Name: CoCrMo 颗粒暴露的小鼠颅骨骨溶解模型的构建与评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 了解利用钴铬钼纳米颗粒构建小鼠颅骨骨溶解模型的方法，用于研究人工关节无菌性松动的发病机制。该模型可有效评估磨损颗粒与细胞的相互作用，为骨科研究提供重要工具。

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本研究由国家自然科学基金（81572111）、江苏省临床医学科技项目基金（BL2012002）、南京市科研项目（201402007）、江苏省自然科学基金（BK20161385）以及中国医师协会专项基金（2015COS0810）资助。

本文所述所有方法均已获得南京大学实验动物管理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. CoCrMo 颗粒的制备
<ol>
	<li>通过自制的高真空三电极直流系统获取 CoCrMo 颗粒4。将 CoCrMo 合金置于真空度为 10-3 Pa、氩气与氢气比例为 3:2（v/v）、压力为 0.04 MPa 的环境中，施加 650 A 阴极电流。</li>
	<li>测定 CoCrMo 颗粒的直径。
	<ol>
		<li>将 1 mg CoCrMo 颗粒加入 1.5 mL 无水乙醇中。</li>
		<li>在 28 kHz 频率和 600 W 功率下超声振荡 5 分钟，使 CoCrMo 颗粒在无水乙醇中重新悬浮。</li>
		<li>取一滴（约 20 µL）上述悬浮液滴加于透射电子显微镜（TEM）的载物台上。在 200 kV 加速电压和 0.24 nm 分辨率下拍摄一系列 TEM 图像。</li>
		<li>使用配套软件分析 TEM 显微照片，计算颗粒的平均直径及粒径分布。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除内毒素污染
	<ol>
		<li>将 50 g 颗粒在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>采用定量鲎试剂（Limulus Amebocyte Lysate, LAL）检测内毒素（&#60;0.25 EU/mL 视为无内毒素）5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将颗粒重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配制成 50 mg/mL 的储备溶液6。</li>
</ol>
2. 颅骨骨溶解模型的构建
<ol>
	<li>使用戊巴比妥钠（50 mg/kg）对6周龄C57BL/6J小鼠（每组六只）进行麻醉。通过夹捏试验评估麻醉深度，并用生理盐水防止角膜干燥。</li>
	<li>将小鼠置于俯卧位，使用剃毛器去除颅骨部位的毛发，并用含75%乙醇的医用棉球对皮肤进行消毒。</li>
	<li>进行定位时，确定两个点，分别为两眼之间和两耳之间的中点。然后连接上述两点形成一条线，并沿此线用剪刀切开皮肤（图1A）。</li>
	<li>使用手术刀从颅骨上剥离颅骨骨膜（图1B）6。</li>
	<li>使用单纯间断缝合方法在切口两端缝合皮肤。</li>
	<li>在切口中央处穿过缝线但不打结，将缝线两端留出并握住。</li>
	<li>在颅骨顶部中央植入50 µL CoCrMo颗粒悬浮液（50 mg/mL，溶于PBS中）（图1C）2。</li>
	<li>在单纯间断缝合的末端打结固定（图1D）。</li>
	<li>继续饲养小鼠2周。</li>
</ol>
3. 通过显微CT扫描评估颅骨溶骨性模型
<ol>
	<li>用二氧化碳处死小鼠。在水平面切断小鼠头部。去除内部的脑组织以及外部的皮肤和毛发。采集颅盖骨用于后续实验。</li>
	<li>用镊子轻轻清除颅盖骨上的所有软组织。将清理后的颅盖骨置于4%多聚甲醛中，4 °C固定24小时。在进行显微CT扫描前，将颅盖骨浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中24小时。</li>
	<li>采用高分辨率显微CT对小鼠颅盖骨进行分析，体素各向同性分辨率为18 µm，X射线能量设置为45 kV和550 mA。</li>
	<li>使用软件对显微CT数据进行三维重建。</li>
	<li>定性与定量分析。
	<ol>
		<li>首先，选择中线缝合线周围的方形区域作为感兴趣区域。</li>
		<li>其次，使用显微CT配套软件测量骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度/间距（Tb.Sp）以及总孔隙率百分比。</li>
		<li>第三，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较三组之间的各项测量指标。对于事后方差分析，采用Bonferroni方法2。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 通过H&amp;E染色评估颅骨骨溶解模型
<ol>
	<li>在4 °C条件下，使用15%乙二胺四乙酸（EDTA）-PBS对颅骨样本进行脱钙处理。每更换一次脱钙液，持续3周。</li>
	<li>将脱钙后的样本包埋于石蜡中，制成2 cm × 1 cm × 1 cm的组织块，并在颗粒沉积区域切取2 µm厚的切片。</li>
	<li>按照先前描述的方法7对切片进行苏木精-伊红染色。</li>
	<li>利用光学显微镜拍摄整体病理形态的显微图像。</li>
</ol>

