Name: 高分辨率荧光原位杂交在果蝇胚胎和组织中使用 Tyramide 信号放大 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: 学习使用酪胺信号放大技术进行高分辨率荧光原位杂交，在果蝇胚胎和组织中检测RNA的空间分布。该方法具有高灵敏度、高分辨率且成本低廉，适用于细胞生物学和发育生物学研究。

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本项目获得了加拿大卫生研究院（资助号 MOP 133473）向 HMK 提供的资助支持。

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</ol>

作者无竞争性财务利益。

本方案提供了一种高度可重复、灵敏且经济的方法，用于检测固定后的黑腹果蝇（Drosophila）胚胎或组织中的大多数RNA。尽管该方法在操作上略比传统常用的碱性磷酸酶探针检测法复杂，但荧光原位杂交（FISH）所获得的分辨率显著更高，且灵敏度相当或更优7,8。通过使用完整的或部分的微孔板，该方案可适用于对目的基因进行大规模或有限范围的分析。需要注意的是，所生成的探针可能会检测到全部或多种转录本剪接形式，除非探针设计具有更高特异性（例如针对单个外显子）。尽管我们已成功使用小至200个核苷酸的探针，但更小的探针通常效果较差，且特异性可能降低。显然，本方案不适用于小内含子、外显子或成熟微小RNA（microRNA）的检测。
尽管该方法利用酶促反应步骤来增强信号强度，但信号强度在较宽范围内与靶基因表达水平呈相对线性和成比例的关系。在较高放大倍数下，信号表现为细胞和组织内的点状或斑点状结构。对于相对稀有的转录本，仅能观察到少数微小的点状信号。随着转录本丰度的增加，这些点状信号的数量和尺寸也随之增加。与单分子FISH（smFISH）类似，单个微小的点状信号也可能对应单个RNA分子，可通过成像和生物信息学软件进行便捷的定量分析。将已发表的smFISH图像与我们针对相同靶标整理的图像进行比较，表明两种方法在总体灵敏度和分辨率方面相对接近，尽管仍需更严格的比较来进一步验证。鉴于smFISH的成本显著更高，本文所提供的方法可在成本大幅降低的情况下实现相似的实验效果。然而，若目标是检测较小的转录本或转录本的不同区域，则建议使用smFISH方法。
由于某些FISH探针尺寸较小，该方法在穿透较大组织或具有显著屏障的组织方面可能更具优势。然而，我们通过提高去污剂浓度以及优化组织固定和通透步骤，似乎已解决了这一问题。最后，尽管该方法是为 果蝇 组织，此处所述用于解剖组织的高去垢剂缓冲液也应适用于 果蝇 胚胎以及其他大多数生物体和组织。

诸如RNA测序（RNA-seq）等新的全基因组RNA检测方法极大地拓展了我们对基因表达时间、表达位置以及表达水平的认识1。然而，这些方法在时间和空间分辨率上相对有限。RNA原位杂交技术能够在固定组织中直观观察转录本的空间分布，从而揭示基因表达在细胞内及亚细胞结构中的精确定位细节2。采用荧光原位杂交（FISH）技术可实现更高的空间分辨率，因为它能够结合共聚焦显微镜和光片显微镜等先进的显微成像技术进行分析3。此外，还可使用DAPI等荧光标记物来确定亚细胞结构之间的空间关系4。FISH技术还支持同时检测多种RNA和蛋白质，并清晰显示它们在亚细胞水平上的共定位情况。有关双标记实验所需的特异性试剂和操作步骤，可参见以下文献3,5。
本文所述实验流程在所有步骤中均使用96孔微孔板，包括cDNA模板制备（菌落PCR）、RNA探针制备（利用T7、T3或SP6聚合酶依赖的截短转录）、原位杂交以及荧光信号的显色。每个96孔板的孔中加入足够数量的胚胎或组织，以便评估结果的一致性和变异性。每个孔分别加入不同的探针。在信号显色完成后，将各孔中的胚胎或组织分别排列在独立的显微镜载玻片上，用于显微分析。
使用酪酰胺信号放大（TSA）进行探针检测可产生具有优异亚细胞分辨率的强信号 5,6,7,8RNA的亚细胞定位是一种重要的调控机制 9 似乎在几乎所有RNA中都会发生的现象 4,10,11这些分析还表明，许多通过RNA测序无法检测到的转录本，使用FISH可轻松检测到。 8RNA的适应性 原位 96孔板杂交可同时分析多达96个目标基因（若使用更多孔板则数量可进一步增加），使得大规模数据集的分析成为可能。通过将孔板切割为较小片段，该方法也可轻松适用于少量样本。所提供的实验方案适用于大多数类型组织中RNA分布的分析。尽管未在此展示，该方法同样可适用于非黑腹果蝇 组织也是如此。

