶的肌肉层和皮肤层。若仍有出血，可在关闭伤口前用医用棉球轻轻填塞，并维持一段时间。伤口处涂抹抗生素软膏，以预防感染。</li>
	<li>关闭异氟烷气源，让动物吸入纯氧数分钟。在大鼠复苏过程中，使用加热垫进行保温，或在笼面覆盖干燥垫料。用毯子覆盖动物，确保恢复期间呼吸道通畅。</li>
	<li>术后将动物单独饲养。根据机构动物护理部门提供的指南，给予术后镇痛药物。术后需密切监测动物状态。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者声明均无任何利益冲突。

操作步骤
在模型构建过程中，有一些要点需要注意。在步骤4.2中，手术操作应谨慎进行，以避免损伤筋膜下肌肉上方的血管结构。特别是在外侧眶缘处切开皮下筋膜时，应使用锐齿镊垂直向上牵拉筋膜表面的皮下筋膜；使用Vannas弹簧剪刀进行筋膜切开，以避免损伤外侧眶缘处的眶静脉，否则可能导致因大量出血而造成模型失败。步骤4.3的优势在于，可有效预防直接从血管上剥离时发生出血。在步骤4.5分离眼眶肌肉时，选择锐齿镊而非Vannas弹簧剪刀的原因是为了避免持续性出血和血肿形成。肌肉应沿垂直于皮肤筋膜切口的方向向两侧钝性分离；同时将眼眶深部肌肉向外周牵拉。该操作可暴露眶腔更深层结构，扩大手术视野，便于无阻碍地接触覆盖视神经的组织。在上述操作过程中，若发生出血，应使用无菌外科棉签或棉拭子施加压力止血。轻微出血通常在数秒内即可停止。步骤4.6的目的是便于后续操作，可更轻松地去除部分脂肪，并在眶肌锥内分离肌肉，从而沿眶内视神经走行方向暴露视神经。
当前方案中最关键的步骤是5.1–5.6。操作过程中必须注意不要损伤视神经乳头周围的血管系统。视神经的横断应至少在眼球后方1.5–2.0 mm处进行，以避免损伤眼动脉——该动脉在距眼球1 mm范围内穿入视神经，为视网膜内层供血。切断外直肌的目的是更好地暴露视神经，因为外直肌较宽，明显遮挡视神经的视野。同时，为了避免损伤与脑膜鞘相关的眼动脉(图5)，需使用镊子轻轻旋转脑膜鞘，分离并解剖视神经周围的硬脑膜，并观察脑膜鞘的血管分布模式。此外，应识别出无血管区域，以便沿脑膜鞘做纵向切口。操作时还需保持与眼球后部的较小工作距离，以避开与眼动脉紧密相连的硬脑膜部分。正常情况下，视网膜呈透明状，血管结构清晰可辨。若视网膜血供受损，则视网膜发生退变，呈现乳白色絮状外观。眼内的玻璃体腔和晶状体通常也会变得浑浊，并随时间推移眼球体积缩小。本研究中，术前与术后眼底图像证实，在执行上述步骤后，模型眼底血供未受损伤。
此外，该模型的多个步骤需要特别注意。使用尖端弯曲带齿镊子或其他手术器械暴露视神经时，操作者应避免施加过大的力量，以免损伤视神经、眼球或眼动脉，导致原发性损伤和视网膜缺血。同时，应避免损伤眼球周围的血管，以防持续出血，从而导致建模失败。本实验所用的视神经夹伤仪器（SSAI）需精细操作。当视神经置于仪器的凹槽内时，应确保视神经与凹槽表面紧密贴合，以保证每只动物模型之间具有良好的一致性和可重复性。经过练习，在完成初始切口后，每只眼睛的完整手术过程可在15至20分钟内完成。
Wang 等19 报道了一种类似的不完全视神经横断动物模型，该模型使用视神经定量截断器建立。手术步骤包括：1）切开外眦，牵拉并固定上眼睑；2）暴露视神经，并使用截断器横断视神经的上部；3）缝合结膜和皮肤。尽管手术过程相对简单，但在操作中仍遇到以下问题：虽然外眦切口可提供一定的操作空间，但为了暴露球后视神经鞘膜，尤其是当术者希望暴露更长段球后视神经鞘膜以利于进一步分离时，不可避免地需要持续牵拉眼球，牵拉力度较大，可能导致眼球和视神经的直接牵拉性损伤。此外，未特别注意可能与视神经鞘膜一同被切断的血管，血管损伤可能导致模型建立失败。本文所述继发性损伤模型的主要改进在于：采用一种新的手术入路，从眼球眶外侧壁直接进入被眶肌锥包围的球后视神经区域，避免了在向下或向鼻侧牵拉眼球时对眼球和视神经造成的原发性损伤。这种新的手术入路在建模过程中扩大了手术操作空间，并可在视神经部分横断前，更容易地分离与眼动脉密切关联的脑膜鞘。视神经的部分横断操作采用一种自行设计的手术器械完成，该器械成本低且可重复使用，有效降低了建模的整体成本。大鼠的眶部结构与其他哺乳动物不同，其眶腔最接近外眦，且无骨性结构，仅由肌肉覆盖。该手术入路可在不破坏眶骨及骨膜的情况下到达眼球后部。通过严格的术前消毒和术后抗生素预防，显著减少了感染、炎症和水肿的发生。
