Name: 个性化肽阵列在器官移植 HLA 抗体检测中的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 了解个性化肽阵列技术在器官移植中检测供体特异性HLA抗体的定制化方法。该技术利用个体供者的HLA序列设计抗原组合，提高抗体检测准确性，有助于深入理解移植排斥反应中的免疫应答机制。

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我们感谢加拿大西安大略大学的Shawn Li博士和Xing Li博士在SPOT阵列制备过程中提供的帮助。我们感谢西北大学组织相容性核心实验室和综合移植中心的工作人员提供的样本服务。本工作部分得到了西北纪念医院辅助委员会以及西北大学为J.J.提供的教师启动基金的支持。

本文所述所有方法均已获得西北大学机构审查委员会批准（IRB 方案编号：STU00104680）。本方案的整体工作流程见图1。
1. 供体与受体 HLA 序列的生物信息学分析
<ol>
	<li>从 IMGT/HLA 数据库中获取序列15。
	<ol>
		<li>获取器官供者及其受者的 HLA 分型报告。 
		注意：必须采用适当的程序保护机密医疗记录。通常，根据机构审查委员会（IRB）的指南，研究方案或实验测试需获得 IRB 批准。如果 HLA 报告来自基于 PCR 的分型（高分辨率或低分辨率）或基于测序的分型（SBT），则直接进入步骤 1.1.3。如果序列来自基因组/HLA 测序，并且序列完整，则直接使用这些序列。偶尔，当仅获得不完整的分型或测序结果时，请遵循附加步骤 1.1.2，通过步骤 1.1.2 中描述的网络工具为&#34;缺失&#34;等位基因进行分配。</li>
		<li>打开以下网页链接中的“模糊等位基因组合”页面 - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/ambig.html，使用“模糊等位基因组合搜索工具”功能搜索并获取假想等位基因。然后进入步骤 1.1.3，输入等位基因名称。</li>
		<li>打开以下网页链接中的 IMGT/HLA 等位基因查询表单 - http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/allele.html，将受试者的等位基因名称（逐个输入，如图 2所示）输入“搜索”框中，点击“立即搜索等位基因”按钮。HLA 等位基因名称应使用标准命名系统（即，A*、A*01、A*01:01:01:01，以及任何先前的命名形式如 A*01010101）。</li>
		<li>在屏幕上找到匹配的等位基因名称，点击该等位基因按钮。</li>
		<li>复制&#34;蛋白质序列&#34;，并将其粘贴到一个文本文档中，置于以“>等位基因名称&#34;为标题行的内容下方。实际上，该文本文档即为等位基因名称与序列的 FASTA（FAST-All）格式文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对供者与受者/患者等位基因进行基于基因的多序列比对。
	<ol>
		<li>每次处理一个基因（例如，DQB1*03:01:01:01），将供者和患者的四个等位基因 FASTA 序列（供者两个，患者两个）复制并粘贴到一个合并的文本文档中。此时，重要的是要明确区分供者与患者的等位基因名称（可选方法包括使用大小写差异，或为每个等位基因名称添加不同的前缀或后缀以区分供者与患者等位基因）。序列输入顺序无关紧要，因为在比对后，序列将根据任意两两之间的相似性程度重新排序。</li>
		<li>将上述 FASTA 格式的序列（如图 3所示）复制并粘贴至 Cluster Omega 网站的“Enter your input sequences”框中：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/。</li>
		<li>使用参数的标准设置点击&#34;提交您的任务&#34;：例如&#34;PROTEIN&#34;；以及&#34;Clustal w/ numbers&#34;。点击&#34;提交&#34;执行比对。屏幕上将显示四个序列的比对结果（图 4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>标记供者特异性错配位点。 