<table><tbody><tr><td>15 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Frogga Bio</td><td>TB15-500</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>含染料的2x PCR预混液（Ambiogene）</td><td>Biomart（加拿大）</td><td>141106-1K</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>50 ml 聚丙烯圆锥形离心管</td><td>Frogga Bio</td><td>TB50-500</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>96孔过滤板（1.2 μm，亲水性PVDF膜）</td><td>EMD MILLIPORE</td><td>MSBVS1210</td><td>用于移除底部带有漂浮组织的培养板中的液体</td></tr><tr><td>96孔PCR板（200 &amp;mu;l)</td><td>丹维尔</td><td>C18096-10</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 注射器滤器（0.2 μ）</td><td>PALL</td><td>PN4612</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 注射器滤器（0.45 μ）</td><td>PALL</td><td>PN4614</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Bioshop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>AXYGEN 96孔检测储存板</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P96-450V-C</td><td>保存细菌甘油菌种</td></tr><tr><td>AXYGEN 铝膜板封膜</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-PCR-AS-200</td><td>封板</td></tr><tr><td>AXYGEN 宽口吸头（200 µl）</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-T205-WB-C</td><td>转移样品</td></tr><tr><td>生物素-SP（长链间隔）IgG组分单克隆小鼠抗地高辛</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>200062156</td><td>原位一抗（储存浓度 1 mg/ml，工作浓度 2.5 &amp;mu;g/ml 或 1/400 稀释度。</td></tr><tr><td>BRAND 8通道多联管（可高压灭菌）</td><td>BrandTech Scientific Inc.</td><td>704526</td><td>去除96孔PCR板顶部的液体</td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>储存浓度 34 mg/ml，溶解后经 0.2 μm 滤膜过滤&amp;mu;m 经 100% EtOH 过滤（使用时按 1/1000 比例稀释）</td></tr><tr><td>Cy3酪胺（Cy3-TSA）</td><td>自制</td><td></td><td>可从 Perkin-Elmer 公司订购，货号 SAT704A001EA</td></tr><tr><td>DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2522</td><td>封片剂中的抗荧光淬灭试剂</td></tr><tr><td>地高辛-11-尿苷-5&amp;rsquo;-三磷酸盐</td><td>罗氏</td><td>11-209-256-910</td><td></td></tr><tr><td>胚胎收集笼</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>尺寸：75 cm × 75 cm × 75 cm，由聚甲基丙烯酸甲酯制成</td></tr><tr><td>Eppendorf 离心机 5804</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5804</td><td>用于A-Z-DWP转子的96孔板离心机</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Bioshop</td><td>FOR001.500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Bioshop</td><td>GLY002.4</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bioshop</td><td>GLN001.500</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4784-250MG</td><td>储备液：50 mg/ml；工作浓度：在杂交溶液中为1 mg/ml</td></tr><tr><td>Lab Armor 珠</td><td>DiaMed</td><td>LAA42370-001</td><td>填充加热装置</td></tr><tr><td>Labnet Gyro M Mini 旋转混匀仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-998-347</td><td>样品混匀</td></tr><tr><td>筛网 - 100 微米</td><td>FlyStuff</td><td>57-103</td><td>用于收集胚胎</td></tr><tr><td>筛网——800 微米</td><td>SEFAR - Nytex</td><td>06-780/53</td><td>用于捕获松散组织／可用于图4中的特殊管子。