Name: 用于组织工程应用的三维聚 (ε-内) 支架的熔体静电纺丝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 学习熔体静电纺丝直写技术制备三维聚己内酯支架的方法，用于组织工程应用。该方案提供可控纤维直径和有序架构的详细参数设置与优化策略。

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本工作得到了细胞治疗制造合作研究中心（CRC）、澳大利亚研究理事会（ARC）增材生物制造研究中心以及慕尼黑工业大学高等研究院的经费支持。本研究由澳大利亚研究理事会增材生物制造产业转型培训中心（IC160100026）开展，网址为 http://www.additivebiomanufacturing.org。敬请访问该网站，查阅与本项目相关的文章、书籍、电视或广播节目、电子媒体以及任何其他文学作品。此外，作者衷心感谢 Maria Flandes Iparraguirre 在拍摄方面的支持，Philip Hubbard 的配音工作，以及 Luise Grossmann 的拍摄与剪辑工作。

1. 材料准备
<ol>
	<li>使用漏斗将2 g PCL填充至一个3 mL塑料注射器中，并将活塞插入开口端。</li>
	<li>将注射器置于预热至65 °C的烘箱中加热8 h。针头朝上放置，以便气泡聚集在开口附近。</li>
	<li>用细物推动活塞，排出熔融材料中截留的空气。</li>
	<li>使其冷却至室温，当聚合物在10分钟后不再透明时即完成冷却。</li>
	<li>将预装PCL的注射器在干燥、避光的环境中室温保存，直至使用。</li>
</ol>
2. 硬件与软件设置
<ol>
	<li>将一个23G平头针（喷丝头）连接到注射器上，并在另一端安装筒管适配器，以将注射器连接至气压系统。</li>
	<li>将注射器放入打印头中，并向下按压，直至喷丝头尖端从打印头底侧的黄铜部分突出1 mm。</li>
	<li>在载物台上安装收集器，并使用70%（体积/体积）乙醇清洁收集器表面以及打印头，以去除灰尘或残留的聚合物。</li>
	<li>通过在喷丝头与收集器之间放置一个12 mm高的物体来设定工作距离，并降低打印头，直到喷丝头尖端刚好接触该物体。</li>
	<li>调节电控箱上的温度调节器，分别将喷丝头区域和注射器的温度设为82 °C和65 °C，并开启电源以熔化PCL。</li>
	<li>至少等待10分钟，直至聚合物完全熔融，然后通过将压力调节器设为1.8 bar来启动气压。</li>
	<li>准备G代码，以定义支架的尺寸和形状、丝线间距、层数以及收集过程的收集速度。 
	注意：在讨论章节中提供了用于制备平面和管状支架的详细模板（表2）。</li>
	<li>手动仔细检查所有接地线是否已牢固连接至外壳和墙壁插座。</li>
	<li>在计算机上启动软件（例如，MACH 3），并上传已准备好的G代码。</li>
</ol>
3. 支架制备
<ol>
	<li>关闭外壳的前门，该操作将接通安全联锁并触发向喷丝头施加高压。
	 