	注意：需特别指出的是，此处提供的等位基因序列基于 HLA 分型结果，而非测序结果。因此，可能存在遗漏供者-受者对之间相关序列变异的风险。随着越来越多移植中心采用高分辨率精确分型和直接 DNA 测序，这一潜在问题将逐步缓解。
	<ol>
		<li>将比对文本复制并粘贴到一个文本文档中，创建新文档。如果比对文件的格式出现错乱，通过更改字体样式和大小来修复格式：始终使用小字号的&#34;Courier New&#34;字体以适应行宽。在解决格式问题后保存文档。</li>
		<li>手动检查比对序列，识别出仅属于供者的全部错配残基。使用不同的字体颜色标记每一个供者特异性残基。</li>
		<li>在供者序列中，对每个标记的供者特异性错配位点上下游各延伸 14 个残基的所有字母加下划线（计算方式为：15 个氨基酸的肽段减去 1 个错配残基）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以重叠方式推导 15 聚体肽序列。 
	注意：选择 15 聚体肽的原因基于通常免疫表位长度为 4–9 个氨基酸的普遍认知。因此，当采用步长为 4 个氨基酸的&#34;滑动窗口&#34;方法时（图 1），我们选择 15 个氨基酸长度，使得系列中任意两个相邻肽段之间有 15-4=11 个氨基酸的重叠。理论上，这种 11 个氨基酸的重叠足以覆盖所有长度不超过 9 个氨基酸的免疫表位，从而避免任何表位被&#34;截断&#34;，导致阵列上仅出现部分序列。
	<ol>
		<li>以加下划线的序列为模板，依次推导出一系列长度为 15 个氨基酸、相邻序列间重叠 4 个残基的短肽序列。</li>
		<li>将这些 15 个氨基酸序列以列格式复制并粘贴到电子表格中（图 5），并附上标注列，包括对应的供者等位基因名称。添加一列用于记录氨基酸残基位置可能更有帮助。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对供者与受者对的每个 HLA 等位基因（例如，A、B、C、DQA1、DQB1、DRB1 和 DP）重复步骤 1.1.3 至 1.3，以推导供者的 15 个氨基酸短序列。</li>
	<li>将所有列复制并粘贴到一个主电子表格中，形成一个包含供者所有等位基因 15 个氨基酸序列的长连续列。记录文档中肽序列的总行数。</li>
</ol>
2. 定制芯片布局设计与制备
<ol>
	<li>生成包含肽序列及其相应等位基因分型的电子表格。该阵列包含20行和30列，最多可容纳20×30=600个肽点位。根据步骤1.5中记录的某一供体的肽总数，并结合我们此前在Liu中尝试过的两个实例的经验 等.17600 点阵列可容纳约 2 个独立移植病例产生的全部序列。
	<ol>
		<li>合理规划在阵列的600个点位格式内排列多肽组合的最高效方式。</li>
		<li>如果一个完整阵列可容纳多名受试者，应在第一位供体序列后插入空行，使总行数为30的整数倍（阵列中每行包含30个点位）。</li>
		<li>在第一组序列的最后一个空行之后，立即粘贴第二个移植病例的整列序列内容。</li>
		<li>重复这些步骤，直至阵列填满，且无法在不超出600个位置的情况下添加更多样本。如果底部留下整行空白行需要填充， &#34;移动&#34; 在两组供体之间留出一个空行。在合成完成后，这种在各组之间留出的较宽空间将便于进行膜的切割——见下文步骤3.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在阵列布局的背景下编写肽序列程序。SPOT合成仪的程序接受序列的文本格式（每行一个肽序列），该格式可直接通过将2.1.4步骤所得电子表格另存为纯文本文件（不含等位基因名称、氨基酸位置的额外列）获得。 等等。).</li>
	<li>通过SPOT合成仪进行自动多肽阵列合成。该合成的全部操作步骤详见于Kudithipudi等人的研究。21请注意，Fmoc 合成两个阵列大约需要 4 至 5 天。</li>
</ol>
3. 来自单个移植受者时间序列的探针与重复探针抗血清。
注意：600 点膜阵列的尺寸约为 7 cm × 13 cm。合成后，若避光保存，该阵列可作为干燥膜在室温下存放至少两年。为延长使用寿命以供重复使用，请避免过度折叠膜。
<ol>
	<li>用乙醇复水膜阵列，并用Ponceau S染色以观察肽段斑点。
	<ol>
		<li>按照Li优化的逐步程序对载有肽段的膜阵列进行再水化 等24.
		<ol>
