Name: 激光内在人肺组织中的新型细菌特异探针的光学筛选 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 了解利用光纤共聚焦荧光显微镜在离体人肺组织中快速筛选细菌特异性光学探针的方法。该技术可评估新型光学化合物的靶向特异性与可检测性，为临床感染成像提供可转化的筛选方案。

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我们感谢英国工程与自然科学研究理事会（EPSRC，英国）跨学科研究合作项目（Interdisciplinary Research Collaboration）资助 EP/K03197X/1、英国卫生部以及惠康信托基金通过健康创新挑战基金（HICF）提供的资助。资助参考编号：0510-069。

所有人体肺组织均在获得知情同意后获取，且本研究已获地区伦理委员会批准。
1. 生物样本的制备
<ol>
	<li>探针的制备
	<ol>
		<li>配制每种探针的1 mM储存液（例如，钙黄绿素AM，UBI-3，UBI-10， 等等。) 于无菌去离子水（dH₂O）中2O，使用精密天平称量冻干探针化合物11. 计算去离子水的体积2根据探针的质量和分子量计算并加入O。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细菌培养物的制备 
	注意：对于本方法， 金黄色葡萄球菌 作为示范菌株。可选择任何合适的细菌菌株。&#160;可选择任何具有合适激发和发射光谱的商用染料对细菌进行正向标记。
	<ol>
		<li>使用无菌接种环从新鲜的LB琼脂平板上挑选一株目标细菌菌落，将接种环末端浸入培养基中，将菌落接种至装有10 mL LB培养基的50 mL离心管中。于37 °C、250 rpm条件下振荡培养16小时（或过夜）。</li>
		<li>测定 OD595 通过将过夜培养物100 µL加入900 µL LB培养基中（使用1 mL比色皿），稀释10倍。在分光光度计中以595 nm波长测定吸光度（以含1 mL LB培养基的比色皿作为空白对照）。将测得的OD值乘以10，得到过夜培养物的OD值。</li>
		<li>传代培养过夜培养物。通过调节在595 nm处的光密度（OD595) 调整至0.1。计算将过夜培养物加入10 mL新鲜LB培养基中所需的体积，以使OD595 至0.1。将培养物在37 °C、250 rpm条件下培养，直至达到对数中期（OD595 0.6 - 0.8，约4小时。</li>
		<li>测量培养物的光密度（步骤 1.2.2），并收集 1 x 108 菌落形成单位（CFU）（OD595 ~1-1 × 108 CFU/mL）的细菌培养物加入至1.5 mL离心管中（例如，如果细菌培养物的OD595 0.6，收集1.67 mL）。在室温下以10,000 × g离心1分钟，使细菌沉淀。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀两次：每次加入1 mL PBS，轻轻吹打重悬沉淀，按上述条件离心，弃上清液，然后重复一次。弃上清液时注意不要扰动细菌沉淀。将最终沉淀重悬于1 mL PBS中。 
		注意：根据每种标记程序的需要准备相应数量的样品。本方案可在此处暂停，最长暂停时间为1小时，之后继续进行步骤1.2.5.1、1.2.5.2或1.2.5.3。</li>
		<li>细菌染色
		<ol>
			<li>用Calcein AM标记细菌时，将染料加入洗涤后的细菌培养物中，使其终浓度为1 µM。在37 °C、300 rpm振荡条件下孵育30分钟。参照步骤1.2.4，用PBS将染色后的细菌悬液离心洗涤3次，以去除多余的染料。用1 mL PBS重悬细菌，取100 µL用PBS 1:1稀释，得到200 µL的OD595 0.5 Calcein AM 染色的细菌。此步骤可暂停最多 1 小时。</li>
			<li>用测试探针标记细菌（例如，UBI-3 或 UBI-10），在 PBS 中将 100 µL 菌液按 1:1 稀释以获得 OD595 0.5，溶于200 µL PBS中。加入任一探针至终浓度为10 µM。反复倒置微量离心管数次，以确保细菌与探针充分混匀。 
			注意：添加探针后应立即进行成像，以模拟临床实际情况。</li>
			<li>为制备未染色的细菌对照样品，取100 µL菌液与等体积PBS稀释（1:1），得到200 µL未染色OD样品595 0.5 样本</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品制备 离体 人肺组织 