	注意：一旦打开前门（例如打印完成或发生紧急情况时），高压将自动切断，从而可安全取出支架。</li>
	<li>以 0.2 kV 为步长逐步增加电压，直至形成泰勒锥，并有纤维射流向收集板方向喷出（参见 图1D 中的泰勒锥示例）。</li>
	<li>让聚合物熔体在静止的收集板上挤出，保持喷射流静止状态 5 分钟以使其稳定。在开始新的打印前，清除堆积的材料。</li>
	<li>使用键盘上的光标键将打印头移动至 G 代码起始位置的上方。</li>
	<li>在计算机软件中启动 G 代码程序。</li>
</ol>
4. 纤维直径调节
<ol>
	<li>保持工作距离（12 mm）以及温度调节器（喷丝头区域为82 °C，注射器为65 °C）处于恒定水平，具体操作如步骤2.4和2.5所述。 
	注意：不同直径调整的总结如下所示 表3.</li>
	<li>打印直径较小的纤维（3–10 µm）。将气压降低至0.8 bar，调节施加电压至8 kV，并将收集器速度设置为1700 mm/min。</li>
	<li>打印中等直径的纤维 （10-20 µm）。将气压调节至1.5 bar，电压设为11 kV，收集速度降低至1200 mm/min。</li>
	<li>打印直径较大的纤维（20–30 µm）。将气压提高至2.6 bar，调节施加电压至12 kV，并将收集速度降低至700 mm/min。</li>
</ol>
5. 喷流优化
<ol>
	<li>从培养箱外部用强光LED灯照射液流，以提高可见度。</li>
	<li>观察纤维行为1分钟，并逐步微调系统参数以优化工艺， 即 施加电压为0.1 kV，收集速度为100 mm/min，气压为0.1 bar。 
	注意：此处提供了一个摘要 表4.</li>
	<li>通过降低气压、提高速度并最小化电压，使纤维的飞行轨迹呈现稳定的悬链线形状并持续超过3分钟，从而稳定其周期性偏转行为。</li>
	<li>通过增加电压、降低气压以及减缓收集器速度，校正滞后射流的飞行路径。持续采取上述措施，直至纤维的飞行路径恢复成悬链线形状。</li>
	<li>通过降低施加电压、提高收集器速度以及增大气压，避免纤维垂直向收集器方向运动，直至射流轨迹再次呈现悬链线形状。</li>
</ol>
6. 支架收集
<ol>
	<li>打印完成后打开门，使用光标将收集板移向门口，以便更方便地操作。</li>
	<li>用70%（体积/体积）乙醇混合液喷洒支架，等待10秒，直至其明显从收集板上脱离。</li>
	<li>用镊子夹住支架的一边，将其从 enclosure 中提起，完成收集。</li>
</ol>
7. 故障排除
<ol>
	<li>如果观察到喷丝头之间出现火花或听到爆裂声，应立即降低施加的电压或打开设备门。</li>
	<li>从密闭腔室内清除所有危险材料和液体（如70%乙醇（vol/vol）），因为一旦发生火花，可能引发火灾。</li>
	<li>相应地编程G代码，使喷丝头在所有层打印完成后移离支架打印区域，以避免材料在喷丝头最终停止的位置上方堆积。</li>
	<li>在放大镜下检查喷丝头，确认其无任何损伤，因为损伤会显著影响泰勒锥的均匀性。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

将增材制造（AM）应用于医疗领域以寻找创新解决方案，为21世纪的医疗挑战提供了新的范式st 世纪。所谓的领域 &#34;生物制造&#34; 呈上升趋势，制造技术的创新使得为组织工程（TE）应用生产高度复杂的结构成为可能。聚合物熔体在直接书写模式下的静电纺丝（此处为MEW）被视为最有望满足组织工程领域需求的制造技术之一，该领域需要微米至纳米尺度的生物相容性材料有序结构。27.
本教程旨在通过解释微挤出书写（MEW）的物理原理并演示使用该技术制造可重复支架的具体操作步骤，来建立对MEW操作的基本认识。
由于微尺度电纺丝（MEW）的基本原理与传统的增材制造技术相似，即以逐层方式精确沉积挤出材料，因此控制喷头与收集器之间的相对运动至关重要。根据我们的经验，建议使用喷头固定不动、而由平台（X轴和Y轴）带动收集器运动的MEW设备。固定的喷头可保持稳定位置，不会产生作用于泰勒锥的运动学力，从而避免在泰勒锥形成过程中可能引起的扰动。此外，与高压电源和加热器相连的线路也不会因...