			<li>将阵列膜浸入20 mL 100%乙醇中。</li>
			<li>加入20 mL蒸馏水以将溶液稀释至50%乙醇，并在室温下孵育15分钟。</li>
			<li>将浸润液更换为40 mL纯水，重复三次，每次孵育15分钟。</li>
			<li>在适当的缓冲液中洗涤， 例如， 用 TBST（含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水）洗 3 次，每次 20 mL，每次 5 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用丽春红S染色法对芯片进行染色以显示合成肽
		<ol>
			<li>将20 mL预配制的Ponceau S溶液直接加入水化后的阵列中，摇动孵育约30秒。</li>
			<li>持续用蒸馏水冲洗膜以去除背景的丽春红S染色。在此过程中，可能会显现出红色的肽段斑点。</li>
			<li>根据每个供体样本在芯片上的不同区域，小心地沿各区域之间的分界线进行切割，将芯片分隔为独立的部分。标记每块芯片的方向。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预封闭芯片阵列。
	<ol>
		<li>用20 mL含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭膜。该基于牛奶的溶液将进一步褪去Ponceau S染色。多次更换牛奶缓冲液，以获得最清晰的肽条带图像。</li>
		<li>出于记录目的，使用手持相机拍摄阵列的Ponceau S染色图像（示例如下）。 图6).</li>
		<li>在4 °C下用5%脱脂牛奶封闭膜过夜，或在室温下封闭2小时，同时轻轻摇动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将芯片与移植抗血清共同孵育。 
	注意：需注意的是，血清抗体分析中可能因补体依赖性干扰而出现一种称为前带现象或钩状效应（prozone 或 Hook effect）的现象。为避免此问题，可考虑对血清样本进行可选的预处理步骤，使用 EDTA 或通过加热灭活处理。
	<ol>
		<li>第二天去除封闭缓冲液，用 20 mL TBST 洗涤膜 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将20 µL受者粗制血清加入20 mL含2.5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，室温下与膜孵育2–3小时。注意，在此第一轮探针孵育中，建议优先使用时间序列中最后一次移植后血清（即可能致敏程度最高的血清）。该建议基于以下假设：时间序列中较早的样本，特别是移植前时间点的样本，所含同种抗体种类较少，而同种抗体通常随时间推移逐渐产生。由此可最大限度避免信号干扰的可能性 &#34;残留污染&#34; 在探针检测轮次之间，可明确区分出由针对移植物的免疫反应所真正产生的同种异体抗体反应性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 20 mL TBST 洗涤芯片，然后与二抗孵育。
	<ol>
		<li>用洗涤液每次10分钟，共洗涤膜三次。</li>
		<li>在含1%脱脂奶粉的TBST缓冲液中，按1:10,000稀释比例加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗，孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤并显影印迹。
	<ol>
		<li>用 TBST 洗涤膜，每次 10 分钟，共洗三次。</li>
		<li>使用新配制的5 mL 发光素溶液与5 mL 过氧化物溶液混合液进行增强化学发光（ECL）反应，孵育膜1分钟。</li>
		<li>使用合适的成像仪可视化ECL信号（即， ChemiDoc 成像系统或 Azure C600</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描并定量分析印迹。
	<ol>
		<li>保存已显影的图像（图7，下图）并对斑点强度进行定量分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 比较临床时间序列中抗血清的反应性。