	注意：人肺组织样本取自接受肺癌切除手术的患者。用于成像的所有组织均来自远离癌变区域的正常肺组织。样本自手术室新鲜获取后，置于微量管或离心管中，于 -80 °C 保存至使用。
	<ol>
		<li>成像前立即从干冰上的冷冻保存状态中取出人肺组织样本。在室温下使组织略微解冻，直至可使用解剖刀将其切成约1 × 4 mm的组织片2 切片 
		注意：解冻程度至关重要；若组织过冻，切片时易碎裂脱落；若解冻过度，组织过软，难以切片。</li>
		<li>使用镊子将切好的人肺组织放入96孔透明平底组织培养板的孔中。立即将未使用的人肺组织放回储存容器，并置于干冰上，运回-80 °C冰箱保存。</li>
		<li>向每份肺组织样本中加入100 µL PBS。使用移液器吸头确保所有组织均被PBS覆盖（避免组织粘附在孔壁上）。组织会轻微膨胀并可能漂浮。将PBS保留在样本上数分钟，以使组织中的血液充分渗入溶液。尽可能吸除PBS。组织可能堵塞移液器吸头末端；可尝试倾斜培养板或调整吸头位置，以避免此情况发生。</li>
		<li>将100 µL未染色、Calcein AM标记或测试探针标记的细菌移液至各含肺组织的孔中。同时设置对照组，加入含100 µL PBS的肺组织。可在这些对照孔中加入不含细菌的探针，以检测背景荧光的任何增加和/或探针仅由肺组织引起的非特异性激活。应包含仅含肺组织和PBS的孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用 FCFM 技术与 CLE 设备进行成像
<ol>
	<li>CLE 设备的设置 
	注意：校准前 20 分钟准备 CLE 系统，以使激光器预热。
	<ol>
		<li>按下系统变压器背面的电源开关，并启动指定的计算机。按下激光扫描单元（LSU）前面板上的电源按钮，确认出现绿灯，表示该单元已开启。</li>
		<li>双击 CLE 软件图标。输入登录信息，等待 LSU 初始化（10 - 30 秒）。</li>
		<li>对于新型 FCFM 成像光纤的使用，需使用随附的 CD 进行安装。将安装光盘插入计算机光驱，并按照屏幕上的指示进行操作。</li>
		<li>使用光纤清洁器清洁 FCFM 成像光纤连接器单元。将连接器沿清洁带向前擦拭，以去除灰尘或污物。取下 LSU 前端的黄色保护帽。</li>
		<li>轻轻逆时针旋转银色接头，直至无法再转动，以准备LSU接头。将FCFM成像光纤连接器插入接头中，确保连接器的平面朝上。固定光纤位置，顺时针旋转银色接头，直至听到两次咔嗒声。再继续顺时针旋转银色接头45°，完成连接。 
		注意：如果系统未识别光纤，请检查 FCFM 成像光纤是否已安装并以正确方向连接。</li>
		<li>按照弹出的指示完成FCFM成像光纤校准。该过程包含3个步骤：（1）FCFM成像光纤测试（步骤2.1.7 - 2.1.8），（2）背景信号采集（步骤2.1.9），（3）光纤检测（步骤2.1.10）。</li>
		<li>按下屏幕上的“start laser”按钮。激光将居中。</li>
		<li>从校准套件中选取新的小瓶（黄色：校准；红色：清洁；蓝色：冲洗），并按照屏幕上的指示操作：将FCFM成像光纤的远端插入黄色小瓶中，观察显示器上荧光信号的升高；随后将光纤尖端放入红色小瓶中（无需搅动），等待计算机显示器上的荧光信号完全消失；最后将光纤尖端在蓝色小瓶中进行冲洗。 
		注意：如果荧光未消失，使用8% H2O2 并使用镜头清洁纸重新开始。重复该过程，直至获得满意结果（图像清晰，无污物痕迹）。</li>
		<li>将FCFM成像光纤放入蓝色小瓶中。当“启动激光”选项可用时，点击该按钮，随后点击“计算”。</li>
		<li>将FCFM成像光纤放入黄色小瓶中。当出现选项时，先点击“启动激光”，然后点击“计算”。</li>
		<li>在自动校准期间，将成像光纤的远端放入红色小瓶中以清洁 &#62;10 秒，然后使用蓝色小瓶 &#62;4 秒，由软件指示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用共聚焦激光显微内镜进行数据采集
	<ol>
		<li>设置完成后，将弹出一个用于选择存储位置和文件前缀的窗口。请选择用于数据存储的目标文件夹，并相应地命名文件前缀。</li>