利用细胞制造三维（3D）生物相容性结构是增材生物制造技术对组织工程（TE）的关键贡献之一，其目标是通过应用定制的生物材料、细胞、生化因子或它们的组合来修复组织。因此，组织工程应用中支架的主要要求包括：可由生物相容性材料制造、具备可调控的形态学特性以促进靶向细胞侵入，以及优化的表面特性以增强细胞相互作用1。
熔体静电纺丝（MEW）是一种无溶剂的制造技术，结合了增材制造（常称为3D打印）和静电纺丝的原理，用于制备具有高度有序超细纤维形貌的聚合物网状结构2。该技术属于直接书写法，能够根据预设的程序代码（称为G代码）精确沉积纤维3。目前，熔体静电纺丝结构通常采用平板4,5或芯轴6,7收集器，分别用于制备多孔平板状和管状支架。
由于能够直接打印医用级聚合物（如聚ε-己内酯（PCL）），该技术为组织工程（TE）和再生医学（RM）领域带来了显著优势，PCL具有优异的生物相容性8。其他优势还包括可通过高度有序地沉积纤维，定制孔隙的尺寸和分布，从而制造出具有高比表面积的支架。在进行熔体电纺丝（MEW）之前，需先对聚合物加热9。一旦聚合物处于熔融状态，施加的气压会迫使它从连接至高压电源的金属喷丝头中挤出。在接地收集器的作用下，液滴所带静电引力与表面张力之间的力平衡，导致形成泰勒锥，随后射流被喷射而出10。
本方案所用自制熔体电纺（MEW）装置的图像及示意图见图1。图中还展示了使用绝缘胶带避免加热元件与包围喷丝头的带电黄铜部件之间发生电击穿的原理。绝缘不足会导致所用硬件内部损坏。
根据三个系统参数（温度、收集速度和气压）的调节情况，熔体电纺丝（MEW）能够制备出不同直径的纤维，具体解释见讨论部分。然而在大多数情况下，在获得稳定的射流喷射之前，需要对射流进行精细调节和优化。对带电射流运动过程的可视化观察是验证该工艺一致性和均匀性的有效方法。在理想情况下，射流的飞行路径呈现出由系统参数控制的力平衡所决定的悬链线形状11。此外，支架的微观和宏观结构取决于聚合物射流的飞行路径12。不同偏转行为及其优化措施的详细对照表见讨论部分。
在本研究中，我们介绍了一种利用熔体电写技术（MEW）制备高度可控纤维支架的实验方案。本工作中采用了医用级PCL（分子量95-140 kg/mol），因为医用级PCL相较于工业级具有更高的纯度，且其机械性能和加工性能非常适合MEW技术。PCL具有宽广的熔融加工范围，这源于其较低的熔点（60 °C）和高热稳定性。此外，PCL是一种降解速率较慢的生物可降解聚合物，使其成为多种组织工程应用的理想材料13。
本研究中，温度和收集距离将保持恒定（注射器和喷丝头温度分别为 65 °C 和 82 °C，收集距离为 12 mm）；而施加电压、收集速度和气压将进行调整，以制备具有目标直径的纤维。结果部分提供了使用 MEW 支架的已发表研究的详细列表，展示了其在组织工程（TE）和再生医学（RM）领域的不同应用（表 1）。

<table><tbody><tr><td>塑料注射器</td><td>Nordson 澳大利亚有限公司</td><td>7012072</td><td>EFD 桶形针筒 3 mL 透明 50 个装</td></tr><tr><td>医用级聚（&amp;epsilon;ε-己内酯（mPCL）</td><td>荷兰科碧恩普拉克公司</td><td>PURASORB PC12</td><td></td></tr><tr><td>23 号针头</td><td>Nordson 澳大利亚有限公司</td><td>7018302</td><td>#23GP .013 X .25 橙色 50 件装</td></tr><tr><td>活塞杆</td><td>Nordson 澳大利亚有限公司</td><td>7012166</td><td>3 mL 带擦拭片白色活塞，50 个/包</td></tr><tr><td>压力适配器</td><td>Nordson Australia Pty Ltd</td><td>7012059</td><td>3 mL 蓝色适配器，O型，1.8 M</td></tr><tr><td>铝制集流体</td><td>Action Aluminium，澳大利亚</td><td>SHP2</td><td>5005号表 H34</td></tr><tr><td>丙烯酸玻璃</td><td>Mulford Plastics Pty Ltd</td><td>ACC6-13094</td><td></td></tr><tr><td>Mach 3 软件</td><td>艺术软体</td><td></td><td>网上购买</td></tr><tr><td>安全开关联锁</td><td>RS Components 有限公司</td><td>12621330</td><td></td></tr><tr><td>高压发生器</td><td>EMCO 高压公司</td><td>DX250R</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>WATLOW</td><td>PM9R1FJ</td><td></td></tr><tr><td>X和Y轴定位载玻片</td><td>VELMEX 公司</td><td>XN-10-0020-M011</td><td></td></tr></tbody></table>

用于组织工程应用的可调控形貌三维聚(ε-己内酯)支架的熔融电纺写入制备

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

本教程探讨了聚合物熔体静电纺丝书写的基本原理和指导原则，这是一种在生物医学应用中具有巨大潜力的增材制造技术。该技术通过在喷丝头与收集器之间施加电压，形成稳定的黏弹性聚合物射流，实现生物相容性聚合物纤维的直接沉积，从而制备出亚微米至微米尺度范围内结构有序的支架。典型的多孔支架具有较高的比表面积，可为细胞附着和生长提供更多有效的黏附位点。通过精确调控系统参数来控制打印过程，能够实现所打印支架质量的高度可重复性。同时，该技术也为用户提供了灵活的制造平台，可根据特定需求定制支架的形貌结构。为此，本文提供了一套利用熔体静电纺丝书写（MEW）技术、通过有指导性地调节参数（包括流速、电压和收集速度）来获得不同纤维直径的实验方案。此外，我们还展示了如何优化射流，讨论了常见的技术难题，解释了相应的故障排除方法，并展示了多种可打印支架结构。