<ol><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisense+oligonucleotide+targeting+TNF-alpha+can+suppress+Co-Cr-Mo+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis.</a> J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT1+protects+osteoblasts+against+particle-induced+inflammatory+responses+and+apoptosis+in+aseptic+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening.</a> Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).</li>
<li>Langlois, J., Hamadouche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+animal+models+of+wear-particle+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Orthop%22%5BJournal%5D)">New animal models of wear-particle osteolysis.</a> Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).</li>
<li>Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/287666498_Preparation_of_ultrafine_silver_powders_by_DC_arc_plasma">Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method.</a> Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fibroblast+expression+of+RANKL+in+CoCrMo-particle-induced+osteolysis+is+mediated+by+ER+stress+and+XBP1s%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s.</a> Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+CoCrMo+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+osteoblast+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis.</a> Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-induced+osteolysis+mediated+by+endoplasmic+reticulum+stress+in+prosthesis+loosening%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening.</a> Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).</li>
<li>Yang, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-mediated+osteoprotegerin+gene+transfer+protects+against+particulate+polyethylene-induced+osteolysis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model.</a> Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+mediated+TiAl%286%29V%284%29+particle-induced+peri-implant+osteolysis+by+promoting+expression+of+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha.</a> Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+Stress+Mediates+TiAl6V4+Particle-Induced+Peri-Implant+Osteolysis+by+Promoting+RANKL+Expression+in+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts.</a> PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TiAl6V4+particles+promote+osteoclast+formation+via+autophagy-mediated+downregulation+of+interferon-beta+in+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes.</a> Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycorine+suppresses+RANKL-induced+osteoclastogenesis+in+vitro+and+prevents+ovariectomy-induced+osteoporosis+and+titanium+particle-induced+osteolysis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo.</a> Sci Rep. 5, 12853(2015).</li>
<li>Neuerburg, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcitonin+receptor+signalling+in+polyethylene+particle-induced+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis.</a> Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).</li>
<li>Catelas, I., Jacobs, J. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20415362">Biologic activity of wear particles.</a> Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).</li>
<li>Liu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+response+to+nanometre-sized+polymer+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">The biological response to nanometre-sized polymer particles.</a> Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在小鼠中，磨损颗粒诱导骨溶解主要有两种方法：气囊模型和颅骨骨溶解模型。在气囊模型中，首先在皮下建立一个气囊，随后引入磨损颗粒并将其植入骨组织8。该气囊壁可模拟无菌性松动中的骨膜。然而，骨植入物无血管且缺乏生物活性，因此难以评估颗粒与骨组织之间的直接相互作用。相较于气囊模型，颅骨骨溶解模型具有多项优势。首先，磨损颗粒可直接作用于颅骨，从而能够评估磨损颗粒与骨稳态之间的相互作用，包括骨吸收以及成骨细胞、破骨细胞和巨噬细胞的活性9,10。其次，可对骨量丢失进行定量测量，有助于评估多种潜在的遗传学方法和生物制剂在预防骨丢失中的作用11。第三，可在不同遗传背景（包括转基因小鼠和基因敲除小鼠）中评估磨损颗粒与骨丢失之间的关系12,13。第四，该模型可用于在不同剂量下筛选大量化合物。然而，传统颅骨骨溶解模型的成功率相对较低，...