		<li>将脚踏板放置在操作者易于触及的位置。左踏板：激光开启/关闭；中踏板：暂停；右踏板：录制/停止。 
		注意：激光控制也可通过屏幕上的控件进行操作。</li>
		<li>在屏幕上单击“start”或踩下左脚踏板以开启激光器。这将启动图像采集，使用100%的激光功率和每秒12帧的帧率（默认设置）进行成像。 
		注意：对于其他应用，可根据样本类型在屏幕上必要时调整这些设置。</li>
		<li>对每份细菌悬液样品进行成像。
		<ol>
			<li>将FCFM成像光纤的远端插入，并缓慢穿过悬浮液以检测样品。</li>
			<li>通过踩下右侧脚踏板或选择屏幕上的录制控件，在光纤缓慢移动经过样品的过程中，录制任意时长（最长10分钟）的视频。</li>
			<li>用8% H清洁FCFM成像光纤的远端2O2 以及在样品之间使用镜头清洁纸巾清洁镜头。 
			&#8203;注意：典型的视频时长为 10 - 30 s 即可满足要求 体外 成像</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对每份肺组织样本进行成像。
		<ol>
			<li>将FCFM成像光纤的远端插入样品中，确保光纤末端与组织直接接触。轻轻移动成像光纤末端以扫描检测样品。 
			注意：将光纤末端从组织上抬起会使组织偏离焦平面；但此方法可用于成像未黏附于组织的标记细菌。</li>
			<li>通过踩下右脚踏板或选择屏幕上的录制控件，在光纤缓慢移动环绕样品的过程中，录制任意时长（最长10分钟）的视频。 
			注意：通常，30 秒的视频长度已足够 离体 组织成像</li>
			<li>用镜头清洁纸和8% H清洁FCFM成像光纤的远端2O2 样本之间</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭系统
	<ol>
		<li>通过按下左脚踏板或单击屏幕上的按钮来关闭激光。</li>
		<li>将FCFM成像光纤的银色LSU接头逆时针旋转至无法再转动，从而将其从CLE设备上断开。轻轻拉出光纤连接器，将其从LSU接头中取出。</li>
		<li>用8% H清洁和消毒FCFM成像光纤2O2 以及镜头清洁纸。将保护帽重新盖回共聚焦显微成像光纤的近端和激光扫描单元前端。将光纤轻柔地放回储存盒中。</li>
		<li>关闭数据采集软件，并将所有保存的文件复制到外部USB设备中。关闭计算机，然后按压LSU设备前面板的I/O按钮3秒，直至绿色指示灯熄灭，以关闭设备。</li>
		<li>根据当地法规处理人体肺组织和细菌。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 数据分析
<ol>
	<li>打开软件，通过软件仪表板上的“前往”图标选择计算机中的相应目录，导入待分析文件。或者，也可将文件直接拖拽至软件仪表板中。</li>
	<li>双击每个视频文件以打开。视频将自动播放，并应用优化的颜色查找表（LUT）和颜色表调整。点击强度标尺上方的魔棒按钮，可禁用自动强度缩放功能。当按钮周围无黑色阴影时，表示该功能已关闭。 
	注意：必须禁用自动强度缩放，以防止在整个视频过程中持续增强对比度，否则将无法对同一数据集中的视频进行比较和分析。</li>
	<li>通过移动最小值和最大值滑块来选择所需的强度缩放，以获得最佳对比度。在选择强度缩放时使用直方图工具，确保捕获最宽的动态范围。 
	注意：确保动态范围适当，使图像不出现饱和现象（即 限制图像中表示饱和的白色区域，以确保不遗漏低强度特征。</li>
	<li>达到所需的缩放效果后，右键单击标记为“Default (Green)”的下拉菜单按钮，选择保存LUT的选项，并将LUT保存到指定位置。</li>
	<li>对于数据集中的每个其他视频，通过右键单击“默认（绿色）”下拉菜单并选择“加载LUT”来应用相同的查找表。选择相应的文件，以对数据集内的所有视频应用一致的强度缩放。</li>
	<li>单击“电影胶片”按钮导出已处理的视频。选择所需的视频格式， 例如 出于演示目的，将生成一个 .mpg 文件。点击“Export”并选择文件保存位置以存储视频文件。通过点击“camera”按钮可导出单帧图像，支持保存为 .png、.bmp 或 .jpg 文件格式。选择文件保存路径后点击保存。 
	注意：视频可导入任意软件，用于制作演示文稿或进一步定量分析。标记的细菌在视频中显示为绿色“闪烁”点状信号。肺组织结构表现为有序的荧光条索，肺泡腔则呈黑色。</li>
</ol>

