通过无菌性松动中暴露于CoCrMo颗粒构建和评估小鼠颅骨骨溶解模型

本实验的总体目标是通过暴露于钴-铬-钼纳米颗粒，构建并评估小鼠颅骨骨溶解模型。磨损颗粒诱导的骨溶解是关节成形术失败中无菌性松动的主要原因，但其潜在机制尚不明确。由于临床病例随访时间长且发生具有偶发性，难以在临床情况下深入探究无菌性松动的发病机制。

因此，有必要建立磨损动物模型以进行深入研究。在本实验室，通过钴合金颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型是研究无菌性松动发病机制的有效模型。该模型的建立首先从钴合金假体中制备出纳米级钴铬钼颗粒，并将其以15毫克/毫升的浓度重新悬浮于磷酸盐缓冲液中。

下一步是在双眼之间和双耳之间的中点连线处确定切口位置。然后，通过冲击解剖法从颅骨上剥离颅骨骨膜。接着，取50微升钴合金纳米颗粒储备液，将其植入颅骨的矢状缝中央。

经过两周的维持后，处死部分小鼠并采集颅骨用于骨溶解评估。在微计算机断层扫描（micro-CT）和苏木精-伊红（H&E）染色图像中，钴合金纳米颗粒处理的小鼠均表现出明显的骨溶解。从钴合金假体中获取钴铬钼合金，并通过自制的高真空三电极直流系统从钴铬钼合金中制备钴铬钼颗粒。

为定量测定钴铬钼颗粒的平均直径，取1毫克颗粒加入1.5毫升无水乙醇中，并通过超声震荡使其悬浮。取约20微升悬浮液一滴，滴加于透射电子显微镜的载物台上，获取一系列图像。利用提供的软件对透射电子显微镜图像中的平均直径及粒径分布进行计算。

左侧为典型的透射电子显微镜（TEM）图像，右侧显示了通过商用软件计算得到的钴铬钼合金纳米颗粒尺寸分布。平均直径约为50纳米。将颗粒在高压灭菌器中处理15分钟，以去除内毒素。

然后，将它们重悬于磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为15毫克/毫升的储备溶液。接下来构建颅骨骨溶解模型。选择并麻醉6周龄小鼠：每组6只小鼠。

将动物置于手术位置。去除颅骨部位的毛发，并用75%乙醇对皮肤进行消毒。进行切口时，分别确定两眼之间和两耳之间的中点，沿连接这两点的直线切开皮肤。

通过冲击解剖法仔细且完整地从颅骨骨膜上剥离颅盖骨。清晰地解剖骨膜可增强颅盖骨内颗粒间的相互作用。在切口两端以单纯间断缝合法小心缝合。

通常，完成缝合需要三个缝合线。在最后阶段，将缝合线穿过切口但不打结，握住缝合线的两端。取15微升钴合金储备液纳米颗粒，将其嵌入颅顶骨的中间缝合处。

打结简单间断缝合的最后一针。继续饲养小鼠两周。两周后，处死动物并取下颅骨。

用镊子轻轻清除颅骨样本上的所有软组织，并将组织固定于4%多聚甲醛中，4°C保存。为评估钴铬钼纳米颗粒诱导模型中的骨溶解，在进行显微CT扫描前24小时进行高分辨率显微CT分析。将颅骨样本从多聚甲醛中转移至磷酸盐缓冲液中。

在进行显微CT扫描当天，从磷酸盐缓冲液中取出颅骨标本，并将其固定在与仪器配套的样品台上。使用显微CT仪器对颅骨进行扫描，并利用多种软件进行三维重建。

苏木精和伊红染色是评估纳米颗粒诱导模型中骨溶解的另一种工具。将颅骨样本置于含15%乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中，在4°C下脱钙三周。将脱钙后的颅骨包埋于石蜡中，并在颗粒沉积区域切分为2 µm厚的切片。

用苏木精和伊红对切片进行染色。在光学显微镜下观察整体形态结构，并采集显微图像。以下是具有代表性的显微CT图像。

左侧为微计算机断层扫描（micro-CT）数据的三维重建图像。右侧为对照组、假手术组和纳米颗粒处理组小鼠的横截面图像。纳米颗粒处理组中骨溶解现象明显。

以下是利用仪器配套软件对微计算机断层扫描（micro-CT）图像进行的定量分析。测量指标包括骨矿物密度、骨体积或总体积比值、总孔隙率百分比、骨小梁数量、骨小梁厚度，以及骨小梁分离度或间距。与对照组动物相比，接受钴合金纳米颗粒处理的小鼠表现出显著降低的骨矿物密度和骨体积，以及更高的总孔隙率百分比。

以下是对照组、假手术组和纳米颗粒处理组小鼠颅骨样本的代表性苏木精和伊红（H&E）染色图像。纳米颗粒处理组中也可见明显的骨溶解现象。由钴合金纳米颗粒构建的小鼠颅骨骨溶解模型在模拟磨损颗粒诱导的骨溶解方面具有较高的建模成功率。

以下是几个关键因素。第一，钴合金纳米颗粒增强了磨损颗粒与颅骨之间的相互作用。第二，充分暴露颅骨并清晰剥离骨膜，可使颗粒与颅骨之间的相互作用更加密切。

第三，通过显微CT对骨量丢失进行定量测量，能够更方便地评估不同处理之间的骨丢失差异，与传统的骨组织形态计量学相比，为骨溶解提供了更为可靠的证据。利用钴合金颗粒构建的颅骨骨溶解模型，是研究磨损颗粒与无菌性松动过程中各类细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞、破骨细胞和成骨细胞）相互作用的理想模型。

我们希望本模型对未来无菌性松动的研究有所帮助。