Name: CRISPR/Cas9 蛋白注射到沟鲶、鮰松毛虫、基因编辑的胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: 学习CRISPR/Cas9显微注射技术，用于沟鲶胚胎基因编辑研究。本方法通过靶向TICAM1和RBL免疫基因验证，为功能基因组学研究提供高效可靠的实验方案。

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本研究由美国农业部国家食品与农业研究所（USDA-NIFA）授予罗杰·科恩（Roger Cone）的项目编号2015-67015-23488资助。作者感谢罗纳德·费尔斯（Ronald Phelps）博士在视频中对亲鱼选择标准的描述。艾哈迈德·埃拉斯瓦德（Ahmed Elaswad）和卡里姆·哈利勒（Karim Khalil）谨感谢位于华盛顿特区的埃及文化与教育局对其博士研究的资助。

本实验在阿拉巴马州奥本大学E. W. Shell渔业研究中心鱼类遗传学研究组进行。实验所采用的所有实验方案均在实验开始前获得奥本大学机构动物照护与使用委员会（AU-IACUC）的批准。本实验所用仪器与试剂的清单见材料表。以下为斑点叉尾鮰单细胞胚胎的制备及显微注射步骤与操作流程，如图1所示。
1. 亲本选择与产卵
<ol>
	<li>从目标品系或遗传谱系中选择健康的斑点叉尾鮰亲鱼。斑点叉尾鮰的雄鱼和雌鱼应表现出良好的第二性征。</li>
	<li>选择头部宽大、肌肉发达且宽于身体其余部分、生殖乳突发育良好的雄鱼。体色深、因领地争斗造成的伤疤和伤口也是性成熟的表现。选择头部窄于身体其余部分、腹部柔软、可触诊且圆润饱满的雌鱼。为确保准确性并避免在初次操作时对鱼类造成应激，应在检查其产卵准备情况前2–3天停止喂食雌鱼。</li>
	<li>操作鱼类时应迅速但小心。为减少操作应激，所有需要接触雌鱼的操作均应在产卵袋（32 mm网眼）中进行。</li>
	<li>在注射激素诱导排卵前，测量雌鱼的体重。</li>
	<li>将装有雌鱼的产卵袋悬挂在流水式水族箱中，保持持续水流和充足的曝气。</li>
	<li>无菌操作下，使用14 G针头的植入器装载85 µg/kg的促黄体生成素释放激素类似物（LHRHa）植入剂。注射前用0.9%无菌生理盐水冲洗注射部位（背部肌肉）。以45°角插入植入器并释放植入物。拔出针头后，用浸有70%乙醇的棉球擦拭注射部位。</li>
	<li>将装有鱼的产卵袋放置于暂养池中，使鱼体完全浸没于水面以下15–20 cm处。充足的溶氧（高于5 ppm）和良好的水质对产出高质量卵子至关重要。</li>
	<li>根据水温利用度时（h）关系35预测排卵时间。度时反应时间 = 激素注射至排卵的时间（h）× 水温（°C）。例如，当度时反应时间为900–1,000时，在25 °C水温下，雌鱼预计在激素注射后36–40 h内产卵。通常在激素注射后约36 h进行首次卵子检查，之后每隔4 h检查一次。</li>
	<li>检查是否排卵时，轻轻将产卵袋提起至水面以上，观察是否有卵附着在产卵袋内壁。若观察到至少10粒卵，表明该雌鱼已开始排卵，可进行人工挤卵。</li>
</ol>
2. 精子制备
注意：精子可在预计排卵时间前几小时进行制备。
<ol>
	<li>通过击打头部使雄性动物安乐死，无需使用麻醉，因为麻醉可能对精子活力产生不利影响。</li>
	<li>将睾丸收集至小型称量盘中，去除周围组织，必要时用50 mL 0.9%生理盐水冲洗以去除血液。发育良好的睾丸呈白色，具有许多绒毛状突起（图2）。</li>
	<li>测定睾丸重量。</li>
	<li>为制备用于卵子受精的精子溶液，用镊子将睾丸转移至100 cm2 100 µm筛网中央。将筛网连同睾丸折叠，挤压睾丸使精子滤入50 mL收集管中。此操作可通过拇指在收集管边缘对筛网内的睾丸施加压力完成。用0.9%生理盐水冲洗筛网，将残留精子洗入收集管。生理盐水添加量最多可达每克睾丸10 mL。</li>
	<li>测定精子浓度，并检查其活力与存活率。 
	注意：可通过血细胞计数板对已知稀释倍数的精液样本进行计数，以确定精子浓度。或者，也可使用分光光度计测定精液的光密度来估算精子密度。该方法通过比较505 nm波长下的吸光度与先前建立的不同精子浓度吸光度对照图进行评估36。精子活力可在显微镜下观察，记录精子激活至运动停止的时间（称为运动持续时间）37。精子存活率可通过选择性染料（如台盼蓝）染色来判断，该染料仅对非活精子着色，而活精子则不着色。然而，若睾丸发育良好，则在进行显微注射操作时无需进行此项检测。</li>
	<li>将精子保存于步骤2.5中的0.9%生理盐水中，置于4 °C保存，并在制备后24小时内使用。</li>
</ol>
3. 卵子收集与受精
<ol>
	<li>在直径20 cm的洁净干燥产卵盘上涂抹一层极薄的植物起酥油。</li>
	<li>将雌鱼放入含有100 ppm缓冲三卡因甲磺酸盐（用碳酸氢钠调节，终溶液pH应为7.0）的麻醉液中，直至鱼完全麻醉38. 