自研手术辅助器械
利用自行设计的手术辅助器械建立了部分视神经横断的大鼠模型，该器械的主要特点如下：能够辅助对暴露于槽状边缘的部分视神经进行定量性部分横断，同时确保不同动物之间横断程度的一致性。我们通过SSAI对模型制备的可重复性进行了测试与验证，变异系数最大值为1.85%，平均值为0.67%±0.44%。20 这些结果表明，SSAI可用于建立部分视神经横断模型，具有良好的可重复性和均一性。
沟槽表面的宽度以及沟槽内表面半圆形结构的设计可对视神经产生更稳定的作用，使沟槽表面与视神经贴合更紧密，同时减少实验误差和不良反应。沟槽边缘可在手术过程中更好地保护沟槽内的视神经，无论切割刀具的锋利程度如何，均不会损伤沟槽内的视神经。沟槽边缘的另一个优势在于可预防视神经横断过程中的挤压损伤。
适用于在深部狭窄空间内操作。尽管新的手术入路已有所拓展，但术区通路仍然较深，此时可利用手持杆部及关节段将带槽头端轻松置于视神经鞘下方，以进行后续操作。使用该器械进行手术时，可选用多种型号的切割器进行横断操作。 例如 26 G针头尖端。也可选择蓝宝石外科探针刀，以避免剪刀造成的挫伤和挤压伤。可通过制作不同垂直深度的沟槽表面，实现不同程度的视神经切断。
与王氏截肢器相比 等 SSAI 的结构更为简单。此外，使用 SSAI 进行切割操作更加方便，动物模型的一致性和可重复性也得到改善。最后，适用于 SSAI 切割操作的工具范围也更广。综上所述，SSAI 能够对神经进行定量且均一的切口，可作为建立用于评估视神经横断的大鼠模型的有效工具。
大鼠部分视神经横断模型的特征
部分视神经横断模型可用于评估视网膜神经节细胞（RGCs）中的继发性变性。该模型的潜在优势在于能够准确地在原位区分视神经和视网膜中的原发性与继发性变性。in situ。在背侧视神经部分横断（约1/3至1/2）后，视神经的中央和腹侧区域对继发性损伤更为敏感（图6）。在视网膜中，RGCs原发性和继发性损伤的区域定位应依据部分横断后与视网膜RGC相对应的视神经拓扑结构。如果将大鼠整个视网膜分为背侧（上方）和腹侧（下方）两部分，则这两部分均存在继发性和原发性损伤。然而，根据视网膜上RGC与视神经轴突之间的对应关系，腹侧视网膜中RGC的死亡主要应归因于继发性损伤（图3）。12，22，23 该模型的优点包括：操作仪器简单、易于操作且具有标准化的操作流程；不影响眼动脉血管；具有良好的可重复性和稳定性。该技术可能通过这一节省空间的手术途径，将短干扰RNA（siRNAs）、质粒和病毒载体应用于部分视神经残端，从而实现对RGC的转染；此外，还可将试剂放置于部分视神经残端，用于RGC的选择性治疗或标记。
总体而言，在该动物模型中，部分视神经横断术后，视网膜神经节细胞（RGC）的原发性和继发性损伤共存，并在视网膜上表现出两种损伤类型的清晰分界。尽管视神经轴突与视网膜上RGC位置之间的关联仍需进一步研究以实现更精确的区分，但这种节省空间的手术方法拓展了该模型的应用范围，使研究人员能够以新的方式探索RGC继发性损伤的机制。