<ol>
	<li>剥离膜。
	<ol>
		<li>此时，需始终确保膜保持湿润。</li>
		<li>将膜在 20 mL 商业剥离缓冲液中于 37 °C 孵育 20 分钟，以进行膜的剥离，随后用 TBST 洗涤膜三次，每次 10 分钟。然后使用同一患者在不同时间点采集的另一种血清，重复封闭（步骤 4.2）和探针杂交（步骤 4.3）操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封闭已剥离的膜。 
	注意：剥离后，该膜可用于同一患者在不同时间点采集的另一种血清的再次检测，形成时间序列分析。
	<ol>
		<li>使用 5% 脱脂奶粉缓冲液进行封闭，方法同前（参见步骤 3.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用同一时间序列中的另一种抗血清重新探针杂交（重复步骤 3.3–3.6；示例见图 7 上图）。 
	注意：剥离后的阵列可用于检测另一种血清样本。由于肽段已共价结合于膜的支撑基质上，我们已证实该阵列可重复使用多达 20 次的剥离与重新探针杂交循环，而不会影响其性能。</li>
	<li>阵列的长期保存。
	<ol>
		<li>将膜保存于含有 0.02% w/w 叠氮化钠作为防腐剂的 TBS 缓冲液中。长期保存时使用密封塑料袋。在 4 °C 避光条件下，湿膜至少可保存 2 年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据采集与分析
<ol>
	<li>手动标注阳性抗原肽。
	<ol>
		<li>定位显示阳性抗体信号的点位，并确定每个点位的网格位置。</li>
		<li>在主工作表中高亮标记对应阳性肽的行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从主工作表中提取列出的肽序列（图7，底部列表）。根据步骤1.4.1中所述的设计原则，相邻的连续点位具有显著重叠的序列（15-4=11），因此连续系列中的肽可能共享反应性表位。
	<ol>
		<li>高亮标记连续出现的阳性点位。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定每一系列中各肽的最小表位长度。
	<ol>
		<li>基于反应性肽的重叠片段，高亮标记任何可能共享的表位序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对抗原表位进行结构建模。
	<ol>
		<li>从蛋白质数据库（PDB）获取原型HLA晶体结构，网址如下：http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do。</li>
		<li>在Pymol中显示原型HLA结构（可从www.pymol.org下载）。</li>
		<li>通过高亮反应性肽序列，将发现的抗供者表位映射&#34;或建模至原型HLA分子的三维结构上（图8）。点击&#34;Display&#34;，然后选择&#34;Background&#34;，并选择&#34;White&#34;。如需保存图像，请进入&#34;File&#34;，选择&#34;Save Image As&#34;，并选择文件格式&#34;png&#34;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>报告结果，并将反应性表位分配至相应的等位基因。</li>
	<li>如有数据，将芯片结果与单抗原微球（SAB）结果进行比较。 
	注：使用单一等位基因抗原的SAB检测可测量抗体对固定HLA蛋白组合的反应性。显示抗体反应性的个别肽属于特定HLA等位基因；若这些等位基因也包含在SAB检测面板中，则可实现芯片结果与SAB结果的直接比较。我们先前的研究17表明，两者结果具有高度相关性，提示肽表位对SAB整体反应性具有显著贡献。此外，芯片结果还可揭示氨基酸水平的特异性。
	<ol>
		<li>从提供HLA检测服务的实验室获取SAB结果，以了解供者哪些等位基因对患者移植后血清产生反应。基于步骤5.5的芯片分析结果，也可获得有关对同种抗体反应呈阳性的相应供者等位基因的信息。</li>
		<li>比较SAB结果与芯片结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