	警告：三卡因甲烷磺酸盐若被吸入、摄入或经皮肤吸收，可能引起刺激。</li>
	<li>小心地将鱼从产卵袋中取出，浸入0.9%生理盐水中以洗去麻醉液。用干净的毛巾将鱼体彻底擦干，注意避免去除鱼体表面的黏液层。</li>
	<li>在泄殖腔周围（包括腹鳍部位）涂抹植物性起酥油，以防止人工挤卵时卵粒黏附。</li>
	<li>用手轻轻按压卵巢，将卵子挤入涂过油的产卵盘中。优质的卵子应能顺畅流出，呈金黄色，无明显结块或血块。图2）。在受精前避免卵子与水接触，因为水可能刺激卵膜孔关闭。</li>
	<li>为使卵子受精以进行显微注射，将200–300枚卵转移至涂有润滑剂的产卵盘中。可使用涂有润滑剂的塑料植物标签作为勺子，将卵转移至涂有润滑剂的产卵盘。向卵中加入1–2 mL精子溶液（来自步骤2.5），轻轻混匀。精子与卵子的比例应约为11,000个精子/卵。</li>
	<li>向卵子中加入淡水以激活精子和卵子。加水量以刚好浸没卵子为宜。轻轻摇晃卵子30秒。受精应在1–2分钟内完成。确保卵子呈单层排列进行受精非常重要。鲶鱼卵子彼此粘连，若胚胎多层堆积，将难以进行显微注射。</li>
	<li>向受精卵中加入更多淡水，使卵硬化10–15分钟。</li>
	<li>用湿毛巾覆盖装有剩余未受精卵的产卵盘，以防止干燥，并在数小时内分批进行受精。受精可分阶段进行，例如, 每30–60分钟可对一批200–300枚卵进行受精，以确保显微注射及对照未注射胚胎实验持续获得单细胞期胚胎。避免湿润的毛巾与卵接触，以防卵黏附于湿毛巾上而难以取下。本方案中，剥离后2–3小时内受精的卵能够高效地进行显微注射，其成功率与剥离后立即受精的卵相当。</li>
</ol>
4. 针头拉制与装载
<ol>
	<li>将一根外径为1.0 mm的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成两根针（图3）。将针存放于一个纸盒中，盒内放置一块带有若干切口的海绵。为避免针断裂，海绵的直径应小于针杆的长度。</li>
	<li>使用尖锐物体敲断针尖最细部分的一小段以打开针尖。或者，在显微镜下用镊子夹断针尖最细部分来打开针尖。</li>
	<li>通过将gRNA(s)与Cas9蛋白混合制备注射溶液。其他类型的RNA或蛋白质也可采用相同方法进行注射。在本实验方案中，gRNA的设计靶向斑点叉尾鮰的两个免疫相关基因：含Toll/白细胞介素1受体结构域的接头分子（TICAM1）基因和岩藻糖结合凝集素（RBL）基因，并按照Shah et al.的方法，使用高保真Taq DNA聚合酶进行制备32,39。gRNA的基因组靶序列分别为TICAM1基因的5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3'（图4），以及RBL基因第一外显子的5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3'，其中protospacer adjacent motif（PAM）序列已加下划线（图6）。
	<ol>
		<li>将引导RNA靶序列与斑点叉尾鮰基因组序列进行BLAST比对，选择无潜在脱靶位点的序列。</li>
		<li>加入酚红染料，使gRNA/Cas9蛋白混合液着色，染料体积不超过总体积的三分之一。</li>
		<li>用无核酸酶水调节gRNA/Cas9蛋白混合液的终浓度，使每个胚胎注射量为50 nL，其中含约2.5 ng gRNA和7.5 ng Cas9蛋白。使用前将混合液置于冰上孵育10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用微量加样器，将5–10 µL gRNA/Cas9混合液装入注射针中：将微量加样器插入针杆，缓慢推出液体的同时逐渐退出加样器尖端（图3）。注意避免在针内产生气泡。</li>
	<li>将针连接至微移液管固定器上，确保连接紧密，再将固定器安装到显微操作仪上，确保其可自由稳定移动。打开氮气瓶并调节压力调节阀，以提供显微注射所需的压力。 
	注意：注射体积受压力大小、针尖孔径及注射持续时间的影响。为确定注射体积，可将液体注射至血细胞计数板上的矿物油滴中进行测量。必要时可调整压力、注射时间或针尖直径，以增加或减少注射体积。多次向矿物油中注射，以确保每次注射体积一致。</li>
</ol>
5. 鲶鱼胚胎的显微注射
<ol>
	<li>在干净的 100 mm 培养皿上涂抹一层极薄的植物起酥油。</li>
	<li>使用已涂油的塑料植物标签，将 50–100 个受精卵从受精盘转移至培养皿中，并用霍尔特弗雷特溶液（材料表）覆盖。将卵子紧密排列成单层，使其相互紧靠。这种排列方式可在显微注射过程中固定卵子位置。</li>
	<li>将盛有卵子的培养皿放置在显微镜载物台上，并用一只手固定。另一只手缓慢下放注射针（图 3），使其以一次平稳的动作穿透卵膜和卵黄。在注入注射物质前，针尖应尽可能靠近胚盘。
	<ol>