无菌性松动是导致全髋关节置换术（THA）和全膝关节置换术（TKA）失败的最常见原因，常需进行翻修手术1。然而，其潜在机制尚不明确2。由于颗粒诱导的骨溶解发生率较低，因此需要长期随访才能发现；这使得在临床病例中探索其发病机制具有挑战性。因此，针对复杂细胞和组织机制的进一步研究，需要结合磨损颗粒诱导骨溶解的体内实验模型以及与骨稳态相关细胞的体外检测方法3。有效的动物模型对于揭示磨损颗粒对骨量丢失的影响至关重要，可为后续的细胞实验提供依据。
通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估颗粒与无菌性松动中各种细胞相互作用的有效且可靠的方法。在该模型中，CoCrMo颗粒通过诱导巨噬细胞释放炎性细胞因子、激活破骨细胞、抑制成骨细胞增殖以及促进成骨细胞凋亡，导致颅骨骨溶解。
建立此模型仅需两周时间。骨溶解可通过苏木精和伊红（H&amp;E）染色以及显微计算机断层扫描（micro-CT）进行可视化和定量分析2。此外，该模型成本相对较低，且可利用转基因和基因敲除小鼠模型在不同剂量下筛选大量化合物3。
建立和评估该模型的操作步骤十分简便。首先，通过高真空三电极直流法获取CoCrMo颗粒，并将其重悬于磷酸盐缓冲液（PBS）中，浓度为50 mg/mL。随后，在通过锐性分离剥离颅骨骨膜后，将50 µL上述悬浮液滴加至小鼠颅盖骨中央。两周后处死小鼠，取下颅盖骨样本，并通过苏木精-伊红（H&amp;E）染色和显微CT进行定性和定量分析。
通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估钴铬钼颗粒与巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞及破骨细胞等各类细胞在无菌性松动过程中相互作用的理想工具。

<table><tbody><tr><td>来自假体的钴铬钼合金</td><td>Waldemar Link GmbH &amp;amp; 公司</td><td>GEMINI MK II</td><td>获取钴铬钼纳米颗粒的原材料</td></tr><tr><td>高真空三电极直流装置</td><td>材料科学学院 &amp;与工程，南京工业大学</td><td></td><td>自行设计的机器</td></tr><tr><td>6周龄雄性C57BL/6J小鼠</td><td>南京大学模式动物研究中心</td><td>N000013</td><td></td></tr><tr><td>100% 乙醇</td><td>南京试剂</td><td>C0691514023</td><td>CoCrMo 纳米颗粒透射电子显微镜扫描用溶剂</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>台州维尔康医疗器械有限公司</td><td>W603</td><td></td></tr><tr><td>微量分析天平</td><td>深圳群龙仪器设备有限公司</td><td>EX125DZH</td><td></td></tr><tr><td>超声波振荡器</td><td>上海玉豪科学仪器有限公司</td><td>YH-200DH</td><td>悬浮 CoCrMo 纳米颗粒</td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td>Tecnai G20</td><td></td></tr><tr><td>SimplePCI 软件</td><td>Compix 公司</td><td>6.6 版本</td><td>计算平均直径和粒径分布。</td></tr><tr><td>高压灭菌锅</td><td>邱龙一仪器</td><td>KYQL-100DS</td><td>去除内毒素</td></tr><tr><td>鲎试剂（LAL）检测法</td><td>查尔斯河实验室（Charles River）</td><td>R13025</td><td>检测内毒素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>15 ml 微型离心管</td><td>台州苏医医疗</td><td>B122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Boster Biological Technology</td><td>AR0030</td><td>CoCrMo 纳米颗粒储备液溶剂</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>Sigma</td><td>P3761</td><td>麻醉小鼠</td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>萨克勒</td><td>SR8572EP-15</td><td>为防止小鼠眼睛干燥</td></tr><tr><td>75% 乙醇</td><td>南京试剂</td><td>C0691560275</td><td>消毒</td></tr><tr><td>医用棉球</td><td>Shuitao</td><td>1278298933</td><td>消毒</td></tr><tr><td>沙弗</td><td>Kemei</td><td>KM-3018</td><td>剃除毛发</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S12005-10</td><td>切开皮肤</td></tr><tr><td>缝合</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F34001-01</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>持针器</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F33001-01</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>针</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>R14003-12</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>血管钳</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F22003-09</td><td>缝合皮肤</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>S31010-01</td><td>获取颅骨骨片</td></tr><tr><td>镊子</td><td>RWD LIFE SCIENCE</td><td>F12006-10</td><td>获取颅骨骨片</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L移液管</td><td>Eppendorf</td><td>3120000240</td><td>将颗粒悬浮液包埋于小脑蚓部</td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L型移液器吸头</td><td>AXYGEN</td><td>T-200-Y</td><td>将颗粒悬浮液包埋于钟形罩中</td></tr><tr><td>5 ml 微量离心管</td><td>台州维尔康医疗用品有限公司</td><td>W621</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td>固定</td></tr><tr><td>微型计算机断层扫描&amp;nbsp;</td><td>SkyScan</td><td>SkyScan1176</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Servicebio</td><td>G1105</td><td>脱钙</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Servicebio</td><td>#0001</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片机</td><td>Leica</td><td>RM2125RTS</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Servicebio</td><td>G6004</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Servicebio</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>HE染色试剂盒</td><td>Servicebio</td><td>#1-5</td><td>HE染色</td></tr><tr><td>光学显微镜</td><td>尼康</td><td>E200</td><td></td></tr></tbody></table>

