人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化 关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

本方法的总体目标是有效引导多能干细胞分化为视网膜色素上皮细胞，并形成均一的单层细胞。该方法有助于回答视网膜及眼科研究领域中的关键问题，例如视网膜的发育机制以及如何建立干细胞疾病模型。该技术的主要优势在于，相较于自发分化方法，其速度更快、效率更高。

该方法利用生长因子和小分子的组合，在14天内诱导干细胞分化为未成熟的视网膜色素上皮细胞（RPE），并在三个月后形成成熟且具有功能的RPE。本实验操作部分将由加州大学圣塔芭芭拉分校干细胞生物学与工程实验室副主任Cassidy Arnold演示。开始本实验前，需在无饲养层、无血清的条件下培养干细胞集落，使其融合度达到约80%后再进行传代。

然后按照生产商的建议，用基于细胞外基质的水凝胶包被12孔板，并在室温下放置1小时，或在4摄氏度下过夜使其凝固。随后，分装第0天所需的视网膜分化培养基和不含钙、镁的PBS，并在37摄氏度水浴中预热。接下来，将生长因子加入已预热的RDM中，并将EDTA恢复至室温。

如有必要，根据细胞形态，使用 P10 移液器吸头将拟传代用于分化的干细胞中所有已分化的克隆去除。克隆之间的成纤维样细胞以及克隆内部的不透明细胞均为需要去除的已分化细胞。手动去除这些细胞是本实验方案中最关键的步骤之一，因为从完全未分化的干细胞群体开始，将有助于实现更高效的富集。

将六孔板中的单个孔传代至12孔板的四个孔中：首先吸出干细胞的培养基，用两毫升预热的PBS洗涤一次。随后吸出PBS，并用一毫升EDTA溶液洗涤每个孔三次。然后轻轻倾斜培养板，吸出EDTA溶液。

切勿以任何方式晃动培养板，以免过早使细胞脱落。第三次洗涤后，再次加入一毫升EDTA，并将培养板置于生物安全柜中室温孵育三至五分钟。此孵育过程中勿扰动培养板。

随后，吸除EDTA，每孔加入1毫升RDM，并额外加入0.5毫升培养基。例如，用4.5毫升RDM洗涤六孔板中的一个孔，用于接种至12孔板的四个孔。然后，使用细胞刮轻轻刮下细胞。

用移液器在孔中上下吹打细胞5次，使细胞在RDM中充分重悬，操作需迅速完成，以防止细胞重新贴壁。将细胞悬液转移至锥形管中。轻柔吹打以解离较大的细胞团块，但不要吹打至完全单细胞悬液。

将细胞在移液管中均匀分散，并迅速完成此步骤，以防止细胞重新贴附到培养板上。如有需要，可使用光学显微镜观察细胞团块的大小。随后，将细胞接种至经细胞外基质（ECM）包被的12孔板中。

轻轻前后倾斜培养板，使细胞均匀分布于各孔中，然后将培养板置于37摄氏度、5%CO2的细胞培养箱中，直至下次更换培养基。在本步骤中，按照生产商的建议，用生长因子减少的ECM包被六孔板。在室温下静置1小时，或在4摄氏度下过夜使其凝固。

然后，分装所需量的 DPBS，以及每孔富集用 1 毫升 RDM，并在水浴中将其升温至 37 摄氏度。将类胰蛋白酶升至室温，并将所需量的 RPE 支持培养基预热至 37 摄氏度。之后，向 RSM 中加入抗微生物试剂和 ROCK 抑制剂，使终浓度分别为 0.5 倍抗微生物试剂和 10 微摩尔 ROCK 抑制剂。

在最初四到七天内使用该培养基以促进细胞贴壁。随后，吸去所有孔中的用过的培养基，并向每孔加入 1 mL 预热的不含生长因子的 RDM。如有必要，在体视显微镜下使用 P10 移液器吸头分离并刮除所有非 RPE 细胞。

解剖后，吸除RDM及所有细胞碎片，每孔加入一毫升预热的DPBS洗涤两次。随后，向12孔板的每孔中加入0.5毫升TDE，在37摄氏度孵育五分钟。之后，使用细胞刮轻轻将细胞从培养板上刮下。

轻轻吹打细胞酶悬液，上下吹打3至4次，以形成均匀的悬液。接着，用预热的不含ROCK抑制剂的RSM培养基按1:10的比例稀释细胞酶悬液。将细胞悬液在室温下以173g离心5分钟。

五分钟后，吸除细胞沉淀中的培养基，并用含有10 µM ROCK抑制剂的RSM重悬细胞。接着，使用孔径为40 µm的尼龙网细胞过滤器过滤细胞。使用血细胞计数板对细胞数量进行计数，并计算过滤后溶液中细胞的浓度。

随后，将细胞以每平方厘米1 × 10⁵个细胞的密度接种至生长因子减少、ECM包被的培养板中，每孔加入4 mL含10 µM ROCK抑制剂的RSM培养基。细胞接种48小时后，更换为含10 µM ROCK抑制剂的新鲜RSM培养基，并此后每3至4天更换一次培养基。在接种后4至7天停止向RSM培养基中添加ROCK抑制剂。

将细胞在 37 摄氏度和 5%CO2 条件下培养 28 至 35 天使其成熟，并每隔三到四天更换一次 RSM。图中显示的是即将进行传代以诱导分化的诱导性多能干细胞。这些干细胞体积较小，在克隆内紧密排列，克隆内及克隆间未见成纤维细胞等分化细胞或不透明的区域。

这是第2天的未成熟RPE细胞。此阶段的细胞应仍处于亚融合状态，并向细胞间的空隙延伸出突起。这些细胞是在第14天挑取以去除富集之前的细胞。

非RPE细胞呈现为斑块状或不透明的带状结构。圆形斑块包含具有成纤维细胞形态的细胞，而不透明的斑块被认为是神经视网膜。这些图像显示了第30天时，传代零代、一代和三代的RPE细胞。

每次传代时，细胞应达到汇合状态，并呈现视网膜色素上皮细胞形态的典型特征，包括相位明亮的边界和多边形形状。熟练掌握后，传代与富集技术可在1至2小时内完成，具体时间取决于细胞培养的规模。在此操作之后，可采用基因或蛋白定量以及功能检测等技术，以研究RPE分泌生长因子或吞噬外节段的能力。

Dave Buchholz 于 2013 年发表的论文以及 Lindsay Leach 于 2015 年发表的论文详细阐述了该方法的开发与优化过程。我们对实验流程中的每一步均提供了详尽而全面的演示，以便领域内的研究人员能够便捷地获取和使用。祝您实验顺利。