		<li>踩下脚踏开关，将注射物质注入卵黄。若胚盘不清晰可见，可将注射物质分散至卵黄的不同区域。操作时，先将针插入卵黄远端，然后在踩下脚踏开关的同时缓慢抽出针头，从而使注射物质在卵黄不同区域扩散。最多可向斑点叉尾鮰胚胎的卵黄中注射 50 纳升（nanoliters），但为获得最佳突变率和胚胎存活率，每种基因对应的 gRNA/Cas9 蛋白用量需进行优化32。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>平稳回撤针头，避免损伤卵子。移动培养皿，对下一个卵子重复相同注射步骤。注射过程中应避免培养皿移动，以防损伤卵子或折断针头。及时移除因显微注射而破裂或受损的卵子。注射可在受精后 15–20 分钟开始，持续至胚胎仍处于单细胞阶段（约受精后 60–90 分钟内）。</li>
	<li>将注射后的胚胎放回含 10 ppm 多西环素的霍尔特弗雷特溶液中，并持续提供轻柔通气，培养 6–7 天直至孵化40。每日更换溶液，并清除死亡胚胎。</li>
</ol>
6. 突变检测
<ol>
	<li>在受精后72小时随机收集若干已注射的胚胎，去除卵黄并提取基因组DNA。同时包括3–5个未注射的胚胎作为对照。 
	注意：可通过蛋白酶K消化和乙醇沉淀法，在去除卵壳和卵黄物质后从胚胎中提取基因组DNA32。</li>
	<li>使用高保真Taq DNA聚合酶扩增每个基因gRNA靶位点侧翼的DNA片段（预期发生突变的区域）32。对于TICAM1，使用引物5'GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3'（正向）和5'GTCCTCCACACTCCTGAAG 3'（反向）扩增一段750 bp的片段；对于RBL，使用引物5'TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3'（正向）和5'AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3'（反向）扩增RBL基因中一段375 bp的片段。
	<ol>
		<li>PCR反应体系如下：PCR级水补至20 µL；1×含MgCl2的高保真Taq酶反应缓冲液，0.2 mM dNTP混合物，每对正向和反向引物各0.4 µM，基因组DNA 100–300 ng，以及1.25单位的高保真Taq酶混合物。PCR扩增程序为：94 °C预变性3分钟；随后进行35个循环：94 °C变性30秒，TICAM1退火温度为60 °C、持续55秒，RBL退火时间为40秒，72 °C延伸（按每kb 1分钟计算）；最后72 °C终延伸10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用适当的突变检测方法鉴定突变胚胎，例如纯化PCR产物测序、Surveyor突变检测试验、异源双链迁移率分析、限制性内切酶识别位点丢失法或其他适用于目标序列的突变检测方法。本实验方案中，TICAM1采用Surveyor突变检测试验进行检测，RBL基因则通过检测SapI限制性内切酶切割位点的丢失情况，并结合纯化PCR产物测序来鉴定突变胚胎。</li>
	<li>为鉴定不同的突变等位基因，将PCR产物克隆至载体中，并对单个菌落来源的克隆进行测序。图4和图6中所示的突变等位基因来源于已注射的胚胎。每个基因分别将6个显微注射胚胎和3个对照胚胎的PCR产物分两管混合（一管为显微注射组，另一管为对照组），快速克隆后对TICAM1共测序86个克隆载体，对RBL基因测序48个克隆载体，其中包括每个基因来自3个未注射对照胚胎的8个测序反应。</li>
	<li>为鉴定不同类型的突变等位基因，可使用BLAST或T-COFFEE等DNA序列比对工具，将突变胚胎的测序结果与野生型序列进行比对分析。</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本文介绍了一种用于实现斑点叉尾鮰基因敲除的胚胎显微注射详细实验方案。与常见的将试剂注射至单细胞胚胎胚盘（blastodisc）的方法相比，将CRISPR/Cas9蛋白注射到卵黄中的操作更为简便、节省时间，且无需经过 extensive 培训，而前者是目前大多数鱼类基因转移和基因编辑所采用的常规技术30,42。本实验方案已成功在斑点叉尾鮰的TICAM 1和RBL基因中诱导产生插入缺失突变（indels）。这些可靠且高效的操作步骤为今后开展斑点叉尾鮰的基因敲除研究奠定了基础。该方案可通过CRISPR/Cas9系统进行调整，以靶向斑点叉尾鮰基因组中的其他基因，也可用于将其他基因技术应用于鮰类，例如tol2介导的转基因技术。此外，该方法也值得在其他具有重要经济价值的鮰科鱼类中进行评估，例如蓝鲶（I. furcatus），其卵子对操作的敏感性似乎高于斑点叉尾鮰。然而，若需注射其他gRNA或具有生物活性的物质（如DNA或mRNA），则可能需要对该方案进行优化，以确定最佳实验条件。
<p class="jov...