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</ol>

KD：爱丁堡分子影像公司的创始人兼董事。曾作为顾问接受Mauna Kea Technologies的咨询委托。
MB：爱丁堡分子影像创始人兼主任。

下呼吸道感染是全球疾病负担中排名第二的病因12,13，且由耐抗菌药物细菌引起的感染数量已出现显著上升14。肺炎仍是导致住院的常见原因。在重症监护病房（ICU）中，肺炎的诊断存在较大不确定性，且其发生与极高的死亡率相关15。在肺炎发病初期，细菌在远端肺部的肺泡腔内增殖，而该区域在健康状态下相对无菌，微生物群极少。
本方法描述了细菌特异性光学成像探针在相对较晚阶段的离体（ex vivo）验证步骤11，但在开展此验证步骤之前，探针的设计、合成及初步评估至关重要，如先前研究所示11。
CLE 是一种用于探究疾病状态的新兴临床技术 原位 实时进行。与传统的疑似肺部病变检测技术相比，它具有诸多优势，传统方法可能涉及组织活检和灌洗液采集。活检具有侵入性，可能在机械通气患者中引起并发症甚至死亡，而采集的灌洗液常被上呼吸道细菌污染。尽管已有大量集中努力，但共聚焦激光显微内镜（CLE）在肺炎检测中的应用仍受到一定限制，主要原因是缺乏可提供疾病功能信息的兼容性成像探头10将共聚焦激光显微内镜（CLE）与光学造影剂结合，有望实现比当前标准诊疗方法更快速、创伤更小的肺炎诊断。
该方案的关键步骤在于样本制备和CLE平台的设置。获取与最终临床应用相关的入人体组织也至关重要，例如本研究中所展示的人肺组织。必须使用人组织，因为不同物种间组织自发荧光的程度存在显著差异，这可能误导对成像中细菌探针灵敏度的判断。此外，获取人肺组织的采集与使用伦理许可是必不可少的。从技术层面而言，正确的清洗、将成像光纤正确连接至成像LSU平台以及校准，对于获得高分辨率和稳定的成像结果至关重要；同时需确保向每份肺组织样本中加入等量的细菌。为进一步拓展该方法在探针筛选中的应用，有必要使用一系列病原体（例如可能引起肺炎的病原体）重复本实验流程。
该技术最大的局限性在于，目前临床批准的共聚焦激光显微内镜（CLE）设备仅配备单一激光器（488 nm）。因此，当前在此系统中可用于探针设计的荧光染料选择非常有限，尽管已有临床批准的单色设备使用660 nm及近红外激发波长。在同一设备中增加第二条激光线路将极为理想，这可使探针采用光谱上不同的荧光染料，从而提高细菌-探针信号相对于组织自发荧光的灵敏度。尽管双色CLE设备正在研发中，但这些设备目前尚未获得临床批准和/或成本较高16。
利用致病菌和离体人肺组织进行体外（in vitro）和离体（ex vivo）共聚焦激光显微内镜（CLE）检测，以筛选潜在探针，可弥合传统体外（in vitro）技术（如流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜，CLSM）与临床应用之间的差距。该步骤有助于在将有前景的化合物推进至与临床CLE成像结合使用时提供信心；并可指示所测试探针是否保持对靶标的特异性，或是否存在脱靶标记现象，例如直接与组织结合，或表现出被宿主蛋白水解酶降解的不稳定性。此外，将每种可激活探针直接加入含细菌的人肺组织样本中也十分必要，以全面表征探针在实时条件下的结合与激活速度。
我们认为，通过快速筛选新型细菌特异性探针以评估其在患者远端肺部成像潜力的流程，将显著加快其向临床应用的转化。这主要是因为细菌特异性探针可通过支气管镜工作通道插入的导管在肺部局部递送，从而实现微剂量（&#60;100 µg）给药。因此，无需担心化合物的全身递送和生物分布问题——而这一点在针对体内其他感染靶点或核成像应用中常常是关键限制因素。此外，以如此小剂量递送成像探针可降低与毒性相关的并发症风险（尽管在临床转化前仍需进行毒性筛查）。探针灌注后，可将导管更换为FCFM光纤，随后对同一肺区进行CLE检测，其操作方式与本方法中所描述的基本一致。探针给药后应尽快开始成像，以避免探针被冲洗至无法检测的浓度水平。 
还需要注意的是，利用该技术筛选疾病识别探针时，不应局限于细菌成像剂，还可扩展至针对其他靶点（如炎症）的探针验证。该方法也应可适用于体内其他允许通过共聚焦荧光显微内镜（FCFM）进行成像的疾病部位。