继发性变性在中枢神经系统（CNS）遭受创伤性损伤以及急性或慢性神经退行性疾病后较为常见。1,2,3,4,5 神经元和胶质细胞因原发性病理事件而早期死亡被称为原发性变性，而继发性变性则指那些未受或仅部分受到原发性损伤影响的神经元和胶质细胞的死亡。在青光眼中，视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性也被认为会发生。6 Yoles et al.7 证实，在视神经损伤模型中存在RGCs的继发性损伤。他们发现，尽管某些神经元的轴突在急性损伤后未直接受损，但这些神经元最终仍会退化，原因是损伤区域周围产生的退化性微环境所致。这种继发性变性以渐进方式影响神经元，其程度与所受损伤的严重性相关。迄今为止，青光眼中RGC损伤的机制仍不明确，尤其是与继发性损伤相关的机制，这导致临床治疗手段不足。8,9,10 因此，有必要深入探究青光眼发展过程中RGC继发性变性的潜在机制。11 建立可用于定量评估RGC继发性变性的范围、分布及机制的动物模型，正日益受到研究RGC继发性损伤的科学家们的关注。
为阐明这一问题，Levkovitch-Verbin 等12 建立了大鼠PONT模型，用于评估轴突损伤所诱导的视网膜神经节细胞（RGCs）变性与死亡。该模型被认为是一种研究继发性变性机制及筛选潜在神经保护剂的良好工具。建立这种继发性损伤模型所使用的仪器是一种带有刻度的金刚石刀，通过旋钮调节切断深度，实现视神经的定量横断。手术路径可从眼球上方或颞侧结膜进路。在手术过程中，视网膜和视神经可能受到镊子施加的机械力影响，从而导致原发性损伤。更重要的是，由于暴露的视神经空间有限，切开前难以分离脑膜鞘膜。因此，在部分视神经横断过程中可能损伤眼动脉血管，导致视网膜缺血，进而造成模型构建失败。此外，金刚石刀价格昂贵，且每次使用后刀尖锐度会下降，这可能影响建模的深度和效果。
本研究中描述的视网膜神经节细胞继发性变性模型是通过一种从眼球眶侧壁进入的新手术方法建立的。这种新型手术入路可直接到达被眶肌锥包围的球后视神经，避免了在向下或向眼球鼻侧外侧牵拉时对眼球和视神经造成的原发性损伤。该方法还增加了建模过程中的手术操作空间，并可在部分横断视神经之前实现脑膜鞘的分离。需要注意的是，若不慎累及或损伤眼动脉血管，可能导致模型建立失败。此外，该模型允许对转染细胞、药物和试剂在部分横断视神经残端的作用进行后续评估。自行设计的手术器械成本低廉且可重复使用，从而降低了建模成本。通过该方法建立的视网膜神经节细胞继发性损伤模型具有良好的可重复性和稳定性。

<table><tbody><tr><td>动物麻醉呼吸机系统</td><td>MIDMARK</td><td>Matrx VMR</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>R510-22</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Leica AG, Heerbrugg, Switzerland</td><td>M620 F20</td><td></td></tr><tr><td>妥布霉素眼膏</td><td>Alcon</td><td>H20110312</td><td></td></tr><tr><td>氟金</td><td>Biotium</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>虹膜剪</td><td>66vision Co.</td><td>54026</td><td></td></tr><tr><td>Vannas弹簧剪</td><td>66vision Co.</td><td>54137B</td><td></td></tr><tr><td>尖齿镊/0.12 mm齿状镊&amp;nbsp;</td><td>66vision Co.</td><td>53329A</td><td></td></tr><tr><td>尖头弯镊</td><td>66vision Co.</td><td>53324A</td><td></td></tr><tr><td>蓝宝石手术探针</td><td>66vision Co.