未声明利益冲突。

本文所述SPOT阵列的设计旨在对移植过程中针对器官供者HLA抗原的同种抗体特异性进行实验性研究。与目前临床广泛使用的SAB检测方法相比，抗原阵列方法具有设计灵活的主要优势，能够容纳个体供者的实际HLA序列。该新平台充分利用了快速发展的DNA测序技术的潜力，该技术即将能够无歧义地提供准确的HLA等位基因序列读数16,27，以及全球人群中HLA序列的指定数据库资源的潜力15。我们当前的阵列筛选方案是在多项移植血清小规模预实验成功的基础上建立的。在此需要强调的是，现阶段我们的原型阵列仅用于科研目的，尚不适用于临床实践中的诊断应用。
SAB 与我们的抗原阵列之间的另一个显著区别在于，后者具有更高的分辨率，可区分 HLA 序列中 15 个氨基酸片段内的潜在抗原表位，这可能为同种异体抗原性提供有价值的信息18。然而，与 SAB 展示完整蛋白质抗原并保留其折叠结构不同，抗原阵列仅包含短...

在全球范围内常规开展的器官替代治疗已挽救了数百万人的生命。在美国，每年每百万人中约有100人接受实体器官移植，但由于供体器官严重短缺，仍有更多患者在等待名单上（根据器官获取与移植网络OPTN/UNOS提供的信息：optn.transplant.hrsa.gov）。为了减少器官浪费并挽救生命，器官移植受到严格监管，但用于支持这些监管决策的科学工具在有效性方面仍存在局限。例如，科学界已充分认识到HLA分子的高度多态性，并且近年来已开发出利用高分辨率分型和基于序列的分型（SBT）对DNA进行准确基因检测的技术1,2。然而，同种异体抗体检测方法尚未能够将大量个体化的HLA序列作为抗原探针加以利用。目前的标准检测使用一个固定的约包含100种等位抗原的检测组，这些抗原由人类群体中常见的HLA-A、B、C、DQ、DP和DR序列变异体组成3,4,5,6。通常情况下，实际供体的HLA序列并未包含在该检测组中，迫使移植医生和外科医生只能根据供体实际序列与检测组中&#34;标准&#34;序列之间的相似性来推断供体特异性的免疫反应性7,8。因此，有时仅依据抗体检测结果难以可靠地评估排斥反应风险9,10,11,12。因此，迫切需要开发新型的、可个性化定制的同种异体抗体检测方法13,14。
HLA 基因编码主要组织相容性复合体（MHC）受体，在免疫应答中具有关键功能6。已知 HLA 基因是人类基因组中多态性最高的基因6。由于 HLA 基因的 DNA 测序技术迅速发展，新的等位基因变异体（或简称为等位基因）正以爆炸性的速度被发现15,16。截至 2017 年 3 月，已有 16,755 个经过验证的等位基因被提交至 IMGT/HLA 数据库（http://www.ebi.ac.uk/ipd/index.html），其中 12,351 个属于 I 类，4,404 个属于 II 类。与此形成鲜明对比的是，在常规用于检测器官移植中同种异体抗体的标准单抗原珠（SAB）检测中，仅包含了略多于 100 种不同的等位基因。SAB 方法基于 Luminex 平台，利用流式细胞术进行检测。由于该检测使用一组固定的抗原（除生产过程中微小的批间差异外），因此抗血清检测可在不同个体和不同实验室之间实现稳健的标准化5。然而，当供体序列未包含在 SAB 检测组合中时，该方法无法检测到针对供体等位基因特异性产生的全部同种异体抗体。尽管根据真实序列定制生产供体抗原是理想方案，但在优化必要的生产与检测流程方面仍存在技术挑战。
我们最近在一项关于肾移植受者可行性的研究中描述了一种替代方法17。该方法采用肽抗原以阵列形式检测个体受者移植前和移植后的血清。每个阵列均使用SPOT合成法18,19,20,21,22,23定制构建，所生成的肽抗原长度均为15个氨基酸，完全基于相应器官供体的HLA等位基因A、B、C、DQA1、DQB1和DRB1。SPOT合成采用标准Fmoc化学法在纤维素膜上进行22，可通过全自动机器人系统并行合成数百种定制肽19,21。该膜阵列可耐受多轮剥离和重复检测循环。在我们的回顾性研究中17，我们利用系列时间点采集并储存的移植后抗血清，检测到抗原模式的变化（即移植前后）。本文中，我们描述了该工作流程的技术方案，包括阵列设计、制造、抗血清检测及结果分析。该方法旨在检测针对移植供体HLA分子上特定线性表位的同种异体抗体。

<table><tbody><tr><td>肽阵列</td><td>INTAVIS Bioanalytical Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>丽春红S溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1706404</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>10711454001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗人IgG&amp;ndash;HRP&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A18811</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL 底物</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Restore Western Blot 洗脱缓冲液</td><td>Thermo Scientifics</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 凝胶成像系统</td><td>Bio Rad Laboratories</td><td>1708265&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

用于器官移植中hla同种抗体检测的个性化肽阵列

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

在器官移植中，移植物的功能和长期存活能力在很大程度上依赖于对针对人类白细胞抗原（HLA）的免疫排斥反应的有效控制。组织相容性指南基于实验室对抗HLA免疫反应的检测，这种免疫反应表现为预先存在或de novo产生的HLA抗体，构成移植的主要障碍。目前的检测方法基于单抗原珠（SAB）平台，使用一组固定的约100种预先选定的重组HLA抗原来检测移植受者的血清。然而，在人类中存在远为多样的HLA类型，除同卵双胞胎外，没有任何两个个体具有完全相同的HLA序列组合。尽管HLA分型和直接测序等先进技术能够精确捕捉供者与受者之间HLA DNA序列的任何差异，但由于SAB检测平台所涵盖的序列种类有限，无法精确检测针对供者HLA错配的特异性同种异体抗体。我们致力于开发一种基于不同技术的互补方法，以个性化方式检测和表征抗供者HLA抗体。该筛查工具是一种定制的肽阵列，包含源自供者HLA序列的多肽，用于检测器官受者移植后的血清，以评估抗体介导排斥反应的风险。针对一对供者-受者，单个阵列上可合成多达600条独特的多肽，每条多肽在15个氨基酸序列中至少含有一个错配残基。在初步实验中，我们比较了移植前后血清在这些阵列上的抗原反应模式，能够以高分辨率检测到抗HLA信号，并进一步精确定位所涉及的免疫表位。这种个性化的抗原阵列为器官移植中供者特异性HLA表位的高分辨率检测提供了可能。