通过无菌性松动中暴露于cocrmo颗粒构建和评估小鼠颅骨骨溶解模型

Construction and Evaluation of a Murine Calvarial Osteolysis Model by Exposure to CoCrMo Particles in Aseptic Loosening

磨损颗粒诱导的骨溶解是关节成形术失败中无菌性松动的主要原因，但其潜在机制尚不明确。由于临床病例中检测该病需要长期随访且发生较为零星，因此评估颗粒诱导骨溶解的发病机制具有挑战性。因此，需要建立理想的动物模型以开展进一步研究。通过暴露于CoCrMo颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型，是评估颗粒与多种细胞在无菌性松动中相互作用的有效且可靠的工具。在该模型中，首先采用高真空三电极直流法获取CoCrMo颗粒，并将其重悬于磷酸盐缓冲液中，浓度为50 mg/mL。随后，在通过锐性分离颅骨骨膜后，将50 µL上述悬浮液施加于小鼠颅骨中央区域。两周后处死小鼠并采集颅骨标本，通过苏木精-伊红染色和微型计算机断层扫描进行定性和定量评估。该模型的优点包括操作简便、可对骨量丢失进行定量评估、骨溶解发展迅速、适用于转基因或基因敲除模型，以及相对成本较低。然而，该模型无法用于评估颗粒在无菌性松动中所受的机械力及其慢性效应。暴露于CoCrMo颗粒所诱导的小鼠颅骨骨溶解模型，是研究磨损颗粒与多种细胞相互作用的理想工具。 例如巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞和破骨细胞在无菌性松动中的作用。

通过透射电子显微镜（TEM）定量分析，实验室自制的纳米级CoCrMo颗粒直径约为50 nm（标准误差为3.56）（图2）。将小鼠颅骨暴露于CoCrMo颗粒后，动物（每组n=6）继续饲养两周。在此两周内，颅骨切口完全愈合，缝线可能脱落。任何局部感染或骨不连均可能影响骨量丢失的评估。小鼠安乐死后，采集颅骨样本，随后轻柔清除所有软组织，并采用显微CT定量分析骨量丢失情况。从三维重建图像及横断面代表性冠状位图像均可观察到，接受CoCrMo颗粒处理的小鼠出现显著的骨量丢失（图3）。与对照组和假手术组相比，CoCrMo组的骨矿物密度（BMD）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著降低，而总孔隙率及骨小梁分离度/间距（Tb.Sp）则显著升高（图4）。组间差异采用Student t检验进行评估，以p&lt;0.05为差异具有统计学意义。此外，颅骨切片的H&amp;...