</td></tr><tr><td>微型盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td>尺寸：22 × 22 mm</td></tr><tr><td>微载玻片，frstd</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>尺寸：25 X 75 mm</td></tr><tr><td>多孔板真空 manifold</td><td>Pall Corporation</td><td>P/N 5017</td><td>从96孔滤板底部移除液体</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Bioshop</td><td>PAR070.500</td><td>固定</td></tr><tr><td>PCR仪</td><td>Bio-Rad</td><td>型号：DNA Engine PTC-200</td><td>96孔板PCR及探针变性</td></tr><tr><td>苦味酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80456</td><td>组织固定液 I 溶液</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Bioshop</td><td>POC308</td><td></td></tr><tr><td>96孔板用聚丙烯盖，每箱100个</td><td>UltiDent Scientific</td><td>24-P-LID-PP</td><td>用于储存培养板的盖子</td></tr><tr><td>Progene 一次性试剂储液槽（50 ml，无菌）</td><td>UltiDent Scientific</td><td>825-1-50-5S</td><td>液体处理</td></tr><tr><td>Progene 可穿刺铝箔</td><td>UltiDent Scientific</td><td>87-CFILM-AL</td><td>密封无 DNase 和 RNase 的 96 孔板</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308-5MG</td><td>胚胎通透化</td></tr><tr><td>RiboLock 核糖核酸酶抑制剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EO0381</td><td>40 单位/微升</td></tr><tr><td>核糖核苷三磷酸（NTP）试剂组</td><td>罗氏</td><td>11277057001</td><td>RNA探针合成</td></tr><tr><td>RNase-free 水</td><td>GIBCO</td><td>10977015-500ml</td><td>RNA探针合成</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td>去除 RNase 污染</td></tr><tr><td>鲑鱼精细胞来源的单链DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9156</td><td>杂交溶液</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Bioshop</td><td>SKI400.500</td><td>工作浓度为1%（溶于1×PBT或PBTT）作为封闭试剂</td></tr><tr><td>3 M 醋酸钠（NaOAc），pH=5.2（无RN酶）</td><td>Bioshop</td><td>SAA333</td><td>工作浓度为10%（v/v），用于DNA或RNA沉淀</td></tr><tr><td>SP6 RNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EP0131</td><td>20 单位/微升</td></tr><tr><td>用于沙浴的不锈钢丸粒</td><td>VWR</td><td>13259-274.</td><td>填充加热装置</td></tr><tr><td>体视显微镜 &amp;和鹅颈灯源</td><td>Leica</td><td>型号：MZ6</td><td>组织解剖与封片</td></tr><tr><td>链霉亲和素-辣根过氧化物酶（HRP）结合物</td><td>分子探针</td><td>S911</td><td>二抗原液：1 mg/ml，使用时按1/1000稀释（1 &amp;mu;g/ml）用于原位。</td></tr><tr><td>T3 RNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EP0101</td><td>20 单位/微升</td></tr><tr><td>T7 RNA聚合酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>EP0111</td><td>20 单位/微升</td></tr><tr><td>加样站（10 μl）</td><td>Axygen</td><td>T-300-STK-S</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>提示站（200 μl）</td><td>索尔比奥</td><td>27770T</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>提示（1毫升）</td><td>索尔比奥</td><td>10200</td><td>经认证无DNase和RNase</td></tr><tr><td>TRITON X-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td>工作浓度为 0.3% 的 1 X PBT 溶液，用于组织原位实验</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td>工作浓度为0.1%，溶于1×PBT，用于胚胎原位杂交</td></tr><tr><td>Whatman 定性滤纸，3号</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1003917</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;强&gt;准备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷）甘油抗荧光淬灭封片剂</td><td></td><td></td><td>DABCO（1.25 g）、甘油（35 ml 或 v/v 70%）和 1× PBS（15 ml 或 v/v 30%）。避光，于冷室中轻轻摇动，储存于 -20 ℃ &amp;deg;C</td></tr><tr><td>1 × PBT（1 L）</td><td></td><td></td><td>1 × PBS 加 1 ml 吐温 20（0.1 %）</td></tr><tr><td>1 × PBTT（1 L）</td><td></td><td></td><td>1 × PBS，含 1 ml 吐温-20（0.1%）和 3 ml 曲拉通 X-100（0.3%）</td></tr><tr><td>1 X PBTB（1L）</td><td></td><td></td><td>1 % 脱脂牛奶溶于 1 X PBT</td></tr><tr><td>1 × PBTTB（1 L）</td><td></td><td></td><td>1 % 脱脂牛奶溶于 1 X PBTT</td></tr></tbody></table>