在MEW中通常采用两种不同的收集方法，即平面收集和心轴收集。所得到的结构取决于由软件执行的G代码编程（表2）。
平面收集 
采用平面收集器是最常见的方法，可实现材料按照预设的G代码直接沉积。文献中广泛报道了不同尺寸的0/90和0/60结构。此外，当使用带有图案的平面收集器而非光滑收集器时，直接将熔融纤维沉积到收集器上的能力也有助于生成随机但有序的结构14。
管状结构 
在组织工程应用中，对具有管状结构的支架制造需求很大。通过使用圆柱形收丝装置，熔体电纺丝（MEW）是一种实现具有定制孔隙率的管状支架的有效方法。该装置围绕自身轴线旋转，同时沿芯轴轴向平移。通过精细调节G代码，可...

本方案提供了通过熔体静电纺丝在直接书写模式下制备支架的全面指南。我们系统地概述了该过程，并定义了实现目标支架结构的适当参数设置。

本教程探讨了聚合物熔体静电纺丝书写的基本原理与指导规范，这是一种增材制造技术……

本视频教程探讨了以直接书写模式进行聚合物熔体静电纺丝的技术，并提供了制备具有高度有序结构支架的必要指导。静电纺丝是一种聚合物加工技术，其中黏性聚合物通过喷口挤出，同时在电场作用下引发射流的形成。静电作用力将纤维加速导向带相反电荷或接地的收集器。为了达到所需的黏度，传统上将聚合物溶解在溶剂中。这些溶剂在喷射过程中挥发，结合电场作用，导致纤维发生显著屈曲。这使得所形成的聚合物支架在形貌特性方面难以控制、表征和重复。本实验展示了利用聚合物熔体进行静电纺丝。与溶解法不同，该方法通过加热原始聚合物以达到所需的黏度水平。由于无需溶剂，聚合物的高分子链缠结程度更高，从而获得更稳定的纤维飞行路径。微米级纤维可根据收集器的运动实现精确沉积。采用聚合物熔体进行直写模式的静电纺丝，可制备出高度有序的支架结构，其尺度可小至微米级甚至纳米级。我们预测，该技术将在组织工程与再生医学的未来发展中发挥关键作用。该技术弥合了传统纤维成型工艺与3D打印原理之间长期存在的差距，为设计下一代支架开辟了新途径。微尺度静电纺丝书写技术可实现对医用级塑料（如聚己内酯或PCL）的直接加工。由于其纤维直径小、结构高度有序且具有多孔性，熔融静电纺丝PCL支架成为体外和体内应用的理想结构。实现高效且具有重要价值的热解，一个主要前提是具备高度功能化的软硬件系统。为此，我们设计了一套完全集成的系统，并配备了自动化的外围控制功能。这有助于可靠且高度可重复地制备支架，充分满足用户的需求。熔融电纺直写技术涉及制造具有不同结构的支架。以下教程介绍了材料准备、支架制备、纤维直径调节以及射流优化的步骤。取两克PCL装入一个三毫升的塑料注射器中，并轻轻推入活塞。将注射器置于65摄氏度的预热烘箱中八小时。轻轻推动活塞，直至所有滞留的气泡完全排出。连接23号针头，并将其安装至气压系统。将其按压至针尖从黄铜容器中露出。将收集器安装到载物台上，并用70%乙醇进行安装和清洁。通过编程G代码来调节支架的尺寸、纤维间距和层数，以确定收集器的移动速度和方向。对于管状支架，选择旋转速度、平移速度及其重复次数以确定支架的厚度。有关针对平面或管状支架单独编程G代码的详细指南，请参见论文原文。打开软件 Mach3 并上传生成的 G 代码。有五个可调节的系统参数，这些参数显著决定了所制备支架的质量。这些参数分别是气压、电压、收集速度、温度和工作距离，应按以下顺序进行调整。在针头与收集器之间放置一个高度为12毫米的3D打印塑料块，以调节工作距离。打开上下两部分的加热器，分别设置顶部温度为65度，底部温度为82度。启动气压，等待熔融聚合物从针头挤出。开始操作前，确保所有接地电缆均已牢固连接。关闭与联锁装置相连的 enclosure 前门。逐渐升高电压，直至挤出的熔体形成泰勒锥，并向收集器喷射出熔融射流。让聚合物熔体在静止的收集板上电纺五分钟，以稳定射流。使用聚合物熔体进行静电纺丝可制备不同直径的纤维。通过特异性调节系统参数中的压力、电压和速度，同时保持距离和温度恒定，即可实现这一目标。通过施加相对较低的压力、较小至中等的电场以及较高的收集速度，可制备直径在3至10微米之间的细纤维。根据本实验室的经验，使用以下参数可制备直径为4微米的纤维：0.9 bar、8千伏和1,700毫米/分钟。