本论文描述了一种通过暴露于钴铬钼（CoCrMo）颗粒建立的小鼠颅骨骨溶解模型，该模型是评估磨损颗粒与无菌性松动中各类细胞相互作用的理想动物模型。

通过无菌性松动中暴露于CoCrMo颗粒构建和评估小鼠颅骨骨溶解模型

磨损颗粒诱导的骨溶解是关节成形术失败中无菌性松动的主要原因，但其潜在机制尚不明确。由于长期……

本实验的总体目标是通过暴露于钴-铬-钼纳米颗粒，构建并评估小鼠颅骨骨溶解模型。磨损颗粒诱导的骨溶解是关节成形术失败中无菌性松动的主要原因，但其潜在机制尚不明确。由于临床病例随访时间长且发生具有偶发性，难以在临床情况下深入探究无菌性松动的发病机制。因此，有必要建立磨损动物模型以进行深入研究。在本实验室，通过钴合金颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型是研究无菌性松动发病机制的有效模型。该模型的建立首先从钴合金假体中制备出纳米级钴铬钼颗粒，并将其以15毫克/毫升的浓度重新悬浮于磷酸盐缓冲液中。下一步是在双眼之间和双耳之间的中点连线处确定切口位置。然后，通过冲击解剖法从颅骨上剥离颅骨骨膜。接着，取50微升钴合金纳米颗粒储备液，将其植入颅骨的矢状缝中央。经过两周的维持后，处死部分小鼠并采集颅骨用于骨溶解评估。在微计算机断层扫描（micro-CT）和苏木精-伊红（H&E）染色图像中，钴合金纳米颗粒处理的小鼠均表现出明显的骨溶解。从钴合金假体中获取钴铬钼合金，并通过自制的高真空三电极直流系统从钴铬钼合金中制备钴铬钼颗粒。为定量测定钴铬钼颗粒的平均直径，取1毫克颗粒加入1.5毫升无水乙醇中，并通过超声震荡使其悬浮。取约20微升悬浮液一滴，滴加于透射电子显微镜的载物台上，获取一系列图像。利用提供的软件对透射电子显微镜图像中的平均直径及粒径分布进行计算。左侧为典型的透射电子显微镜（TEM）图像，右侧显示了通过商用软件计算得到的钴铬钼合金纳米颗粒尺寸分布。平均直径约为50纳米。将颗粒在高压灭菌器中处理15分钟，以去除内毒素。然后，将它们重悬于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为15毫克/毫升的储备溶液。接下来构建颅骨骨溶解模型。选择并麻醉6周龄小鼠：每组6只小鼠。将动物置于手术位置。去除颅骨部位的毛发，并用75%乙醇对皮肤进行消毒。进行切口时，分别确定两眼之间和两耳之间的中点，沿连接这两点的直线切开皮肤。通过冲击解剖法仔细且完整地从颅骨骨膜上剥离颅盖骨。清晰地解剖骨膜可增强颅盖骨内颗粒间的相互作用。在切口两端以单纯间断缝合法小心缝合。通常，完成缝合需要三个缝合线。在最后阶段，将缝合线穿过切口但不打结，握住缝合线的两端。取15微升钴合金储备液纳米颗粒，将其嵌入颅顶骨的中间缝合处。打结简单间断缝合的最后一针。继续饲养小鼠两周。两周后，处死动物并取下颅骨。用镊子轻轻清除颅骨样本上的所有软组织，并将组织固定于4%多聚甲醛中，4°C保存。为评估钴铬钼纳米颗粒诱导模型中的骨溶解，在进行显微CT扫描前24小时进行高分辨率显微CT分析。将颅骨样本从多聚甲醛中转移至磷酸盐缓冲液中。在进行显微CT扫描当天，从磷酸盐缓冲液中取出颅骨标本，并将其固定在与仪器配套的样品台上。使用显微CT仪器对颅骨进行扫描，并利用多种软件进行三维重建。苏木精和伊红染色是评估纳米颗粒诱导模型中骨溶解的另一种工具。将颅骨样本置于含15%乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中，在4°C下脱钙三周。将脱钙后的颅骨包埋于石蜡中，并在颗粒沉积区域切分为2 µm厚的切片。用苏木精和伊红对切片进行染色。在光学显微镜下观察整体形态结构，并采集显微图像。以下是具有代表性的显微CT图像。左侧为微计算机断层扫描（micro-CT）数据的三维重建图像。右侧为对照组、假手术组和纳米颗粒处理组小鼠的横截面图像。纳米颗粒处理组中骨溶解现象明显。以下是利用仪器配套软件对微计算机断层扫描（micro-CT）图像进行的定量分析。测量指标包括骨矿物密度、骨体积或总体积比值、总孔隙率百分比、骨小梁数量、骨小梁厚度，以及骨小梁分离度或间距。与对照组动物相比，接受钴合金纳米颗粒处理的小鼠表现出显著降低的骨矿物密度和骨体积，以及更高的总孔隙率百分比。以下是对照组、假手术组和纳米颗粒处理组小鼠颅骨样本的代表性苏木精和伊红（H&E）染色图像。纳米颗粒处理组中也可见明显的骨溶解现象。由钴合金纳米颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型在模拟磨损颗粒诱导的骨溶解方面具有较高的建模成功率。以下是几个关键因素。第一，钴合金纳米颗粒增强了磨损颗粒与颅骨之间的相互作用。第二，充分暴露颅骨并清晰剥离骨膜，可使颗粒与颅骨之间的相互作用更加密切。第三，通过显微CT对骨量丢失进行定量测量，能够更方便地评估不同处理之间的骨丢失差异，与传统的骨组织形态计量学相比，为骨溶解提供了更为可靠的证据。利用钴合金颗粒构建的颅骨骨溶解模型，是研究磨损颗粒与无菌性松动过程中各类细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞、破骨细胞和成骨细胞）相互作用的理想模型。我们希望本模型对未来无菌性松动的研究有所帮助。