</td><td>50205TA</td><td></td></tr><tr><td>26G针头</td><td>山东威高集团医用高分子制品股份有限公司</td><td>3151474</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L Hamilton注射器</td><td>Hamilton Co.</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>5-0不可吸收缝线</td><td>Johnson &amp;amp; Johnson International Co.</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>氯己定</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>282227</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>68026</td><td></td></tr><tr><td>视网膜成像系统</td><td>OptoProbe Ltd.</td><td>OPTO-RIS</td><td></td></tr><tr><td>RetCamII广角成像系统</td><td>Clarity Medical Systems,Inc.</td><td>RetCamII</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>DM6000</td><td></td></tr></tbody></table>

大鼠部分视神经横断模型：一种评估视网膜神经节细胞继发性变性的新型手术方法建立

Partial Optic Nerve Transection in Rats: A Model Established with a New Operative Approach to Assess Secondary Degeneration of Retinal Ganglion Cells

既往研究表明，视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性在青光眼中较为常见。部分视神经横断被认为是一种有效且可重复的模型。与其他常用于评估继发性变性的视神经损伤模型相比， 例如 完全视神经横断和视神经 crush 模型相比，部分视神经横断模型更优，因其可区分原发性与继发性退变 原位因此，该方法是评估继发性变性的理想工具。本研究描述了一种新的手术方法，通过直接经眼球眶侧壁进入球后视神经区域，实现对视神经的部分横断。此外，我们还介绍了一种新设计的低成本手术器械，以辅助完成横断操作。代表性结果表明，该新方法和器械能够清晰区分原发性和继发性损伤区域的边界，通过提供充足的手术操作空间，确保了模型的高效性和稳定性。这使得在横断前更容易将脑膜鞘和眼动脉血管从视神经上分离。另一优势在于，这种节省空间的手术入路提高了研究者向部分横断后的视神经残端递送药物、载体或特异性视网膜神经节细胞（RGC）示踪剂的能力，从而以一种全新的方式探索RGC继发性损伤的潜在机制。

验证采用SSAI新手术方法建立继发性损伤模型的成功性 (图 2A)，视网膜神经节细胞（RGCs）在模型建立后立即进行逆行标记。该操作的目的是通过注射神经示踪染料（3%荧光染料（例如，将Fluorogold溶于无菌磷酸盐缓冲液中注入上丘 (图2B)该方法可实现对活体视网膜神经节细胞（RGCs）的可重复标记，且变异程度较小。14,15,16,17,18 染料将被视网膜中的RGCs逆行摄取，并作为存活RGCs的标记物，这些RGCs的轴突在右眼未被横断。与此同时，右眼视神经轴突部分横断所对应的RGCs则无法被示踪染料标记。 (图2C)作为对照眼，未手术的左眼，其视网膜沿视神经的视网膜神经节细胞通过上丘逆行标记荧光金染料，均被标记。 (图 2D).