显微注射是一种常用的实验室技术，通过玻璃毛细管将少量物质（如DNA、RNA、蛋白质及其他大分子）注入细胞或胚胎中1。该技术需使用特殊的设备组合，包括显微注射仪、显微操作器和显微镜2。研究人员已利用该技术通过构建转基因生物、基因敲除和基因治疗等方式对多种生物体进行遗传修饰，旨在研究细胞内组分的动态变化3,4,5。
斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）是美国水产养殖和休闲垂钓活动中最受欢迎的鲶鱼种类。目前对斑点叉尾鮰开展功能基因组学研究的需求日益增加，而斑点叉尾鮰全基因组的测序工作进一步提升了最新基因组编辑工具的应用价值6,7。了解基因功能不仅能够丰富当前针对鲶鱼的研究，还可能推动更高效的遗传改良项目，从而促进鲶鱼产业的发展。一旦确定了特定目标性状的关键基因，便可利用这些基因通过基因组编辑产生有利等位基因、筛选有利等位基因、抑制有害等位基因、通过转基因技术转移有利等位基因，或结合上述多种策略来实现鲶鱼生产的遗传改良。将不同物种中多个具有商业价值性状的最佳基因整合到同一条鱼中，将显著提高鱼类养殖的生产效率和盈利能力8。
基因敲除是一种在活体中研究基因功能的直接方法。in vivo 水平的DNA突变可遗传给后代，从而有助于研究其在不同世代中的效应。目前已开发出多种基因组编辑工具，包括锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）以及成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统9,10,11,12。
CRISPR/Cas9 系统是一种功能强大且高效的工具，已被用于编辑基因组DNA序列，包括通过RNA引导的位点特异性DNA切割实现鱼类的基因敲除5,13。该系统由一条引导RNA（gRNA）和一种DNA内切酶Cas9组成，其中引导RNA决定基因组中的靶向序列。CRISPR/Cas9系统可被设计用于靶向基因组中的任意序列，相较于ZFNs和TALENs具有多项优势：（1）成本更低；（2）更易于构建；（3）引导RNA与靶序列的结合更具特异性，且脱靶突变减少；（4）可同时利用不同的gRNA靶向多个序列；（5）对某些TALENs无法诱导突变的基因仍具有较高的诱变效率；（6）与ZFNs和TALENs相比，突变的种系传递率最高可提高6倍14,15,16,17,18。
显微注射的主要替代方法是电穿孔，即对胚胎或细胞施加电脉冲，以增加膜通透性和生物分子的摄取19,20。已有多种转基因鱼类通过电穿孔技术获得，包括青鳉（Oryzias latipes）、斑马鱼（Danio rerio）、帝王鲑（Oncorhynchus tshawytscha）、斑点叉尾鮰、黑鲷（Sparus sarba）和普通鲤鱼（Cyprinus carpio）21,22,23,24,25,26。
电穿孔已被用于递送质粒DNA、RNA和Cas9蛋白以实现基因敲除。在哺乳动物细胞中，通过电穿孔递送Cas9/gRNA质粒DNA、Cas9 mRNA/gRNA以及Cas9蛋白/gRNA复合物，结果表明，在大多数测试的电穿孔条件下，使用Cas9蛋白/gRNA复合物所获得的突变率最高27。在尾索动物（Ciona intestinalis）中，将表达TALENs的构建体通过电穿孔导入受精卵，以诱导多个基因的敲除28。在斑点叉尾鮰中，通过电穿孔递送表达ZFNs的质粒构建体以敲除黄体生成素29。然而，一旦进入细胞，质粒构建体需要先转录为RNA，再翻译成功能蛋白，然后才能靶向目标DNA序列，这与直接显微注射RNA/蛋白相比，可能会延迟突变发生的时间。在胚胎发育过程中，突变的延迟会导致注射后的创始个体中嵌合现象增加。此外，转基因表达难以达到显微注射所能实现的表达水平，从而降低突变效率。
作为一种将基因组编辑工具导入细胞的方法，显微注射相较于电穿孔具有多项优势。通过显微注射可稳定地将基因组编辑分子导入细胞或胚胎30。所需注射材料更少，且易于确定注射物质的用量。在创始鱼中可实现较高的突变率和较低的嵌合率，从而提高突变向F1代的种系传递效率。由于突变率较高，获得第一代所需分析的创始鱼数量更少。而在电穿孔方法中，需要分析更多的创始鱼，从而增加成本。然而，斑点叉尾鮰显微注射胚胎的存活率低于电穿孔处理的胚胎，不过这一问题可通过注射更多胚胎来弥补31,32。在斑点叉尾鮰中，卵黄显微注射胚胎的存活率在16%至55%之间，具体取决于靶向基因及gRNA/Cas9蛋白的剂量32。
常规的鲶鱼胚胎显微注射在技术上要求高且耗时，然而，本文提出了一种快速高效的CRISPR/Cas9蛋白显微注射方案，适用于斑点叉尾鮰胚胎。由于该方案将CRISPR/Cas9蛋白溶液注射至单细胞胚胎的卵黄中，所需时间和技术熟练度显著减少。数百个受精卵可在1小时内完成注射（大约相当于第一次细胞分裂所需的时间）。为验证该方案的有效性，本研究在斑点叉尾鮰中敲除了两个与疾病易感性相关的基因：含Toll/白细胞介素1受体结构域的接头分子（TICAM1）基因和岩藻糖结合凝集素（RBL）基因。TICAM1参与由Toll样受体（TLR）3启动的信号通路。在斑点叉尾鮰中，经爱德华氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染后，TICAM1表达显著上调；而在对E. ictaluri具有抗性的蓝鲶鱼中，该基因则呈下调状态33。RBL在柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）早期感染过程中发挥重要作用，该菌是柱形病的致病因子；与抗柱形病的斑点叉尾鮰品系相比，在易感柱形病的品系中观察到RBL基因急性且显著的上调表达34。