高分辨率荧光 原位 杂交 果蝇 使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

在我们致力于确定表达模式及亚细胞定位的过程中 果蝇 在全基因组范围内以及多种组织中对RNA进行分析，我们对最初的荧光方法进行了大量改进和优化 原位 杂交（FISH）实验方案。为提高通量并降低成本，从探针制备到信号检测的所有步骤均在96孔微孔板中进行。使用cDNA克隆或基因组DNA作为模板，合成地高辛（DIG）标记的反义RNA探针。组织经固定和通透处理后，探针与目标转录本杂交，随后通过一系列试剂进行检测：首先使用与生物素偶联的抗DIG抗体，接着使用与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的链霉亲和素，最后使用荧光标记的酪胺。在HRP存在的情况下，荧光酪胺产生一种高反应活性的中间产物，可与邻近蛋白质中电子密度较高的区域共价结合。该信号放大与定位步骤可产生强而高度局限的信号，有助于实现转录本在细胞水平及亚细胞水平的精确定位。所提供的实验方案已针对多种组织类型和发育阶段进行了优化，可获得高度特异性的信号。文中还提供了相关参考文献，介绍若干改进方案，可用于同时检测多种转录本，或同时检测转录本与蛋白质。

图6 展示了使用该程序获得结果的示例。上方3个图示为早期 果蝇 胚胎（图6，图A-C），接下来的3个图展示了晚期的示例 果蝇 在不同组织中呈现信号的胚胎（分别为羊膜血清层、肌肉和中枢神经系统）图6，图 D-F）。接下来是三龄幼虫组织的示例（图6，图G-J）。图K和L分别显示成年性腺（卵巢和睾丸）的代表性图像。已有数百张图像上传至我们可搜索的“荧光”数据库并完成注释。 原位 果蝇数据库（FlyFISH（http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca））。
<img alt="*果蝇*中RNA FISH的工作流程示意图；原位杂交过程示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 荧光示意图 原位 杂交（FISH）方案及关键设备 （A） cDNA 的 PCR 扩增 （B） 体外 在96孔板中进行转录以生成基因特异性的地高辛标记的反义RNA探针（b图显示该板的照片）。 (C) 和 (D)： 成虫（雌:雄比例为2:1，每瓶300–400只果蝇）允许交配3–4天。在标准玉米粉培养基上收集过夜的胚胎，用于后续实验。 25 °C 转移到通风良好的塑料盒中（容器尺寸：8" × 8" × 3" 长×宽×高，内含1 L玉米粉培养基）或转移至新瓶子中，保持适当的幼虫密度。为进行组织收集，应在产卵后24、48小时在培养基表面撒上活性干酵母粉。 （E 至 H）： 荧光 原位 连续3天进行杂交实验。对于不漂浮的胚胎或组织，使用96孔PCR板（如图b所示），并配合8通道移液器（如图c所示）进行操作。对于漂浮的组织（如大多数幼虫组织），使用带滤膜底部的板（如图d所示），并通过多通道负压抽吸装置在较低压力下从底部去除液体（如图e所示）。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="凝胶电泳图解，DNA-RNA探针分析，分子分离，条带大小标记" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. RNA探针产量的测定 新合成的反义RNA探针在1%琼脂糖凝胶上观察到（5 µL/lane）。根据条带强度，产量可分为：第3和10泳道为“低产量”，第1、4、5、6和8泳道为“典型产量”，第2、7、9、11和12泳道为“高产量”。对于“典型产量”的样品，使用10-15 µL 探针稀释于 100 µL 每份杂交溶液 原位 实验。根据探针条带强度相对于“典型探针”强度的情况，将“高产量”探针样品用额外的杂交溶液进行稀释。目标是使每个孔中的最终探针浓度大致相等。箭头指向其中一个“RNA探针”，每条泳道中较高的条带为原始DNA模板。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎处理工作流程图，显示步骤：收集、去壳、清洗、固定、去卵黄膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 大规模胚胎收集与固定的各个主要步骤。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于样本处理的离心管装置，配有漏斗和带刻度的测量部件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 用于去除幼虫或漂浮组织中液体的自制管装置。 某些幼虫和成体组织在固定过程中会漂浮于溶液中。该简易工具由一个200 µL截断的枪头固定尼龙滤网，并连接一个1 mL枪头作为适配器，以便连接抽吸装置。通过此方法可安全去除液体，同时不会丢失任何组织。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA杂交过程、HRP偶联物示意图、荧光素TSA、多肽相互作用" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5. 酪胺信号放大技术。 （1）DIG标记的反义RNA探针与内源性有义RNA杂交。（2）生物素偶联的一抗与DIG-UTP发生免疫亲和结合。（3）HRP标记的链霉亲和素结合生物素。（4）HRP催化Cy3-酪胺与过氧化氢反应，生成短寿命的Cy3-酪胺自由基。（5）Cy3-酪胺自由基与邻近蛋白质上的酪氨酸残基共价结合。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜示意图，显示不同细胞环境中带有标记细胞核的基因表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56281/56281fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 典型示例 原位 杂交图像。 每个图板展示了一种不同的RNA（以青色显示）和用DAPI染色的细胞核（以红色显示）。（A-C）早期的示例 果蝇 胚胎。（D，F）晚期示例 果蝇 胚胎。（G-J）三龄幼虫示例 果蝇 幼虫组织（分别为马氏管、中肠、唾液腺和肌肉）。(K) 成虫卵巢。(L) 成虫睾丸。每个图示均显示探针所杂交的基因名称。比例尺 = 10 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56281/56281fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