视神经部分横断并逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）7天后，取视网膜组织，固定、展平并封片。在视网膜的特定区域，使用荧光显微镜对标记的RGCs进行成像。荧光标记的RGCs在视神经部分横断前后结果如图3所示。仅右侧视网膜中对应于未横断视神经区域的RGCs被荧光金标记，且可清晰观察到标记与未标记RGCs之间的界限（图3A，图3B），表明视神经实现了部分横断。作为对照眼，左眼视网膜的所有RGCs均显示荧光信号（图3C，图3D）。
为了评估视神经乳头周围血管以及为全视网膜供血的眼动脉在手术过程中是否受到损伤或影响，对手术前后右眼眼底进行了成像。图像显示了右眼（手术眼）在术前及术后1小时的血液供应情况。动脉血流充足，未观察到静脉阻塞现象。这些结果表明，手术过程中未对血液供应系统造成损伤(图4A，图4B)。因此，视网膜神经节细胞的继发性变性模型成功建立。 
<img alt="带凹槽头部的手持杆，用于实验测量设置的标注尺寸示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：自研手术辅助器械SSAI的照片。 (A) 手术器械的全景图，包含两个主要部分：手持杆和带凹槽的头部。两者之间为一段长度为50 mm的连接部。手持杆的长度为100 mm，直径为9 mm。 (B) SSAI凹槽的结构特征。带凹槽头部的凹面呈半圆形，可容纳视神经并使其在横断操作中保持稳定。凹面的垂直深度为200 µm，宽度为500 µm，长度为1,000 µm。带凹槽头部边缘的宽度为300 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视神经横断示意图，显示脑内视觉处理通路及视网膜投射。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：使用自研手术辅助器械（SSAI）对右侧视神经进行部分横断后，视网膜上视网膜神经节细胞（RGC）标记的示意图，以及通过荧光染料逆行标记上丘。 (A) 使用自研手术辅助器械（SSAI）对大鼠右侧视神经进行部分横断的手术视野。 (B) 建模后，通过向脑内上丘注射神经示踪染料（黄色，3% 荧光染料溶于无菌磷酸盐缓冲液）逆行标记RGC。由于RGC的轴突终止于上丘，示踪染料被RGC逆行摄取，从而标记存活细胞。图中横截面表示视神经的横切面。OD，手术眼；OS，未手术的对照眼。在 (C) 中，仅有对应于未横断视神经部分的RGC被荧光染料标记。蓝色代表未分离的腹侧视神经及其在视网膜上对应的RGC；红色代表部分横断的背侧视神经及其在视网膜上对应的RGC。 (D) 未接受手术的左眼（对照眼）视网膜RGC全部被染料标记，背侧和腹侧视神经也均被染料标记。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜定位图与显微镜图像，显示眼球切片中视神经的分布情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：建立部分视神经横断模型并逆行标记上丘后7天，荧光染料标记的视网膜神经节细胞的全视网膜表层荧光显微图像。同时展示相应视网膜上Fluorogold染色的RGC区域的示意图。（A） 和 (C) 分别表示用荧光染料标记后右眼（手术眼）和左眼（对照眼）视网膜中RGCs的示意图。黄色表示荧光金染料标记的区域。视网膜分为背侧、腹侧和中央部分。 （B） 和 (D) 显示在荧光显微镜下获得的整个视网膜表层荧光显微图像；黄色代表用荧光染料标记的视网膜神经节细胞（RGCs）区域。图中所示手术眼（右眼） B未标记区域代表对应于视神经的视网膜神经节细胞（RGCs）区域，该区域部分被横断，主要位于视网膜的背侧。荧光金染料标记的区域代表对应于未被横断视神经的RGCs区域，主要集中于视网膜的中央和腹侧。未标记与标记的RGCs区域之间的边界清晰。RGC胞体的原发性变性将局限于视网膜背侧，而中央和腹侧视网膜中所有RGC胞体的丢失均可归因于继发性变性。 （D） 左眼视网膜全层荧光显微照片，经荧光染料标记RGCs后获得。未进行手术操作的左眼对照眼中，RGCs被荧光染料完全标记。比例尺 = 500 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="视网膜结构比较、视盘分析、眼底图像A和B、眼科研究" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：通过眼底相机获取的大鼠右眼术前与术后眼底图像。 (A) 大鼠右眼手术前的眼底图像，显示眼底血供良好，动脉充盈，无静脉回流受阻或阻塞现象，表明视网膜血液供应系统正常。 (B) 右眼术后1小时的眼底图像。与术前眼底图像相比，视网膜血供未见明显变化，表明建模过程中眼球的血液供应系统未受到影响。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清大图。</a>