<table><tbody><tr><td>Reproboost 植入剂</td><td>海洋生物技术中心</td><td></td><td>促黄体生成素释放激素类似物（LHRHa），用于诱导斑点叉尾鮰雌鱼排卵</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>用于亲本鱼类在激素注射和采卵过程中的镇静&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0.5%，无菌过滤</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>213709</td><td>用于显微注射过程中观察卵子</td></tr><tr><td>显微注射仪</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&amp;nbsp;</td><td>型号 MPPI-3</td><td>用于将注射物质注入胚胎</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>ASI-Applied Scientific Instrumentation&amp;nbsp;</td><td>型号 MM33&amp;nbsp;</td><td>用于固定和控制注射针的移动&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf 微量加样器</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>用于将注射溶液装入显微注射针中</td></tr><tr><td>垂直拉针仪</td><td>David Kopf Instruments</td><td>型号 720</td><td>用于制备显微注射针</td></tr><tr><td>Cas9 蛋白</td><td>PNA Bio Inc.&amp;nbsp;</td><td>CP01</td><td>来自化脓性链球菌（Streptococcus pyrogenes）的重组 Cas9 蛋白</td></tr><tr><td>Expand 高保真 PLUS PCR 系统</td><td>&amp;nbsp;Roche Diagnostics, USA</td><td></td><td>用于 PCR 扩增 gRNA 制备所需的 DNA 模板</td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>外径（OD）1 mm，用于制作显微注射针</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>用于显微注射过程中盛放胚胎</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>植物起酥油，用于涂抹产卵盘和培养皿&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Holtfreter 溶液</td><td>自制</td><td></td><td>59 mM NaCl、0.67 mM KCl、2.4 mM NaHCO3、0.76 mM CaCl2、1.67 mM MgSO4，用于孵化前培养显微注射后的胚胎&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>盐酸多西环素 USP（一水合物）</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>抗生素，加入 Holtfreter 溶液至终浓度 10 ppm，以预防细菌感染</td></tr></tbody></table>

