在体内荧光亲脂膜染料对大鼠膝骨关节炎模型中人脂肪间充质干细胞的追踪

该协议描述了一种有效的方法来监测人脂肪来源的骨髓间充质干细胞 (haMSCs) 的细胞持久性和分布的远红色荧光标记的大鼠膝骨关节炎 (KOA) 模型通过关节内 (IA) 注射。

该程序的总体目标是使用体内荧光成像评估大鼠膝关节骨关节炎或 KOA 模型中人脂肪来源的间充质干细胞的细胞持久性和生物分布的功效。体内干细胞追踪可以帮助回答再生数学领域中关于 KOA 动物模型中间充质干细胞衍生的人类脂肪的刺激和分布的关键问题。使用 DiD 的主要优点是其大鼠转移发射光谱允许在活体动物中进行深层组织成像，而不会对染料标记的细胞产生细胞效应或功能损伤。

首先将一只麻醉的 250 至 300 克、8 至 12 周龄的雄性 Sprague Dawley 大鼠置于加热垫的左侧位置。用剃须刀彻底剃掉右膝盖，并用 10% 聚维酮碘溶液和 70% 乙醇对手术区域进行消毒。用手术垫覆盖非手术区域。

并用手术刀沿髌腱横向切开一个 2 厘米的切口，露出关节囊。接下来，使用手术刀横切内侧副韧带，将半月板反射到股骨，然后用镊子抓住内侧半月板。使用手术刀从胫骨附件处切开半月板最窄处。

为了获得可靠和可行的 KOA 起始，每只实验动物的半月板股骨侧应完全切开。然后，用 4-O 可观察缝合关节囊并监测大鼠直至完全恢复。手术后 8 周，将人脂肪来源的间充质细胞从 80% 汇合培养物中分离出来，其中含有 2 毫升胰蛋白酶加 EDTA，在 37 摄氏度下放置 3 分钟。

几分钟后，用 4 mL 完全培养基中和胰蛋白酶，并通过离心收集细胞。在 5 mL 无血清培养基中，以 1 倍/mL 10 至 6 个细胞的浓度重悬沉淀。并在 37 摄氏度下用 50 μL DiD 细胞标记溶液标记细胞 50 分钟。

在孵育结束时，通过离心收集细胞，并在每次洗涤 5 毫升 PBS 中洗涤两次。最后一次离心后，将细胞稀释至每 100 微升 PBS 浓度 10 至 6 个活细胞的 2.5 倍，并将细胞装入配备 26 号针头的 1 毫升注射器中。接下来，为第一只实验动物的关节炎膝关节剃毛，露出关节区域，并用 70% 乙醇对暴露的皮肤进行消毒。

将标记的细胞注射到髌韧带内侧、内侧股骨髁和内侧胫骨髁形成的三角形中心，打开成像软件。初始化体内生物发光成像系统，并将动物置于成像系统中央舞台内的仰卧位。关闭腔室门后，选中荧光框并选择合适的激发和发射荧光滤光片组。

将视野设置为 D，将像素弯曲设置为 8，将 F 制光圈设置为 2，将曝光时间设置为自动。获得图像后，让动物在热垫上恢复并监测，直到完全恢复。然后，在适当的图像分析软件中，选择用于测量荧光的辐射效率单位和用于分析的感兴趣区域，并量化来自每个图像的荧光信号。

在这个代表性实验中，在手术后 8 周通过 H&E 和番红 O/Fast Green 染色评估膝骨关节炎诱导的大鼠膝关节的连续切片。如在 H&E 染色切片中观察到的那样，关节炎膝关节的关节软骨厚度比未经手术的对侧关节更薄。此外，如番红蛋白 O/Fast Green 染色所示，关节炎关节中的蛋白多糖减少，原纤维化胶原蛋白增加，表明手术诱导的退行性膝骨关节炎表型的进展。

染色 1 小时后，DiD 标记的人脂肪来源的间充质细胞在体外呈圆形。24 小时后，培养的 DiD 标记的间充质细胞表现出长纺锤形，证实 DiD 不会改变细胞的贴壁能力。手术后 8 周对骨关节炎动物的膝盖进行成像显示，从注射后第 0 天到第 70 天存在 DiD 标记的细胞。

开发后，这项技术为干细胞治疗领域的研究人员铺平了道路，以确定安全可行的间充质干细胞注射治疗动物膝骨关节炎的最佳常规和剂量。看完这个视频，你应该对如何用 DiD 标记人间充质干细胞进行注射和在手术诱导的大鼠 KOA 模型中进行体内追踪有了很好的了解。