<img alt="显示视神经、外直肌残端和眼动脉的眼部解剖显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：通过手术入路观察到的眶后段视神经及位于脑膜鞘上的眼动脉照片。 在完全切除目标长度的视神经后，伴随视神经脑膜鞘走行的眼动脉（箭头所示）被暴露出来，并与视神经平行。比例尺 = 500 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="视神经横断面示意图，显示变性区域；标示用于神经研究的手术器械。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56272/56272fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：视神经中初级和继发性变性部位的示意图。 使用自行设计的手术辅助器械（箭头所示）对视神经进行部分切开。直接损伤部位的轴突（横断面中视神经背侧切开区域，灰色部分）发生初级变性，而间接损伤部位的轴突（横断面中视神经中央和腹侧区域，黄色部分）发生继发性变性。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56272/56272fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性在青光眼中较为常见。本研究描述了一种部分视神经横断的创新手术方法。该节省空间的手术方法拓展了模型的应用范围，使得以一种新的方式探索RGCs中的继发性损伤机制成为可能。

先前的研究表明，视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性在青光眼中较为常见。部分视神经横断……

视网膜神经节细胞的继发性变性主要发生在青光眼中。本文介绍了一种部分视神经横断的创新手术操作模型。这种节省空间的手术方法提高了研究者在部分横断视神经残端上给予药物、载体或视网膜神经节细胞特异性示踪剂的能力，从而为研究视网膜神经节细胞的继发性损伤机制提供了新途径。青光眼是一种慢性神经退行性疾病，其进行性神经病理变化可持续较长时间。眼压升高是青光眼明确的致病因素之一，降低眼压已被证实是目前唯一确认有效的青光眼治疗方法。然而，部分患者即使在眼压得到控制后，病情仍会进一步恶化。因此，人们认为视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性发生在青光眼中。然而，与原发性或继发性变性相关的具体机制仍不明确。RGCs继发性变性机制的研究将为神经创伤及中枢神经系统（CNS）神经退行性疾病的治疗提供指导。为辅助视神经的部分定量横断，我们介绍一种新设计的低成本手术器械。该器械由两部分组成：一个手持杆和一个带凹槽的头部。该凹槽头部呈半圆形，垂直深度为200 micrometers，其凹槽表面可使视神经腹侧部分嵌入其中并保持稳定，便于进行横断操作。将视神经置于仪器的凹槽内。仪器的凹槽表面可固定视神经，便于进行横切。随后使用合适的针尖或刀尖垂直横切视神经。请注意，仅切断视神经的背侧部分，因为腹侧部分受到器械的保护。分离并解离视神经周围的硬脑膜，注意不要切断与脑膜鞘相关的眼动脉。原发性损伤作用于对应于被定量横断的视神经轴突的视网膜神经节细胞（RGCs），即背侧部分；而继发性损伤则作用于对应于未被横断的视神经轴突的视网膜神经节细胞（RGCs），即中央和腹侧部分，且不造成直接损伤。使用兽用异氟烷麻醉机系统对大鼠进行麻醉。手术期间监测麻醉状态，并根据需要调整异氟烷剂量。持续评估呼吸深度和频率，并每五分钟进行一次足趾夹捏测试，以确保无深部疼痛反应。将大鼠右侧朝上置于手术台上，头部朝向手术操作方向。调整右侧眼眶至手术视野中心位置。随后，使用0.5%氯己定和75%乙醇，从右侧眼眶外眦沿至外耳道，反复多次清洁切口区域。