大鼠部分视神经横断模型：一种评估视网膜神经节细胞继发性变性的新型手术方法建立

视网膜神经节细胞的继发性变性主要发生在青光眼中。本文介绍了一种部分视神经横断的创新手术操作模型。这种节省空间的手术方法提高了研究者在部分横断视神经残端对视网膜神经节细胞施用药物、载体或选择性示踪剂的能力，使研究人员能够以一种新的方式研究视网膜神经节细胞的继发性损伤机制。

青光眼是一种慢性神经退行性疾病，其进行性神经病理变化可持续较长时间。眼压升高是青光眼的一个明确病因，降低眼压已被证实是目前唯一有效的青光眼治疗方法。然而，部分患者即使在眼压得到控制后，病情仍会进一步恶化。

因此，视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性变性被认为发生在青光眼中。然而，与原发性或继发性变性相关的具体机制仍不明确。RGCs继发性变性机制的研究将为神经创伤及中枢神经系统神经退行性疾病的治疗提供指导。

为了辅助视神经的部分定量横断，我们介绍一种新设计的低成本手术器械。该器械由两部分组成：一个手持杆和一个带凹槽的头部。该带凹槽的头部呈半圆形，垂直深度为200 µm，其凹槽表面可使视神经腹侧部分嵌入其中，从而在横断过程中保持稳定。

将视神经置于器械的凹槽中。器械的凹槽表面可固定视神经，便于进行横切。然后使用合适的针尖或刀尖垂直横切视神经。

请注意，仅切断视神经的背侧部分，因为腹侧部分受到器械的保护。分离并解离视神经周围的硬脑膜，注意不要损伤与脑膜鞘相关的眼动脉。原发性损伤发生在与定量横断的视神经轴突相对应的视网膜神经节细胞（RGCs）中，即背侧部分；而继发性损伤则发生在与未横断的视神经轴突相对应的视网膜神经节细胞中，即中央和腹侧部分，且无直接损伤。

使用兽用异氟烷麻醉机系统对大鼠进行麻醉。手术期间监测麻醉状态，并根据情况调整异氟烷剂量。持续评估呼吸深度和频率，并每五分钟进行一次足趾夹捏测试，以确保深部疼痛反应消失。

将大鼠右侧朝上放置于手术台上，头部朝向手术操作方向。调整右侧眼眶至手术视野的中心位置。随后使用0.5%氯己定和75%乙醇，从右侧眼眶皮肤的外眦向外耳道口方向反复清洁切口区域数次。

使用虹膜剪从外眦至外耳道去除之间的毛发。使用虹膜剪沿外眦至外耳道做皮肤切口，长度为0.5至1厘米。然后用带齿镊（0.12毫米齿宽）夹住筋膜并向上牵拉，形成一个三角形楔形组织。

将Vannas弹簧剪的下刃插入切口区域，沿与剪刀刃相同的方向剪开筋膜。特别是在外侧眶缘处剪开皮下筋膜时，应使用尖齿镊垂直向上提起筋膜表面的皮下筋膜，再用Vannas弹簧剪剪开筋膜，以避免损伤外眦处的眶静脉，防止因出血过多导致模型制备失败。随后使用虹膜剪继续剪开筋膜，暴露眶静脉。

采用钝性分离法切开切口两侧。该操作的优势在于，可避免直接切断血管时发生出血。随后使用虹膜剪沿切口线剪开右侧外眦，以充分暴露手术入路，并为后续眼眶肌群的钝性分离提供清晰的视野。

继续夹住眶下筋膜肌的肌束，沿皮肤和筋膜切口的垂直方向进行钝性分离。然后逐渐向两侧分离，直至达到眶深部，直至出现眶脂肪组织。该操作将暴露眶腔更深层的区域，提供更大的手术视野，便于无阻碍地接触视神经上方的组织。

上述操作过程中，若发生出血，应使用无菌外科棉签或棉签压迫止血。暴露眶内脂肪组织后，将大鼠头部方向从朝向术者垂直位置转向术者右侧。剪除视神经周围眶肌锥体表面覆盖的眶内脂肪组织。