该技术描述了一种用于快速筛选和评估细菌特异性光学成像探针的方法 离体 利用共聚焦激光显微内镜（CLE）结合荧光共聚焦纤维显微镜（FCFM）对人体肺组织进行成像，以快速鉴定可用于可视化远端肺部细菌的具有潜在临床应用价值的化合物 原位.
在抗菌药物耐药性日益加剧的时代，全球迫切需要合理控制抗菌药物的处方使用1因此，人们迫切希望开发出能够高特异性、高灵敏度且实时鉴定细菌感染的诊断方法。2目前，对于重症监护病房（ICU）等危重患者肺炎的诊断，常用方法通常依赖于对非特异性临床或影像学特征的解读，并结合从抽吸液体/组织中进行细菌培养的技术，而细菌培养结果可能需要长达3天才能获得。此外，从注入远端肺部并回收的液体中进行细菌培养，容易受到近端气道的污染。3 由于伴随的抗菌治疗或采样技术不佳，常导致培养结果呈阴性。此外，对抽吸液体使用聚合酶链式反应等分子技术时敏感性过高，可能增加患者过度治疗的风险。一种新兴的诊断方法是分子光学成像，使得 原位 组织的分子病理学成为可能；然而，需要开发和验证光学成像化合物。尽管如此，通过可激活光学探针直接可视化细菌可能是研究患者肺炎存在及进展的一种非常强大的方法，并且重要的是，可用于实时研究治疗过程中宿主与病原体之间的相互作用 原位 
CLE 是多种疾病中一种成熟的检查方法4，包括胃肠病学领域5肿瘤学6,7以及用于探究气道和肺泡囊8,9它能够利用光纤成像束在临床内窥镜的工作通道中通过，直接接触待成像组织表面，实现病变组织的床旁共聚焦显微结构成像。然而，目前仍存在一个局限性，即需要通用型对比剂。因此，若采用疾病特异性探针，例如特异性针对细菌的探针，便可通过直接可视化疑似感染部位的细菌，显著拓展该成像模式的应用价值。光学探针相较于其他技术具有多项优势，可实现具有诊断潜力的实时、高分辨率成像。此外，光学探针还具备多重检测的前景，能够同时检测多个靶标，且整体成本相对较低。目前已有多种光学探针正在研发中，但尚无一种成功应用于临床。10我们合成了一系列针对细菌的小分子化学探针，并开发了一种快速、高效的探针功能评估流程，用于检测细菌性肺炎。 原位11.
为了确定合适的探针候选物，在对探针进行检测之前必须满足以下先决条件 离体 通过FCFM对人肺组织进行成像时，探针需满足以下条件：i) 水溶性良好，ii) 能够快速、特异且选择性地标记临床相关细菌，iii) 具有高信噪比，iv) 在肺部环境中具有抗降解能力。其中抗降解能力通过急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）进行评估；ARDS是一种在重症监护病房（ICU）中常见的疾病，其特征为肺部存在蛋白水解和炎症环境。此外，探针必须携带适合的荧光团，以便利用临床批准的共聚焦激光显微内镜（CLE）成像设备在人肺肺泡组织中实现有效检测。
用于验证每个前提条件的流程如下（在每个阶段，只有通过的探针才会进入下一阶段）：（1）合成待研究的探针文库；（2）将每种探针分别加入一系列活菌中，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检测细菌标记效果；（3）在与原代人中性粒细胞共培养体系中，利用CLSM验证探针对细菌标记的选择性优于哺乳动物细胞；（4）通过CLSM及基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱法，确定探针在急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者支气管肺泡灌洗液（BALF）环境中对细菌的稳定性和有效标记能力；（5）通过CLSM确定候选探针的最佳浓度，确保其对细菌的标记选择性仍优于哺乳动物细胞；（6）候选探针在悬浮状态及表面固定状态下通过荧光共聚焦纤维显微镜（FCFM）成像 离体 人肺肺泡组织，以确保信号稳定且信噪比足以进行检测。步骤6在本方案中有详细描述。步骤1的方法学&#160;- 5 之前已有报道11.

<table><tbody><tr><td>1-14 微型离心机</td><td>SciQuip</td><td>90616</td><td>小型台式微量离心机</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3370</td><td>检测用板</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17783&amp;nbsp;</td><td>商用荧光染料</td></tr><tr><td>Cellvizio 488 nm 研究型 CLE</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LC-0001-488</td><td>共聚焦激光内窥显微成像设备</td></tr><tr><td>Cletop-S</td><td>Cletop</td><td>14110601</td><td>光纤清洁器</td></tr><tr><td>Eppendorf (1.5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11568663</td><td>微量移液器</td></tr><tr><td>Falcon 管 (50 mL)</td><td>Scientific Lab Supplies</td><td>352070</td><td>50 mL 离心管</td></tr><tr><td>Gibco 磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td>PBS — 洗涤液</td></tr><tr><td>IC-Viewer</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LW-0001</td><td>用于研究型 CellVizio 488 nm 系统的数据采集与处理软件</td></tr><tr><td>Incu-Shake midi</td><td>Sciquip</td><td>SQ-4020</td><td>落地式振荡培养箱</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Miller)</td><td>L3522</td><td>金黄色葡萄球菌（S. aureus）的 LB 培养基</td></tr><tr><td>非标准研究用 AlveoFlex 488 nm</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>MP-0002-AF3</td><td>光纤共聚焦荧光显微成像光纤</td></tr><tr><td>Quanti Kit 488 nm</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>LQ-0005</td><td>CellVizio 488 系统校准试剂盒</td></tr><tr><td>S. aureus ATCC 25923</td><td>ATCC</td><td>25923</td><td>本研究中使用的细菌菌株</td></tr><tr><td>半微量分光光度计比色皿</td><td>Sigma Aldrich&amp;nbsp;</td><td>C5416-100EA</td><td>用于分光光度测定&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>41102422</td><td>带振荡功能的台式加热器</td></tr><tr><td>UV 1101 Biotech 光度计</td><td>Biochrom WPA</td><td></td><td>分光光度计</td></tr></tbody></table>