将crispr/cas9蛋白显微注射入斑点叉尾鮰（ictalurus punctatus）胚胎中进行基因编辑

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

通道猫鱼的完整基因组 Ictalurus punctatus，已进行测序，为研究斑点叉尾鮰基因功能提供了更多机会。基因敲除技术已被用于研究这些基因的功能 体内成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白9（CRISPR/Cas9）系统是一种用于编辑基因组DNA序列以改变基因功能的强大工具。传统方法通常通过显微注射将CRISPR/Cas9 mRNA导入单细胞胚胎，但在鲶鱼中，该方法可能效率较低且耗时较长。本文详细描述了一种将CRISPR/Cas9蛋白显微注射至斑点叉尾鮰胚胎的操作方案。简言之，收集卵子与精子后进行人工授精，将受精卵转移至含有霍尔特弗雷特溶液的培养皿中。校准注射体积后，将靶向toll/白细胞介素1受体结构域含接头分子（TICAM 1）基因和鼠李糖结合凝集素（RBL）基因的向导RNA/Cas9复合物显微注射至单细胞胚胎的卵黄中。通过DNA测序确认了插入或缺失突变（indels），表明基因敲除成功。这些突变导致的预测蛋白质序列改变包括由提前出现的终止密码子引起的移码突变和蛋白质截短。

关键词：CRISPR/Cas9，显微注射，斑点叉尾鮰，基因编辑，TICAM 1，RBL，基因敲除，indel，卵黄注射，单细胞胚胎

为了验证显微注射方案的效率，设计了靶向斑点叉尾鮰toll/白细胞介素1受体结构域适配分子（TICAM1）基因和岩藻糖结合凝集素（RBL）基因的gRNA，并进行了显微注射。
TICAM 1 
对克隆PCR产物混合物中单个菌落载体进行的DNA测序揭示了TICAM1基因中诱导产生的插入缺失突变。在分析的24个个体中，突变率为79%。突变示例见于 图4 和 图5. TICAM1基因编码序列中插入缺失突变对斑点叉尾鮰的影响 与野生型序列相比，预测的蛋白质长度和序列差异如图所示 表1。缺失突变导致从预测的蛋白质中移除了几个至多个氨基酸，从而改变下游的阅读框并提前终止翻译（表1).
<p class="jove_...

本文介绍了一种利用CRISPR/Cas9系统在斑点叉尾鮰胚胎中进行基因编辑的简单高效的显微注射方案。在该方案中，将引导RNA和Cas9蛋白显微注射到单细胞胚胎的卵黄中。本方案已通过敲除两个与斑点叉尾鮰免疫相关的基因得到验证。

将CRISPR/Cas9蛋白显微注射入斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）胚胎中进行基因编辑