使用虹膜剪去除从外眦至外耳道之间的毛发。使用虹膜剪沿外眦至外耳道做皮肤切口，长度为0.5至1厘米。然后用0.12毫米齿状镊夹住筋膜并向上牵拉，形成三角形楔形组织。将Vannas弹簧剪的下刃插入切口区域，沿与剪刀刃相同的方向剪开筋膜。特别是在外侧眶缘处剪开皮下筋膜时，应使用尖齿镊垂直向上提起筋膜表面的皮下筋膜，再用Vannas弹簧剪剪开筋膜，以避免损伤外侧眶缘处的眶静脉，防止因过度出血导致模型失败。随后用虹膜剪剪开筋膜，暴露眶静脉。使用钝性分离法切开切口两侧。该操作的优点在于，可避免直接切断血管时发生出血。随后使用虹膜剪沿切口线剪开右侧外眦，以充分暴露手术入路，并为后续眶肌的钝性分离提供清晰的视野。继续钳夹眶隔下眼眶肌的筋膜层，沿皮肤和筋膜切口方向垂直进行钝性分离。随后逐步向两侧分离，直至达到眶深部，显露眶脂肪组织。该操作可充分暴露眶腔深部区域，扩大手术视野，便于无阻碍地接近视神经上方的组织。在上述操作过程中，若发生出血，应使用无菌外科棉签或棉签施加压力止血。暴露眶内脂肪组织后，将大鼠头部方向从朝向术者垂直位置转向术者右侧。剪除覆盖在视神经周围眼肌锥体上的眶内脂肪组织。此操作可确保暴露适当的手术入路。请注意将切除的脂肪组织体积控制在合理范围内，以避免持续出血。切除脂肪组织后，外直肌即被暴露。用镊子将外直肌向外侧夹住，然后用Vannas弹簧剪将其剪断。该操作的目的是更好地暴露视神经，因为外直肌较宽，明显遮挡视神经的视野。若外直肌下方仍有脂肪组织，使用0.12毫米齿状镊提起覆盖在视神经上的脂肪组织，并用Vannas弹簧剪将其剪除。此时可见视神经周围的组织鞘。沿眶内视神经方向继续分离组织鞘，直至完全暴露视神经。使用手术棉签清除组织去除过程中产生的少量血液，以保持术区清洁。现在视神经应已可见。为暴露神经，需在不损伤眼动脉的前提下，去除包绕神经的脑膜鞘。轻轻旋转脑膜鞘，借助手术显微镜的高倍放大，观察硬脑膜的血管分布模式。寻找无血管区域，沿该处硬脑膜做一纵向切口。使用针尖或刀尖，沿视神经走行方向平行撕开鞘膜，操作需谨慎，避免横向切割损伤血管结构。最终仅保留覆盖于神经表面的蛛网膜。它非常薄且透明。与前一步骤类似，用针尖或刀尖沿视神经走向，轻轻撕开蛛网膜。将视神经轻柔小心地置于器械的凹槽内，使背侧视神经略高于凹槽前端边缘。然后用针尖或刀尖在沟头平台边缘上方横断视神经背侧，以完成部分视神经横断。将器械稍深入，沿视神经垂直方向移动，以松解视神经。然后轻柔取出器械的沟头部分。尽量避免刮擦眼外肌或其他组织，以防造成额外损伤。随后可观察到部分视神经横断后的残端。将外直肌、筋膜及眼部周围其他组织复位至原始位置。然后依次缝合眼眶的肌肉层和皮肤层。缝合后在伤口处涂抹抗生素软膏以预防感染。在大鼠复苏过程中，使用加热垫进行保温，或在笼内覆盖干燥的垫料。用毯子覆盖以保持温暖。确保大鼠在恢复过程中呼吸道通畅。术后动物单独饲养并密切观察。为了验证使用自行设计的手术辅助器械通过新的手术方法建立继发性损伤模型的成功情况，在模型建立后立即对视网膜神经节细胞（RGCs）进行逆行标记。该操作的目的是通过向上丘注射神经示踪染料，实现对RGCs的逆行标记。该染料将被视网膜中的RGCs逆行摄取，从而标记右眼中轴突未被切断的存活RGCs。尽管在右眼部分横断视神经轴突所对应的视网膜神经节细胞（RGCs）无法用氟金（Fluoro-Gold）进行标记，但作为对照眼的左眼未经任何手术操作，其视网膜上沿视神经走行的RGCs均通过上丘逆行标记上了荧光金染料。结果显示了部分视神经横断前后荧光标记RGCs的情况。仅有右眼视网膜中对应于未横断视神经部分的RGCs被荧光金标记，未标记与已标记RGCs之间的清晰边界得以显现，从而证实了视神经的部分横断。作为对照眼，左眼视网膜的所有视网膜神经节细胞（RGCs）均用荧光金进行标记。这些图像显示了右眼在手术前后血供情况的观察结果。手术后，动脉仍充满血液，未观察到静脉阻塞现象。这表明手术过程中未对血液供应系统造成损伤，视网膜神经节细胞的继发性变性模型已成功建立。潜在的视神经横断模型是一种可用于研究继发性变性机制及筛选抗继发性变性神经保护药物的可行动物模型。该模型的优势在于能够准确地在位置上区分视神经和视网膜中的原发性与继发性变性。我们设计的仪器主要优点在于可重复性更高且操作更简便。经过练习，一旦完成初始切口，每只眼睛的完整手术步骤均可在10至15分钟内完成。

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