新型细菌特异性探针的光学筛选 离体 通过共聚焦激光内窥显微镜观察人体肺组织

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

提高细菌检测的速度和准确性对于患者分层以及确保抗菌药物的合理使用至关重要。为实现这一目标，亟需开发能够在临床现场实时识别细菌存在的诊断技术。利用光学成像技术在宿主体内直接鉴定细菌是一种具有吸引力的方法。尽管已有多种化学探针的设计与验证尝试，但目前尚无一种成功转化为临床应用。本文介绍了一种通过纤维共聚焦荧光显微镜（FCFM）对细菌特异性探针进行ex vivo验证的方法，用于识别远端肺组织中的细菌。本模型采用ex vivo人肺组织和临床上已批准使用的共聚焦激光内窥显微成像（CLE）平台，用于筛选新型细菌特异性成像化合物，能够高度模拟患者体内实际成像条件。因此，利用该技术筛选成像化合物可为后续临床转化潜力提供有力支持。

在本研究中，我们展示了一种快速筛选新型细菌特异性探针的方法 离体 利用临床批准的共聚焦激光内窥镜设备建立的人类肺泡组织感染模型
采用共聚焦激光纤维内镜（FCFM）进行自发荧光成像（CLE）非常适用于获取远端肺部的结构信息，因为该区域富含弹性蛋白和胶原蛋白，在488 nm激光激发下会自然产生强烈的自发荧光8。相反，肺泡腔不产生荧光，因此能够实现组织结构与气腔之间的高对比度成像（图1）。
添加与疾病相关的探针或对比剂（例如细菌特异性探针）应能够实现实时获取疾病过程的功能信息。我们此前已报道过一组细菌特异性探针库的合成及其初步的体外筛选11，其中评估了探针的细菌特异性、蛋白水解稳定性以及随时间在细菌膜内的滞留能力。该研究鉴定出一种具有良好细菌特异性和膜滞留性的探针（UBI-10），以及一种在细菌细胞膜内滞留效果较差的探针（UBI-3）。这些探针与商用复染试剂（Calcein AM）的对照组进行了比较，后者用于标记S. aureus。
未染色的、Calcein AM 染色的、UBI-3 和 UBI-10 标记的 S. aureus 均在悬浮状态下通过 FCFM 成像，激光功率为 100% 488 nm，帧速率为 12 帧/秒（图 2）。当对 PBS 中未标记的细菌进行成像时，未检测到荧光信号。这与标记细菌的成像结果形成对比。当使用 FCFM 对含有 UBI-3 或 UBI-10 的细菌悬液进行成像时，明显可见溶液的整体背景荧光较仅含 PBS 的对照组有所升高，这是因为 NBD（探针荧光基团）在水溶液中确实会发出少量荧光信号；然而，无需洗涤步骤，即可在溶液中清晰观察到明亮的点状荧光信号。这是由于 NBD 在极性环境（即细菌膜）中发出的荧光信号增强所致。i.e.。Calcein AM 并非可激活探针，因此在细菌染色后需要洗涤步骤，以去除溶液中未结合探针产生的高荧光背景。与 UBI-3 和 UBI-10 标记的细菌类似，经 Calcein AM 标记的细菌在溶液中也表现为明亮的绿色点状信号，可通过 FCFM 检测。由于数据以视频形式采集，这些点状信号在移动穿过成像核心以及进出焦平面时呈现出“闪烁”现象，这是该方法成像标记细菌的一个特征性表现。
标记的细菌随后被添加到小片组织中 离体 人肺组织，并再次通过FCFM成像图3）。仅使用 PBS 或未标记的 S. aureus 加入肺组织后，仅检测到肺组织的自发荧光结构（表现为明亮的绿色胶原和弹性蛋白纤维以及肺泡腔的暗区）。在这些对照条件下未检测到点状信号。同样，在仅含肺组织的条件下也仅观察到肺组织结构（无点状信号）。 S. aureus 加上UBI-3；表明该探针未能在细菌细胞膜内稳定保留 即，它会被洗脱和/或在肺组织内源性蛋白水解酶的作用下降解（如先前已证实）11).
然而，在Calcein AM标记的阳性对照中均可见明亮的点状荧光点 S. aureus 样本，以及最具潜力的细菌特异性探针（UBI-10） S. aureus 样品中即使存在强烈的组织自发荧光，仍可观察到“闪烁”的光点（图3因此，FCFM 获得的结果与 体外 通过共聚焦激光扫描显微镜对细菌特异性探针组进行预筛选，并展示了一种用于实时成像感染的具有临床相关性的检测方法。
本文展示的结果表明，由于肺组织具有独特的自发荧光特性，因此是采用共聚焦荧光显微内镜（FCFM）进行成像的合适器官系统。明亮且特征明显的结构可帮助共聚焦显微内镜（CLE）操作者判断其是否位于肺泡腔内。这些区域与黑暗的肺泡气囊相结合，为高对比度成像荧光标记的细菌提供了理想的背景。
尽管本研究中细菌的检测是通过观察明亮的点状信号进行定性确定的，但也可以使用辅助软件对每帧图像中的点状信号数量进行定量分析，以进一步表征探针文库。
<img alt="离体肺组织自发荧光；显微图像；细胞结构可视化；50 μm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 人肺组织自发荧光的静态图像 共聚焦激光内窥显微镜（CLE）图像 离体 使用纤维共焦荧光显微镜（FCFM）在488 nm激发波长、100%激光功率和每秒12帧的条件下获取的人肺组织图像。弹性蛋白和胶原蛋白具有强荧光性（伪彩为绿色），而肺泡腔无荧光，呈黑色区域。该图已根据Akram的原始图像修改 等.11 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="金黄色葡萄球菌荧光显微镜图像，比较未染色与钙黄绿素 AM 染色样本。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：悬浮液中标记的S. aureus的共聚焦激光内窥显微成像（CLE）。采用光纤共焦荧光显微技术（FCFM），在488 nm激发光、100%激光功率、每秒12帧的条件下对预先标记的细菌进行成像。标记的细菌呈现为高荧光强度的点状结构（伪彩为绿色）。该图已根据 Akram et al.11 修改。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="金黄色葡萄球菌荧光显微镜观察，Calcein AM 染色，细菌细胞可视化" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56284/56284fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： 共聚焦激光内窥显微镜（CLE）图像 离体 标记的人肺组织 S. aureus. 采用纤维共聚焦荧光显微镜（FCFM）进行成像 离体 人肺组织并标记 S. aureus，激发波长488 nm，激光功率100%，成像速度12帧/秒。用Calcein AM或UBI-10标记后，肺组织样本中可见高度荧光的点状标记（伪彩为绿色），代表标记的细菌。当细菌位于肺泡腔内成像时，对比度最高。该图已根据Akram的研究修改 等.11  <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56284/56284fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

