大鼠部分视神经切断术: 建立一种新的手术方法评价视网膜神经节细胞二次变性的模型
2017年10月15日
视网膜神经节细胞 (视网膜) 继发性变性通常发生于青光眼。本研究介绍了一种创新的手术方式部分视神经横断。利用这种节省空间的操作方法扩展了模型的应用范围, 并允许在视网膜中探索二次损伤机制的新方法。
视网膜神经节细胞的继发性变性主要发生在青光眼中。本文说明了一种创新的部分视神经横断手术方法模型。这种节省空间的手术方法提高了研究者在部分横断视神经的残端上施用药物或载体或 RGC 选择性示踪剂的能力，并允许研究人员以新的方式研究 RGC 的继发性损伤机制。
青光眼是一种慢性神经退行性疾病，进行性神经病理学持续很长时间。高眼压症是青光眼的一个明显原因，降低高眼压症已被证明是青光眼治疗唯一被证实的有效疗法。但一些患者的情况会进一步恶化，即使在高眼压症得到控制之后。
因此，RGC 的继发性变性被认为发生在青光眼中。然而，与原发性或继发性变性具体相关的机制仍不清楚。RGCs 的继发性变性机制将指导神经创伤和 CES 神经退行性疾病的治疗。
为了帮助进行视神经的部分定量横断，我们提出了一种新设计的低成本手术器械。该乐器由两部分组成，一个手持式杆和一个带槽的头部。凹槽头是半圆形的，垂直深度为 200 微米，凹槽表面使腹侧视神经能够位于其中并稳定以进行横断。
将视神经放在器械的凹槽中。器械的凹槽表面使视神经能够稳定以进行横断。然后用合适的针尖或刀尖垂直横切视神经。
请注意，只有视神经的背侧部分被切断，因为腹侧部分受到器械的保护。分离和解离视神经周围的硬脑膜，确保不会切断与脑膜鞘相关的眼动脉。原发损伤是在对应于定量横断的视神经轴突、背侧的 RGC 中实现的，而继发损伤是在对应于未横断的视神经轴突、中央侧和腹侧的 RGC 中进行的，没有直接损伤。
使用兽用异氟醚蒸发器系统对大鼠进行麻醉。术中监测麻醉情况，并相应调整异氟醚剂量。不断评估呼吸的深度和频率，并每 5 分钟进行一次脚趾捏合评估，以确保没有深部疼痛。
将大鼠的右侧向上放在手术台上，头部朝向手术台。调整手术视野中心的右眼眶。然后用 0.5% 洗必泰和 75% 乙醇沿外眦到右眼眶皮肤的外声孔清洁切口区域数次。
使用虹膜剪刀去除外眦到外声孔之间的毛皮。使用虹膜剪刀，沿着外眦到外声孔做一个皮肤切口，长度为 0.5 至 1 厘米。然后捏住筋膜并向上拉，用 0.12 毫米的齿形镊子创建一个三角形楔子。
将 Vannas 弹簧剪刀的下刀片插入切口区域，并以与剪刀皮相同的剪切方向切开筋膜。特别是在切割外外眦的皮下筋膜时，用锋利的锯齿镊将筋膜表面的皮下筋膜垂直向上拉，并用 Vannas 弹簧剪刀切割筋膜，以避免损伤外眦处的眼眶静脉，导致出血过多导致模型失败。用虹膜剪刀剪断筋膜，露出眼眶静脉。
使用钝性解剖打开切口的两侧。这种手术的优点是可以直接切断血管时可以防止出血。然后用虹膜剪刀沿切口线将右侧外眦切开，以充分暴露手术入路并充分暴露视野，以便后续对眼眶肌进行钝性解剖。
继续夹住筋膜下眼眶肌的夹层，垂直向皮肤和筋膜切口方向钝化分离。然后沿两侧逐渐分离以达到眼眶深度，直到出现眼眶脂肪组织。该程序将打开眶腔的更深部分，提供更大的手术窗口，并允许畅通无阻地进入覆盖视神经的组织。
在上述程序中，如果发生出血，请使用无菌手术拭子或棉签施加压力。脂肪组织暴露在眼眶中后，将大鼠头部方向从垂直面向外科医生转变为面向外科医生的右侧。切除覆盖在视神经周围眼眶肌锥上的眼眶脂肪组织。
此作可以确保、暴露适当的手术方法。请注意，应将切除的脂肪组织体积保持在合理范围内，以避免持续出血。切割脂肪组织后，外直肌暴露出来。
向外夹住外直肌，然后用 Vannas 弹簧剪刀剪断。该程序的目的是为了更好地暴露视神经，因为外直肌要宽得多，显然会阻挡视神经的视线。如果外直肌下方仍有脂肪组织，请使用 0.12 毫米齿形镊子拉起覆盖视神经的脂肪，然后用 Vannas 弹簧剪刀切割。
然后可以看到视神经周围的组织鞘。继续沿眼眶深度的视神经方向分离组织鞘，直到视神经完全暴露。使用手术拭子清洁因去除组织而产生的少量血液，保持该区域清洁。
现在视神经应该是可见的。为了进入神经，在不损伤眼动脉的情况下去除围绕神经的脑膜鞘。轻轻旋转护套，以手术显微镜的更高放大倍率检查硬脑膜的血管模式。
寻找没有血管的区域，并允许在硬脑膜上进行纵向切割。用针尖或刀尖小心地平行于视神经方向撕裂鞘，以避免侧切伤脉管系统。唯一留下的覆盖神经的是蛛网膜。
它非常薄且透明。与上一步类似，用针尖或刀尖轻轻撕开蛛网膜，平行于视神经的方向。轻柔小心地将视神经放在器械的凹槽内，使视神经背侧略高于凹槽头的边缘。
然后用针尖或刀尖横切槽头平台边缘上方的视背神经，完成部分视神经横断。将仪器向视神经的垂直方向更深一点，以释放视神经。然后轻轻取出乐器的凹槽头。
尽量不要抓挠眼部肌肉或其他组织，以免造成额外损伤。然后可以观察到部分视神经横断的残端。将外直肌、筋膜和眼睛组织周围的其他组织恢复到原来的位置。
然后依次缝合眼眶的肌肉层和皮肤层。缝合后在伤口上涂抹抗生素软膏以防止感染。在大鼠复苏过程中，用加热垫准备隔热材料，或在笼子里盖上干垫。
用毯子盖上它们以保暖。在恢复过程中确保大鼠气道通畅。动物被独立饲养，并在手术后仔细监测。
为了验证使用自主设计的手术辅助器械以新的手术方法建立继发损伤模型的成功，在模型建立后立即对 RGCs 进行逆行标记。该程序的目的是通过将神经示踪染料注射到上丘中来逆行标记 RGC。染料将被视网膜中的 RGC 逆行吸收，并为右眼中具有未横断轴突的活体 RGC 提供标记。
虽然右眼部分横切的视神经轴突对应的 RGCs 不能用 Fluoro-Gold 标记，但作为对照眼，左眼无需任何手术，沿视网膜上视神经的 RGCs 都用荧光金染料从上丘逆行标记。显示了荧光标记的 RGCs 伴或不伴部分视神经横断的结果。仅用荧光金标记对应于视神经未横断部分的右视网膜中的 RGCs，并可视化未标记和标记的 RGCs 的清晰边界，这表明视神经部分横断。
作为对照眼，左眼视网膜的所有 RGCs 均用荧光金标记。这些图像显示，在手术前后观察了右眼的血液供应。手术后，动脉仍充满血液，未观察到静脉阻塞。
这表明手术过程中血液供应系统没有损伤。成功建立了 RGCs 的次级变性模型。潜在视神经横断模型是一种可用于研究继发性变性机制和筛选神经保护药物对抗继发性变性的动物模型。
该模型的结合是能够在视神经和视网膜中准确区分原发性和继发性变性。我们设计的仪器的主要优点是重现性更强，作更易。通过练习，一旦完成了初始切入，每只眼睛可以在 10 到 15 分钟内完成完整外科手术中的所有步骤。
概述
本研究提出了一种创新的部分视神经切断手术方法，旨在探索青光眼中视网膜神经节细胞（RGCs）的继发性退行性变。该方法增强了对RGCs继发性损伤机制的研究能力，同时提供了一种节省空间的操作模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 眼科学
- 神经退行性疾病
背景
- RGCs的继发性退行性变在青光眼中普遍存在。
- 眼压升高是青光眼的主要原因。
- 了解继发性退行性变机制对治疗至关重要。
- 目前的治疗方法主要集中在控制眼压。
研究目的
- 开发一种用于部分视神经切断的低成本手术器械。
- 促进RGCs的药物给药和示踪剂研究。
- 研究RGCs的继发性损伤机制。
所用方法
- 设计带有凹槽头部的手持手术器械。
- 在保护腹侧部分的同时部分切断视神经。
- 在手术过程中使用异氟烷进行麻醉。