在最初使用芯片筛选方法的研究中17，我们共纳入了5名肾移植受者。我们获得了该队列及其相应供者的HLA分型结果，同时掌握了他们的病史以及SAB检测中的等位基因特异性抗体滴度数据。在针对这5例患者的初步研究中，我们设计了两种不同的方法：一种是包含固定肽段组合的标准芯片，另一种是为每对供者-受者个体化定制的个性化芯片。尽管第一种方法在技术上验证了芯片平台在单个移植案例中实现高特异性的能力，但本文及配套视频重点描述了后一种方法的个性化方案，旨在对供者特异性抗体（DSA）进行全面筛查，而DSA通常与移植物不良预后相关5,25,26。
个性化肽阵列已应用于五例病例中的两例17，为说明该...

器官供者与受者之间人类白细胞抗原（HLA）序列的不匹配是器官移植中抗体介导排斥反应的主要原因。本文介绍了基于个体供者HLA序列的定制抗原芯片，用于检测器官受者体内针对供者HLA的同种异体抗体。

用于器官移植中HLA同种抗体检测的个性化肽阵列

在器官移植中，移植物的功能和存活时间在很大程度上依赖于对针对移植物的免疫排斥反应的有效控制……

这种用于同种抗体检测的定制芯片方法的总体目标是阐明器官移植中的人类白细胞抗原（HLA）表位。该方法有助于解答器官移植领域中的关键问题，例如移植排斥反应中涉及的特异性免疫表位。该技术的主要优势在于其完全可定制性，能够整合个性化的抗原组合，从而反映个体器官供体的HLA序列。该技术有可能检测针对同种异体抗体的特异性HLA表位。要从国际免疫遗传学项目人类白细胞抗原数据库中检索序列，请在模糊等位基因组合页面中，打开数据库等位基因查询表单，并将受试者的第一个等位基因名称输入搜索框中。点击“立即搜索等位基因”，并在屏幕上找到匹配的等位基因名称。点击“等位基因”，并将蛋白质序列复制粘贴到文本文件中，在等位基因名称标题行下方排列，以FASTA格式组织等位基因名称与序列。当所有序列均已确定后，将FASTA格式中的序列复制并粘贴至Cluster Omega网站的“输入序列”框中，使用默认参数设置，点击“提交任务”，然后点击“提交”。将显示序列比对结果。为了标记供体特异性的错配位点，将比对文本复制粘贴到一个新的文本文件中，并使用特殊的字体颜色标出比对序列中仅属于供体的每个供体特异性错配残基。在供体序列中，对所标记的供体特异性错配位点上下游各延伸14个残基范围内的所有字母进行下划线标注，并以这些带下划线的序列作为模板，依次生成一系列相互重叠4个残基的短序列，每个短序列长度为15个氨基酸。将这些15个氨基酸序列复制并粘贴到电子表格中，以列格式排列，并添加标注列，包含相应供体等位基因的名称。为设计自定义阵列布局，生成一个包含肽序列及其相应等位基因标注的电子表格，共20行30列。然后将序列输入至阵列的每个点位，并使用点阵合成仪进行自动化肽阵列合成。设计芯片时，必须使用个体供体的HLA序列作为模板来确定抗原集合。芯片合成后，用20毫升含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tris缓冲盐水加0.1%吐温20）封闭膜，适当振荡孵育。随后，用20毫升新鲜TBST缓冲液洗涤膜三次，每次5分钟，接着在室温下用2.5%脱脂奶粉TBST溶液中的20微升粗提受体血清孵育两到三小时。孵育结束后，用TBST缓冲液洗涤膜三次，每次10分钟，随后将膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG二抗在室温下孵育两小时。用TBST缓冲液再洗涤三次，每次10分钟，以去除未结合的二抗，然后将膜置于5毫升新配制的鲁米诺溶液和5毫升过氧化物溶液中进行显色。一分钟后，使用合适的成像仪检测增强化学发光信号。保存显影后的图像后，将膜在37摄氏度下用20毫升商用洗脱缓冲液孵育20分钟，随后在TBST中洗涤三次，每次10分钟。然后按照前述方法，使用同一位患者在不同时间点采集的血清样本对膜进行封闭、重新探针杂交和显影。为手动标注阳性抗原肽，需在保存的显影图像文件中定位具有阳性抗体信号的斑点，并确定每个斑点的网格位置。然后从主工作表中提取肽段序列，根据反