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CoCrMo 颗粒暴露的小鼠颅骨骨溶解模型的构建与评价

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

尽管小鼠模型在骨组织工程中是不可或缺的工具，但长骨缺损模型却较为稀少。这一需求促使了本实验方案的开发，该方案采用带有四枚螺钉的锁定钢板和专用导板，以建立并稳定可重复的股骨临界尺寸缺损，且具有较低的并发症发生率。...

建立经钢板内固定稳定的鼠股骨节段性临界尺寸缺损模型

脂肪来源的基质细胞可能适用于利用患者自体细胞构建新组织。本文介绍一种分离具有增强成骨潜能的人脂肪来源基质细胞（ASCs）亚群的实验方案，随后将这些细胞应用于 体内...

快速分离BMPR-IB+脂肪源性基质细胞用于颅骨缺损修复模型

此处，我们介绍一种用于可视化血管形成的实验方案 体内 通过多光子显微镜在三维支架中实时观察。在转基因支架中的血管生成研究采用小鼠颅骨临界骨缺损模型。治疗组中检测到的新血管数量多于对照组。...

通过多光子显微镜观察血管生成 在体 内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架

利用颅骨共培养与组织形态计量学测量骨重塑并重建肿瘤-骨微环境

本文介绍了一种在兔子中进行的外科手术方案，旨在评估骨替代材料在骨再生能力方面的性能。通过将聚醚醚酮（PEEK）圆柱体固定在兔颅骨上，可在活体或安乐死动物中评估材料所诱导的成骨传导、成骨诱导、成骨生成以及血管生成作用。...

用于评估骨替代材料中骨生长与新生血管形成的兔颅骨骨增量模型

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

本文介绍了一种人为造成Wistar白化大鼠股骨干骨折并观察骨痂形成过程的实验方案。该股骨截骨模型可帮助研究人员评估骨折愈合过程，并研究药物对骨折愈合的影响。...

Wistar白化大鼠股骨截骨模型建立方案

本方案逐步演示了如何从小鼠中提取下颌第一磨牙，为专注于颌骨愈合与再生研究的研究人员提供了一种替代方法。...

小鼠下颌磨牙拔牙窝愈合模型的建立

本文介绍了一种在大鼠股骨骨干组织中创建箱形腔隙缺损的实验方案。该模型可用于评估生物材料在生物力学应力条件下的性能，并探究与膜内成骨相关的骨再生机制。...

在大鼠股骨皮质骨中构建箱形骨腔缺损模型

小鼠骨髓损伤模型是研究出生后通过膜内成骨进行骨形成的有效工具。该简化的手术方案描述了骨髓消融操作，可用于后续评估损伤后新骨形成及细胞反应。...

通过小鼠骨髓损伤模型研究出生后膜内成骨的改进方法

了解利用钴铬钼纳米颗粒构建小鼠颅骨骨溶解模型的方法，用于研究人工关节无菌性松动的发病机制。该模型可有效评估磨损颗粒与细胞的相互作用，为骨科研究提供重要工具。

通过无菌性松动中暴露于CoCrMo颗粒构建和评估小鼠颅骨骨溶解模型

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