所描述的RNA 原位 杂交方案可实现对完整组织中RNA的检测 果蝇 胚胎或解剖组织。利用96孔微孔板和酪胺信号放大技术，可实现高分辨率、高灵敏度、高通量且相对低成本的转录本检测。

在我们致力于确定果蝇RNA在全基因组范围内以及多种条件下的表达模式和亚细胞定位的过程中，……

本实验的总体目标是在细胞和组织中原位检测 RNA 转录本。该方法有助于回答细胞生物学和发育生物学领域中的一些关键问题，例如 RNA 在细胞、组织或胚胎内部的具体位置。该技术的主要优势在于，它能够以高分辨率和高灵敏度检测 RNA 的空间分布，且相较于其他方法成本较低。我们最初开发该实验方案旨在尽可能研究黑腹果蝇（Drosophila）RNA的亚细胞分布情况，以确定其亚细胞分布的广泛程度和多样性。项目初期我们使用胚胎作为研究材料，随后对该方案进行了改进和优化，使其适用于高通量分析从幼虫和成虫中分离的各种组织。该实验流程中最困难的部分在于步骤较多，容易出错，同时需要确保探针制备过程中不存在 RNAs。为了提高通量并降低成本效益，本视频演示的实验流程在所有步骤中均使用 96 孔微孔板。通过将微孔板切割成 8 孔或 12 孔条带，该方法也可轻松适用于较小的样本量。在新的96孔PCR板的每个孔中，将10微升过夜培养的细菌培养物加入90微升经高压灭菌的双蒸水中进行稀释。在热循环仪中于95摄氏度下变性DNA，持续5分钟。随后立即将PCR板置于冰上，至少放置5分钟。在新的96孔PCR板中设置PCR反应。使用相应的通用引物，并将48 µL的PCR预混液分装至每个孔中。每孔加入2 µL变性的质粒DNA模板。在96孔PCR仪中进行扩增。扩增完成后，用乙醇-醋酸钠混合液沉淀PCR产物。将样品在负80摄氏度下保存30分钟。将96孔板在4°C条件下以2,250 × g离心45至60分钟。使用八通道真空吸液装置移液器（其结构可防止吸头在吸取沉淀时接触孔底），小心移除上清液。用160 µL冰冷的70%乙醇洗涤一次。在4°C条件下，以2,250 × g离心10分钟。将96孔板轻轻倒置在纸巾上，以去除每孔中残留的液滴，并在室温下将DNA沉淀晾干1小时。用25 µL无RN酶的水重悬沉淀的DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小和产量。在新的96孔PCR板中，向每个孔加入相应的组分，以建立体外转录反应。向每个对应的孔中加入7.5 µL DNA模板。用封板膜覆盖培养板，在37摄氏度下孵育3.5至4小时。随后，向每个孔中加入一种主混合液，该混合液由经DEPC处理的双蒸水、100%乙醇和3摩尔的醋酸钠组成。在 -80 摄氏度下保存 30 分钟。离心微孔板，并如前所述洗涤各孔。将沉淀的探针重悬于 25 µL 经 DEPC 处理的双蒸水中。新合成的反义RNA探针通过1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和产量。根据条带强度，产量可被判定为低产量、典型产量或高产量。在使用5微升每种探针进行琼脂糖凝胶电泳后，将剩余的20微升与100微升杂交溶液混合，于-80摄氏度保存，待需要时使用。开始此操作时，将20至30条幼虫放入含有冷PBS固定液的培养皿中，冰上放置两分钟以降低幼虫活动性。在解剖显微镜下解剖幼虫。使用一对锋利的镊子小心打开幼虫前端，并从后向前挤压组织。最多15分钟后，将解剖的组织转移至1.5毫升离心管中用于固定，并置于冰上。去除PBS，加入800 µL固定液一（fix one solution）。与其他先前采集的待固定组织一起，在台式混合器上室温孵育30分钟。用 800 微升 PBTT 冲洗组织一次，并将试管置于冰上，同时继续收集和固定其他组织。将所有解剖得到的组织汇集到一个含有带网孔盖子的 15 毫升塑料管中。通过管盖上的网孔吸除多余液体。