personalized-peptide-arrays-for-detection-hla-alloantibodies-organ

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

个性化肽阵列在器官移植 HLA 抗体检测中的研究

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

本视频展示了一种用于检测器官移植受者体内抗供体 HLA 同种异体抗体的实验方法。合成肽阵列以代表可能引起抗体介导的器官排斥反应的表位。将该阵列与受者血清孵育，血清中的同种异体抗体将结合其靶向表位。通过化学发光法检测抗体结合情况，从而鉴定引发同种异体抗体反应的供体特异性 HLA...

基于肽阵列的器官移植受者抗供体HLA同种抗体检测

本视频展示了一种应用多肽微阵列技术来分析识别组蛋白多肽上翻译后修饰（PTM）的抗体特异性的方法。将含有已知PTM组合的固定化荧光染料标记组蛋白多肽的微阵列芯片与靶向PTM特异性抗体孵育。该过程有助于确定抗体对靶标PTM的特异性及其与非靶标PTM之间潜在的交叉反应性。...

一种用于抗体特异性分析的多肽微阵列技术

使用重组人MHC II分子进行生化检测，可快速、定量地获得有关免疫原性表位鉴定、去除或设计的信息。 本文描述了一种适用于384孔板的肽-MHC...

一种用于多肽表位定量分析的高通量MHC II类分子结合检测方法

完整的I类HLA/肽复合物由癌细胞释放，可能成为一种重要的癌症生物标志物。利用无标记传感器技术和模拟T细胞受体的单克隆抗体，本研究展示了在MDA-MB-231细胞上清液、添加了目标物的人血清以及患者血浆中检测释放的MIF/HLA-A*02:01复合物的方法，从而为开发一种新型癌症诊断平台提供了可能。...

利用无标记生物传感器技术检测乳腺癌中的人类白细胞抗原生物标志物

本文介绍了一种用于产生和扩增特异性针对特定同种异体抗原的人T细胞克隆的方法。该方案可经调整后用于克隆针对多种肽-MHC复合物配体的特异性人T细胞。...

从外周血中生成人同种异体抗原特异性T细胞

本文介绍一种可生成定制化抗原微阵列的方法，可用于同时检测人和小鼠血清中的IgG和IgM自身抗体。该阵列可实现针对任何目标抗原或表位的抗体高通量、定量检测。...

同时检测IgG和IgM自身抗体的双色抗原微阵列的制备

在此，作者介绍了一种利用纯化的单克隆抗体，通过点印迹杂交结合肽段扫描来确定线性抗原表位的简单且高效的方法。所鉴定出的表位可进一步用于治疗和诊断应用。...

借助肽扫描技术鉴定单克隆抗体识别的线性B细胞表位

本文描述了将肽微阵列技术应用于识别组蛋白及其翻译后修饰的抗体特异性分析的方法。...

利用肽微阵列分析组蛋白抗体特异性

本文介绍了一种从小鼠和人类细胞系中纯化MHC...

免疫肽组学：小鼠和人类MHC I类和II类相关肽段的分离及其质谱分析

了解个性化肽阵列技术在器官移植中检测供体特异性HLA抗体的定制化方法。该技术利用个体供者的HLA序列设计抗原组合，提高抗体检测准确性，有助于深入理解移植排斥反应中的免疫应答机制。

用于器官移植中HLA同种抗体检测的个性化肽阵列

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