通道猫鱼（Ictalurus punctatus）的完整基因组已被测序，为研究通道猫鱼基因提供了更多机会……

将CRISPR/Cas9蛋白显微注射到斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）胚胎中以实现基因编辑。建立一种可靠且高效的斑点叉尾鮰靶向基因编辑技术方案，对于功能基因组学研究至关重要，尤其是在斑点叉尾鮰基因组测序完成、基因组资源日益丰富的背景下。本文介绍了一种在斑点叉尾鮰中进行CRISPR/Cas9基因组编辑的详细实验方案。该方案通过靶向两个与斑点叉尾鮰免疫相关的基因——含Toll/白细胞介素-1受体结构域的接头分子（TICAM1）基因和岩藻糖结合凝集素（RBL）基因——进行开发与验证。所有操作均在阿拉巴马州奥本大学 EW Shell 渔业研究中心的鱼类遗传学研究单元进行。亲鱼选择与繁殖：从您希望进行基因编辑的品系或遗传谱系中选择健康的斑点叉尾鮰亲鱼。雄性和雌性斑点叉尾鮰应表现出良好的第二性征。应选择头部宽大、肌肉发达，且头部宽度超过身体其余部分、生殖乳突发育良好的雄鱼。体色深暗以及因领地争斗造成的伤疤也是性成熟的标志。选择头部比身体其余部分窄、且具有柔软可触及的圆润腹部的雌鱼。为了确保准确性并避免在初次操作时对鱼类造成应激，应在检查雌鱼是否具备产卵条件前停止喂食两到三天。操作鱼类时应迅速而谨慎，以减少操作应激。所有需要处理雌鱼的操作均应在将鱼置于产卵袋中时进行。在注射激素前，应先获取雌鱼的体重。随后可将装有雌鱼的产卵袋悬挂在流水槽中，保持持续的水流和充足的供氧。无菌操作将含有每千克85微克促黄体生成素释放激素类似物（LHRHA）的14号针头植入器装入。注射前，用0.9%无菌生理盐水冲洗注射部位及背部肌肉。以45度角插入植入器，并释放植入物。拔出针头，并用浸有70%乙醇的棉球擦拭注射部位。将产卵袋放入暂养池中，使鱼完全浸没于水面以下15至20厘米处。充足的供氧（包括每百万份水中含五份或更多溶解氧）以及良好的水质，对于获得高质量卵子的排卵过程至关重要。根据水温利用度时关系预测排卵时间。通常在激素注射后约36小时进行第一次卵子检查，随后每隔4小时检查一次。检查排卵时，轻轻将产卵袋提起至水面以上，观察是否有卵附着在产卵袋内壁。当观察到卵子数量至少有10个左右时，该雌鱼正处于排卵期，可进行人工挤卵。精子制备：可在预计排卵时间前数小时进行精子的制备。处死雄性鱼，将睾丸收集到一个小的称量盘中。称量睾丸的重量。去除任何附着组织，必要时用0.9%生理盐水清洗睾丸以去除血液。发育良好的睾丸呈白色，具有许多绒毛状突起。将睾丸捣碎后，使用孔径为100微米的滤网过滤精子。用0.9%生理盐水将滤网上的精子冲洗至50毫升离心管中。每克睾丸组织可加入最多10毫升生理盐水。测定精子浓度。检查精子活力和存活率。然而，如果睾丸发育良好，则这些步骤并非必需。精子可在 4°C 下保存，并应在制备后 24 小时内使用。卵子的收集与受精。在直径20厘米的洁净干燥产卵盘上涂抹一层极薄的植物起酥油。将雌鱼放入含有100百万分之一（ppm）用碳酸氢钠缓冲的三卡因甲磺酸盐的麻醉液中，直至鱼完全麻醉。小心地将鱼从产卵袋中取出，并浸入0.9%生理盐水中以洗去麻醉剂。使用干净的毛巾将鱼体表面完全擦干，注意避免去除鱼体表面的黏液层。在泄殖腔周围包括腹鳍区域涂抹植物起酥油，以防止手挤卵子时卵粒黏附。通过轻轻按压卵巢，将卵子手工挤入已涂油的产卵盘中。优质的卵子应能自由流动，呈金黄色，且几乎无团块或血块。在受精前应避免卵子与水接触，因为水可能刺激卵孔关闭。为进行显微注射而对卵子进行受精时，将200-300枚卵子转移至涂有润滑剂的产卵盘中。向卵子中加入一到两毫升精子溶液，轻轻混匀。加入新鲜水以激活精子和卵子。加水量应足以轻微覆盖卵子。轻轻摇晃卵子30秒。受精应在一到两分钟内发生。务必使卵子呈单层进行受精。鲶鱼卵相互粘连，使得对多层胚胎进行显微注射变得困难。向受精卵中加入更多新鲜水，并让卵硬化10至15分钟。剩余未受精的卵可用湿毛巾覆盖以防止干燥，可在数小时内完成受精。受精可分批进行。每隔30至60分钟，对一批数量为2至300枚的卵子进行受精，以确保持续获得处于单细胞期的胚胎，用于显微注射以及作为未注射的对照胚胎。制备和装载注射针。将一根外径为1毫米的硼硅酸盐玻璃毛细管拉制成两根针。将针存放在一个纸盒中，盒内放置一块带有若干切口的海绵。为避免针断裂，海绵的直径应小于针杆的长度。然后可以使用尖锐物体在针尖最细的部位折断一小段，从而打开针尖。