该技术描述了一种用于评估细菌特异性光学成像探针的高效筛选流程 离体 利用纤维共焦荧光显微镜对人肺组织进行快速鉴定具有可转化潜力的小分子化学探针候选物

提高细菌检测的速度和准确性对于患者分层以及确保抗菌药物的合理使用至关重要。为了……

该光学成像技术的总体目标是提供一种快速筛选新型细菌特异性光学探针的方法，这些探针可能具有临床应用潜力，可用于对人体肺部感染进行成像。该方法有助于回答分子成像领域中的关键问题，例如新型光学化合物是否对其靶标具有特异性，以及它们是否可被检测到。该技术的主要优势在于其具备可转化性。使用临床环境中可用的设备来筛选有前景的成像探针，可确保这些探针在该环境中能够有效工作。成像前立即从干冰上的冷冻环境中取出人肺组织样本。在室温下使组织轻微解冻，以便用手术刀将其切成 1 × 4 毫米的切片。用镊子将切好的人肺组织放入96孔透明平底组织培养板的孔中。将未使用的人肺组织立即放回储存容器中，并置于干冰上，运回-80摄氏度冰箱保存。接着，用移液器向每份肺组织样本中加入100 µL PBS，以洗去样本中的血液。使用移液枪枪头确保所有组织均被 PBS 覆盖，且未粘附在孔壁上。移除并弃去 PBS。然后向每孔肺组织中加入 100 µL 未染色的钙黄绿素 AM 标记或测试探针标记的细菌。同时，使用肺组织在100 µL PBS中设置对照。首先用光纤清洁器清洁光纤共聚焦荧光显微成像光纤连接器单元。将连接器在清洁带上来回单向擦拭，以去除任何灰尘和污物。从激光扫描单元前端取下保护性黄色帽盖。通过轻轻逆时针旋转银色中心轴直至其停止，以准备LSU集线器。将FCFM成像光纤连接器向上插入。固定光纤位置，顺时针旋转银色接头直至听到两次咔嗒声。再将银色接头顺时针旋转额外45度以完成连接。接下来，按照弹出的提示操作，完成FCFM成像光纤的校准。首先，通过按下屏幕上的启动激光按钮执行 FCFM 成像光纤测试。激光将自动居中。从校准试剂盒中选取新的小瓶，并按照屏幕上的说明进行操作。将FCFM成像光纤的远端放入黄色小瓶中，并在监视器上观察荧光信号的增强。随后将光纤尖端放入红色小瓶中，不要搅拌，等待荧光信号消失。最后，将光纤尖端在蓝色小瓶中冲洗。接着，将FCFM成像光纤放入蓝色小瓶中以采集背景信号。当选项可用时，先点击“启动激光”，然后点击“计算”。最后，将 FCFM 成像光纤插入黄色小瓶中进行光纤检测。再次按下“启动激光”，然后点击“计算”。在自动校准过程中，根据软件提示，将光纤远端先放入红色小瓶中超过 10 秒，再放入蓝色小瓶中至少 4 秒，以清洁光纤末端。开始数据采集时，点击屏幕上的“开始”按钮或踩下左脚踏板以开启激光。接着，对每一份细菌悬液样品进行成像。将FCFM成像光纤的远端插入样品中，并缓慢移动光纤穿过悬液，以检测样品。当光纤在样本周围缓慢移动时，通过踩下右侧脚踏板或选择屏幕上的录制控件来录制任意长度的视频。在不同样本之间，使用8%过氧化氢和镜头清洁纸清洁FCFM成像光纤的远端。