直径在10至20微米之间的中等纤维可通过施加相对较低的压力、中等到较高的电压以及中等范围的收集速度来制备。根据我们实验室的经验，使用以下参数可以打印出直径为13微米的纤维：1.5巴、11千伏和每分钟1200毫米。打印直径在20至30微米或更大的纤维，则需要较高的聚合物挤出速率，同时施加相对较高的电压，并采用尽可能低的收集速度。根据我们实验室的经验，使用以下参数可以打印出直径为25微米的纤维：2.6巴、12千伏和每分钟700毫米。然而，在这三种情况下，均需进行精细调节和优化，以获得直径均一的稳定结果。在熔体静电纺丝过程中，只有当决定聚合物流动的力与使射流向收集器方向吸引的力之间达到完美平衡时，才能最终形成一致的支架形貌。当纤维的飞行轨迹在较长时间内呈现悬链线形状时，即表明已达到良好的平衡状态。然而，目前已知存在三种不同的异常行为。第一种是，输送至泰勒锥的聚合物质量与纤维所受相应拖曳力之间出现不平衡，导致带电射流不稳定。在此情况下，泰勒锥持续地被过量供给聚合物，并在较短的时间间隔内频繁释放其质量。频繁变化的角度清晰可见，并导致直径差异极大。为使过程重新稳定，应降低流速以减少聚合物的输送量，同时提高速度和电压，以增强对纤维的牵拉力。其次，纤维向下运动并垂直沉积在收集器上。此时，加速度力超过了泰勒锥中的聚合物供给量。略微增加压力并降低电压可解决此问题，或调整收集速度。第三种情况是纤维滞后，呈高角度下的直线状。由此会产生相对较厚的纤维并被拖拽，导致沉积纤维的精度降低。降低收集速度可解决此问题。然而，需要略微增加电场强度。在熔体静电纺丝中，有两种收集方法：平板收集器和心轴收集器。使用平板收集器是最常见的方法。090度和060度取向的多种尺寸结构在文献中已有广泛报道。将熔融纤维直接沉积于收集器上的能力也有助于制备非线性结构，例如重复的环形结构。使用既旋转又沿平行于针头方向移动的圆柱形收集器，可实现管状结构的构建。通过精细调节旋转速度和轴向移动速度的参数，可调控纤维的取向。当旋转速度高于轴向移动速度时，形成径向取向的孔道；反之则形成轴向取向的孔道。管状结构的直径取决于所用芯轴的直径。在已发表的研究中，不同支架结构及其潜在应用的详细列表可参见原稿。由于电场高度敏感，且其强度与两个电极之间的距离密切相关，因此定期调平收集平台和打印头底面至关重要。若收集器与喷头之间的距离设置过近，电场将显著增强，直至组件之间产生火花。立即调低电控箱上的电压，或打开舱门。每次启动程序前，务必仔细检查所有电缆连接，确保其牢固无松动。任何针头损伤都可能导致泰勒锥变形，从而引起打印过程中的不规则现象。因此，针尖意外弯曲的针头必须丢弃。我们希望本视频有助于稳定带电射流的建立，并使您确信，正如我们所坚信的那样，熔体静电纺丝书写技术将在组织工程与再生医学领域发挥重要作用。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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三层层电纺丝技术模拟天然动脉结构：基于聚己内酯、弹性蛋白和胶原蛋白的初步研究

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报道了一种通过新设计的收集装置，由新型可生物降解聚合物聚（甘油-十二烷酸酯）（PGD）制备电纺长纤维并使其跨越更大沉积区域的合成与制备方法。这些纤维能够支持源自小鼠多能干细胞的细胞生长。...

聚（甘油-十二烷二酸）电纺纤维支架用于小鼠胚胎干细胞构建神经组织

本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。...

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二维静电纺纳米纤维膜扩展为三维支架

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

学习熔体静电纺丝直写技术制备三维聚己内酯支架的方法，用于组织工程应用。该方案提供可控纤维直径和有序架构的详细参数设置与优化策略。

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