个性化肽阵列在器官移植 HLA 抗体检测中的研究

这种用于同种抗体检测的定制阵列方法的总体目标是描绘器官移植中的人白细胞抗原或 HLA 表位。这种方法可以帮助回答器官移植领域关于移植排斥反应所涉及的特定免疫表位的关键问题。该技术的主要优点是它是完全可定制的，允许掺入可以反映个体器官供体 HLA 序列的个性化抗原集。

该技术有可能检测同种抗体的特异性 HLA 表位。要从国际免疫遗传学项目人类白细胞抗原项目数据库中检索序列，请在模棱两可的等位基因组合页面中打开数据库等位基因查询表单，并在搜索框中输入受试者的第一个等位基因名称。单击 Search for Alleles Now 并找到屏幕上显示的匹配等位基因名称。

单击 等位基因 并将蛋白质序列复制并粘贴到等位基因名称标题行下的文本文档中，以 FASTA 格式按顺序排列等位基因名称。确定所有序列后，将 FASTA 格式中的序列复制并粘贴到 Cluster Omega 网站上的 enter your input sequences 框中，然后单击 submit your job using the standard parameter settings。然后单击 submit。

将显示序列的对齐方式。要标记供体特异性错配，请将比对文本复制并粘贴到新的文本文档中，并使用不同的字体颜色标记属于供体的比对序列中每个不匹配的供体特异性残基。在供体序列中向标记的供体特异性错配的上游和下游延伸 14 个残基的所有字母下划线，并使用带下划线的序列作为模板，依次衍生出序列中的 15 个氨基酸短序列，这些序列在序列中任意两个紧邻序列之间重叠 4 个残基。

将这 15 个氨基酸序列以列格式复制并粘贴到电子表格中，并附有包含供体等位基因相应名称的符号列。要设计自定义阵列布局，请生成一个 20 行和 30 列的肽序列电子表格，其中包含相应的等位基因调用。然后将序列输入到每个阵列单元中，并使用点合成器运行自动肽阵列合成。

在设计芯片时，使用单个供体的 HLA 序列作为衍生抗原集的模板至关重要。合成阵列后，用 20 毫升 5% 脱脂牛奶溶解在含 0.1%吐温 20 或 TBST 的 Tris 缓冲盐水中封闭膜，在适当的孵育期内摇动。接下来，用 20 毫升新鲜 TBST 洗涤膜 3 次，每次洗涤 5 分钟，然后与 20 微升粗制受体血清在 2.5% 牛奶中的 TBST 溶液中在室温下孵育 2 至 3 小时。

孵育结束时，将膜洗涤 3 次，每次洗涤 10 分钟，并将膜与山羊抗人辣根过氧化物酶偶联的 IgG 二抗孵育 2 小时。在 TBST 中洗涤 3 次 10 分钟，去除未结合的二抗，并在 5 毫升新鲜制备的鲁米诺溶液和 5 毫升过氧化物溶液中显影膜。一分钟后，在合适的成像仪上可视化增强的化学发光信号。

保存显影图像后，将膜与 20 mL市售剥离缓冲液在 37 摄氏度下孵育 20 分钟，然后在 TBST 中洗涤 3 次，每次 10 分钟。然后封闭、重新探测和可视化膜，就像刚刚在不同时间点获得的来自同一患者的血清样本所证明的那样。要手动注释阳性抗原肽，请在保存的显影图像文件中找到具有阳性抗体信号的斑点，并确定它们的每个网格位置。

然后从主工作表中检索肽序列，以根据它们的反应性肽的重叠片段识别任何可能共享的表位序列。为了对抗原表位进行结构建模，从蛋白质数据库中获取原型 HLA 晶体结构，并在 Pymol 中显示原型 HLA 结构。突出显示反应性肽序列，将发现的抗供体表位映射到原型 HLA 的 3D 结构。

然后点击 显示和背景 并选择 白色，将数据保存为 PNG 文件。如刚才所示，在对该代表性供体患者的等位基因的多重比对进行测序后，获得了每个等位基因的比对文件。然后鉴定足够长以覆盖所有错配残基的供体模板序列并加下划线，并为第一个等位基因衍生三个系列的 15-mer 肽。

在分析了供体的所有等位基因后，将总共 202 个肽加载到阵列中，用于对供体的移植后血清进行特异性探测。将结果与随后重新探测供体移植前血清获得的结果进行比较，揭示了与移植后标本相关的抗体信号，其中几个与受体不匹配的供体特异性残基似乎与激发抗体反应有关。当 HLA-DQA1 和 DQB1 上的抗体反应表位建模为共晶异二聚体结构时，称为 β 1 链的结构的突出片段被确定为热点，在具有代表性的 5 例队列中，移植受试者被同种抗体靶向的可能性要高得多。

一旦掌握，如果执行得当，该技术可以在 7 到 8 小时内完成。该技术开发后，为移植排斥反应领域的研究人员探索供体特异性同种抗体的个性化检测铺平了道路。