或者，也可以在显微镜下用镊子夹断针尖最细的部分来打开针尖。通过将向导RNA与Cas9蛋白混合，制备注射溶液。可加入酚红以对向导RNA Cas9蛋白混合物进行染色，酚红体积最多可占总体积的三分之一。将混合物置于冰上孵育10分钟后再使用。使用微量加样器，将5–10微升的向导RNA Cas9混合物装入注射针中。将微量加样器插入针头杆中，并在缓慢抽出微量加样器尖端的同时推出混合液，避免在内部产生气泡。将针头连接到微量移液器支架上，并确保连接紧密。然后将固定器连接到显微操作仪上，确保其运动自由且稳定。通过打开氮气瓶并调节压力调节阀，施加压力以进行显微注射。注射体积可能受压力、针头孔径和注射持续时间的影响。要确定所需的注射体积，可将液体注射到血细胞计数板上的一滴矿物油中进行测量。如有需要，可通过调整压力和针头孔径来增加或减少注射体积。在矿物油中多次注射，以确保体积一致。鲶鱼胚胎的显微注射。在100毫米洁净的培养皿上涂抹一层极薄的植物起酥油。将50至100个受精卵从受精盘转移至培养皿中，并用霍尔特弗雷特溶液覆盖。卵子应紧密排列成单层。这种排列方式可在显微注射过程中固定卵子位置。将盛有卵的培养皿放置在显微镜载物台上，并用一只手固定。另一只手缓慢放下针头，直至其以平稳的单次动作刺穿绒毛膜和卵黄。在注入注射物质前，针尖应尽可能靠近胚盘。踩下踏板，将注射物质注入卵黄中。如果胚盘不清晰可见，则可将注射物质分散到卵黄的不同位置。为此，需将针头插入卵黄的远端。然后踩下踏板并同时撤出针头。这可使注射物质分散至卵黄内不同位置。50纳升含有2.5纳克向导RNA和7.5纳克Cas9蛋白的溶液可顺利注入卵黄中。平稳地回撤针头，以免损伤卵子。然后将培养皿移至下一个卵子，采用相同步骤进行注射。注射过程中应避免移动培养皿，以防损伤卵子或折断针头。移除因显微注射而破裂或受损的卵。注射可在受精后15至20分钟开始，并持续进行，直至胚胎仍处于单细胞阶段为止。注射后的胚胎放回含10 PPM多西环素的霍尔特弗雷特溶液中，并持续通气培养六至七天，直至孵化。每天更换溶液，并移除死亡的胚胎。结果：该图显示了CRISPR/Cas9在斑点叉尾鮰TICAM1基因中诱导的突变。蓝色序列为原间隔序列邻近基序（PAM），绿色序列为向导RNA的靶向序列。预期Cas9蛋白诱导的双链断裂将发生在两个红色三角形所示位置。缺失突变用虚线表示，其中每一条短线对应一个已被删除的核苷酸。红色序列表示插入，紫色表示替换突变。78 个序列反应中突变等位基因的数量以 78 的分数形式表示。例如，3/78 表示在总共 78 个序列反应中有 3 个检测到了某个等位基因。在分析的 24 名个体中，突变率为 79.2%。突变导致从蛋白质中删除了过多的氨基酸，改变了下游的阅读框并导致翻译提前终止。在大多数突变中，由于提前出现终止密码子，TICAM1 预测蛋白序列超过 80% 被截短。该图显示了在斑点叉尾鮰 RBL 基因中由 CRISPR/Cas9 诱导的突变。外显子序列用大写字母表示，而内含子序列用小写字母表示。蓝色序列代表原间隔序列邻近基序，绿色序列代表向导RNA的靶序列。Cas9蛋白诱导的双链断裂预期发生在两个红色三角形所示的位置。缺失突变用短横线表示，其中每一条短横线对应一个已被删除的核苷酸。红色序列为插入片段。分母为40的分数表示在40次测序反应中发生突变的等位基因数量。例如，2/40 表示在总共 40 次测序反应中的 2 次检测到等位基因。在分析的 40 个个体中，突变率为 87.5%。缺失片段的长度范围为 5 个碱基对至 183 个碱基对，而插入片段最多为 20 个碱基对。超过70%的插入缺失突变导致产生的截短蛋白长度不足野生型蛋白的10%。在本视频中，我们展示了如何将CRISPR/Cas9蛋白微量注射到单细胞通道鲶鱼胚胎中。所述操作步骤简单、快速且高效。并成功实现了两种斑点叉尾鮰基因TICAM1和RBL的基因敲除。根据所注射物质的不同，该方案可进行调整，以包含其他生物活性物质。也可将其改良后用于显微注射其他具有相似卵结构和成分的鲶鱼种类或其他鱼类种类。

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科研

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Genetics

遗传学

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