为对每份肺组织样本进行成像，将FCFM成像光纤的远端插入样本中，并确保光纤末端与组织直接接触。然后轻轻移动成像光纤的末端以检测样品。将光纤末端从组织上抬起会使组织脱离焦平面，但此方法可用于成像未附着在组织上的标记细菌。通过踩下右脚踏板或点击屏幕上的录制控件，在光纤缓慢移动经过样本时录制任意时长的视频。每次更换样本之间，使用镜头清洁纸和8%过氧化氢清洁FCFM成像光纤的远端。关闭系统时，踩下左脚踏板或点击屏幕上的按钮以关闭激光。接下来，将FCFM成像光纤从CLE设备上断开：逆时针旋转银色LSU接头直至无法再转动。然后轻轻将光纤连接头从LSU中拉出，使FCFM成像光纤脱离LSU接头。将保护帽重新盖回LSU单元前端的FCFM成像光纤近端。使用8%过氧化氢和镜头清洁纸巾清洁并消毒FCFM成像光纤。最后，将光纤轻柔地放入储存盒中。打开软件，通过软件仪表板上的前往图标选择计算机中的相应目录，导入文件以进行分析。双击每个视频文件以打开。视频将使用优化的颜色查找表和颜色表调整自动播放。点击强度标尺上方的魔棒按钮，禁用自动强度缩放。当按钮周围没有黑色阴影时，该功能处于禁用状态。通过移动最小值和最大值滑块来选择所需的强度缩放，以获得最佳对比度。在选择强度缩放时使用直方图工具，以确保捕获最宽的动态范围。达到所需的缩放效果后，右键单击标记为默认绿色的下拉菜单按钮。选择保存查找表的选项，并将查找表保存到指定位置。对于数据集中的每个其他视频，通过右键单击默认的绿色下拉菜单并选择“加载查找表”来应用相同的查找表。选择相应的文件，以对数据集中的所有视频应用一致的强度缩放。单击胶片卷按钮导出已处理的视频。选择所需的视频格式以生成 MPG 文件，然后按“导出”并选择保存视频文件的位置。在视频中，标记的细菌以绿色闪烁的点显示。肺组织结构将呈现为有序的荧光条索，肺泡腔表现为黑色。未标记的金黄色葡萄球菌在FCFM成像下不产生荧光，表明光学成像需依赖显影化合物。经荧光化合物成功标记的金黄色葡萄球菌在FCFM成像下可见。该图显示了成功标记的金黄色葡萄球菌。人肺组织在488纳米波长下产生自发荧光。视频展示了通过共聚焦荧光显微镜（FCFM）成像的人肺组织。未标记的金黄色葡萄球菌被添加到组织中，无法被观察到。然而，成功标记的细菌可通过FCFM成像在人肺组织背景下显示为微小闪烁的点状亮点。一旦掌握，该技术所需时间可根据样本数量在10分钟内完成。在进行此操作时，务必注意在设备校准以及不同样本成像之间彻底清洁光纤。观看本视频后，您应能够充分理解如何设置荧光共聚焦纤维显微（FCFM）装置以对生物样本进行成像，以及如何处理所获取的数据。完成此操作后，可进行其他方法，如菌落形成单位（CFU）平板计数，以回答更多问题，例如确定标记后细菌细胞的数量和活性。请注意，操作人体组织和致病菌可能存在危险，因此在进行本实验时，应始终采取预防措施，例如使用个人防护装备。

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