此操作可确保暴露适当的手术入路。请注意将切除的脂肪组织体积控制在合理范围内，以避免持续出血。切除脂肪组织后，外直肌即被暴露。

将外直肌向外侧夹紧，然后用Vannas弹簧剪将其剪断。该操作的目的是更好地暴露视神经，因为外直肌较宽，明显遮挡视神经的视野。如果外直肌下方仍有脂肪组织，用0.12毫米齿状镊夹起覆盖在视神经上方的脂肪组织，并用Vannas弹簧剪将其剪除。

然后可见视神经周围的组织鞘。沿视神经方向继续向眶内深处分离组织鞘，直至完全暴露视神经。使用手术棉签清除组织去除过程中产生的少量血液，以保持术区清洁。

此时视神经应已可见。为暴露神经，需在不损伤眼动脉的前提下，去除包绕神经的脑膜鞘。可轻轻旋转鞘膜，并借助手术显微镜更高倍数的放大，仔细观察硬脑膜的血管分布模式。

寻找一个无血管区域，并在硬脑膜上做一纵行切口。使用针尖或刀尖小心地沿视神经走行方向平行撕开鞘膜，避免横向切割损伤血管。此时仅剩蛛网膜覆盖在神经表面。

它非常薄且透明。与上一步类似，用针尖或刀尖轻轻撕开蛛网膜，方向与视神经平行。将视神经轻柔而小心地置于器械的凹槽内，使背侧的视神经略高于凹槽边缘。

然后用针尖或刀尖在沟头平台边缘上方横断视神经背侧，以完成部分视神经横断。将器械稍微深入，沿视神经垂直方向移动，以松解视神经。然后轻柔地取出器械的沟头部分。

尽量避免搔刮眼外肌或其他组织，以防造成额外损伤。随后可观察到部分视神经横断后的残端。将外直肌、筋膜及眼部周围其他组织复位至原来位置。

然后依次缝合眼眶的肌肉层和皮肤层。缝合后在伤口处涂抹抗生素软膏以预防感染。在大鼠复苏过程中，使用加热垫进行保温，或在笼内覆盖干燥的垫料。

用毯子覆盖以保持温暖。确保大鼠在恢复过程中呼吸道通畅。术后动物单独饲养并密切观察。

为了验证使用自行设计的手术辅助器械通过新手术方法建立继发性损伤模型的成功情况，在模型建立后立即对视网膜神经节细胞（RGCs）进行逆行标记。该操作的目的是通过向上丘注射神经示踪染料，实现对RGCs的逆行标记。染料将被视网膜中的RGCs逆行摄取，从而标记出右眼中轴突未被切断的存活RGCs。

尽管在右眼部分横断视神经轴突所对应的视网膜神经节细胞（RGCs）无法用Fluoro-Gold进行标记，但作为对照眼的左眼未接受任何手术操作，其视网膜上沿视神经走行的RGCs均通过上丘的逆行标记被荧光金染料成功标记。结果显示了部分视神经横断前后荧光标记RGCs的情况。仅有右眼视网膜中对应于未横断视神经部分的RGCs被荧光金标记，未标记与已标记RGCs之间的清晰边界得以显现，从而证实了视神经的部分横断。

作为对照眼，左眼视网膜的所有视网膜神经节细胞（RGCs）均用荧光金进行标记。这些图像显示了右眼在手术前后血供情况的观察结果。手术后，动脉仍充满血液，未观察到静脉阻塞现象。

这表明手术过程中未对血液供应系统造成损伤，视网膜神经节细胞的继发性退变模型已成功建立。潜在的视神经横断模型是一种可用于研究继发性退变机制以及筛选抗继发性退变神经保护药物的可行动物模型。

该模型的优势在于能够准确地在位置上区分视神经和视网膜中的原发性与继发性变性。我们设计的仪器主要优点是可重复性更高，操作更简便。经过练习，一旦完成初始切口，完整手术的各个步骤每只眼睛可在10至15分钟内完成。