用10毫升PBTT洗涤，并用10毫升PBS冲洗。为淬灭内源性辣根过氧化物酶活性，加入5毫升含0.3%过氧化氢的PBS溶液，室温孵育15分钟。用10毫升PBTT洗涤两次。加入10毫升预冷的80%丙酮，于-20°C孵育10分钟，以对组织进行透化处理。用10毫升PBTT缓冲液洗涤两次，以重新水化组织。按照文本方案中所述洗涤组织后，将组织保存于杂交溶液中，置于-20°C。若次日不再使用，应将滤器组件更换为普通盖帽。将组织分装至冰上的96孔PCR板中，每孔约20微升。使用八通道多联移液器，从组织中移除杂交溶液。向每个孔中加入 100 微升新鲜变性的杂交溶液，并用封口膜密封。使用含有金属珠的干浴加热仪，在 56 摄氏度下对组织进行预杂交，时间至少为 2.5 至 3 小时。在 96 孔 PCR 板中，于 80 摄氏度下对 100 微升制备好的探针变性 5 分钟。立即将样本置于冰上冷却5分钟。移除组织中的预杂交溶液，向每个样本中加入变性的基因特异性探针。用铝箔封膜覆盖，于干式恒温仪中56摄氏度下在金属珠中杂交16至18小时，过夜进行。在开始探针检测程序之前，将所有所需溶液在56摄氏度的加热装置中预热。小心地将已杂交的组织转移至适合多孔板真空 manifold 的96孔板中。这些板的孔具有膜质底部，可在真空条件下移除孔内液体。从96孔板中取出探针，并按照本表所示步骤，在56摄氏度加热装置中用杂交溶液与PBTT的混合液清洗样本。第三次用PBTT洗涤后，将96孔板从加热装置中取出，移除PBTT溶液，并在室温下用PBTTB在台式混合器上封闭组织20分钟。每孔加入100 µL抗体溶液，在台式样本混合器上孵育2小时。按照文本方案中所述用PBTTB冲洗后，每孔加入100微升链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液，在室温下孵育1.5小时。用PBTTB洗涤两次，每次洗涤5分钟。随后，按照文本方案中所述，用DAPI溶液孵育组织。开始此操作时，先将样品与酪胺溶液共同孵育，并在避光条件下于台式混合器上孵育两小时。孵育完成后，从组织中移除酪胺溶液。按照文本方案中所述，用PBT和PBS洗涤后，每孔加入150 µL抗荧光淬灭封片剂。将样本在 4 摄氏度下放置过夜，使组织沉降至孔板或离心管底部。次日，将样本置于显微镜载玻片上，并加盖盖玻片封片。最后，使用荧光显微镜对样本进行成像。图中显示了使用本方法获得的早期果蝇胚胎和晚期果蝇胚胎的结果示例，晚期胚胎的信号位于羊膜血清层、肌肉和中枢神经系统。每张图中标注了探针杂交所针对的基因名称。接下来是三龄幼虫组织的示例，包括马尔皮基管、中肠、唾液腺和肌肉。最后展示了成年卵巢和成年睾丸的代表性图像。一旦掌握并高效操作，该技术可在短短两天内完成。在进行此操作时，务必记住应在无RNase的实验台操作，使用无RNase的枪头、离心管、培养板和溶液，并佩戴手套。如果处理的样本或探针数量较多，切勿仓促操作。同时，建议采用一些辅助方法，以免遗漏操作步骤或混淆位置。在执行本方案时，还可与其他方法结合使用，例如多重探针检测、探针与蛋白质或细胞标记物的联合检测。利用这些方法，您可以回答更多问题，例如相对表达模式、细胞及亚细胞区室的身份，以及在不同遗传背景或疾病中的效应。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在任何类型的组织或胚胎中进行大多数类型的原位杂交实验。请注意，甲醛、过氧化氢和甲酰胺等试剂均具有极高危险性，在操作过程中务必采取适当的处理和处置预防措施。

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高分辨率荧光原位杂交果蝇使用酪酰胺信号放大法的胚胎与组织检测

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