- 详细的手术步骤，以暴露视神经并进行切断。
主要结果
- 新的手术方法允许对视神经进行精确切断。
- 促进了RGCs继发性退行性变的研究。
- 改善了药物输送和示踪剂应用的接入。
- 展示了推进青光眼研究的潜力。
结论
- 创新的手术模型增强了青光眼研究能力。
- 了解继发性退行性变机制可能会导致更好的治疗方法。
- 这种方法可以为神经外伤和神经退行性疾病的策略提供参考。
常见问题
Executive Industry Relevance
Partial optic nerve transection in rats provides a robust preclinical model to dissect primary versus secondary degeneration of retinal ganglion cells, a key challenge in neurodegenerative disease research. This model enables precise localization and mechanistic de-risking of secondary injury pathways relevant to glaucoma and related disorders. Its reproducibility and operational efficiency support translational continuity and portfolio triage for neuroprotective drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of secondary degeneration distinct from primary injury in retinal ganglion cells.
- Supports functional target validation for neuroprotective strategies in glaucoma and neurodegeneration.
- Facilitates predictive confidence in pathway-specific intervention points for secondary injury.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible in vivo system for evaluating candidate neuroprotective compounds targeting secondary degeneration.
- Allows for standardized administration of drugs, carriers, or tracers directly to the optic nerve stump.
- Enables quantitative assessment of RGC survival and injury boundaries for assay development.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms observed in glaucoma and chronic neurodegenerative conditions.
- Supports continuity from mechanistic discovery to preclinical validation of neuroprotective interventions.
- Reduces translational risk by modeling secondary injury processes in a controlled, quantifiable manner.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven testing of secondary degeneration mechanisms and candidate interventions.
- Discovery Biology: Dissects primary versus secondary injury, clarifying mechanistic pathways in RGC degeneration.
- Screening: Supports reproducible, quantitative evaluation of neuroprotective agents in a standardized animal model.
- Analytics: Provides clear readouts of RGC labeling and injury boundaries for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical efficacy studies in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, low-cost model adaptable for diverse neurodegeneration research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegeneration research.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and efficiency in preclinical model establishment.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for neuroprotective drug candidates targeting secondary injury.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutic programs addressing secondary degeneration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and animal model handling.
- Needs access to specialized surgical instruments and fluorescence-based RGC labeling infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across different rodent models but may require protocol optimization for other species.
- Potential limitations include surgical learning curve and need for precise anatomical dissection.
