Name: 慢性炎症状态个体的单核细胞轮回和泡沫形成的定量研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: 了解单核细胞跨内皮迁移和泡沫细胞形成的定量研究方法。该技术使用人内皮单层和聚合胶原蛋白凝胶，通过显微镜和流式细胞术进行分析，可评估心血管疾病风险个体的致动脉粥样硬化潜力。

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作者衷心感谢 William Muller 教授和 Clare Westhorpe 博士在本模型早期版本开发过程中所发挥的关键作用。作者还要感谢 AMREP 流式细胞术核心实验室对单核细胞亚群的分选工作，以及阿尔弗雷德医院传染病科临床研究护士在部分研究中对 HIV 阳性个体的招募工作。作者衷心感谢伯内特研究所获得的维多利亚州运营基础设施支持计划对本工作的贡献。TAA 由 RMIT 大学副校长博士后奖学金资助。本研究由 NHMRC 项目资助 1108792（资助对象为 AJ 和 AH）支持。TK 由 NIH 资助项目 NIH K08AI08272 和 NIH/NCATS 资助项目 #UL1TR000124 支持。

注意：所有使用人类生物样本的实验均经墨尔本阿尔弗雷德医院人类伦理委员会批准。除非另有说明，所有实验均在II级生物安全柜中进行。“预热”指试剂在水浴中加热至37 °C。
1. I型纤维状胶原凝胶的制备：第1天
<ol>
	<li>按照表1所示，依次向5 mL聚苯乙烯管中加入并混合35.7 mM NaOH、0.71 × M199、4.58 mM乙酸和1.71 mg/mL I型纤维状胶原，制备聚合胶原凝胶。 
	注意：为防止胶原在凝胶混合物中形成“团块”，需用移液器轻柔地上下吹打5次，确保胶原充分混匀。显微镜检测每种实验条件需准备4–6个凝胶，流式细胞术每种实验条件需准备15个凝胶。</li>
	<li>混合均匀后，将50 µL胶原凝胶混合物分装至无菌平底96孔组织培养板的每个孔中。不要使用最外侧的行和列，而是在这些孔中加入200 µL的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（PBS），以防止凝胶干燥。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育2小时，使胶原聚合。 
	注意：将培养板直接放置在培养箱内洁净的金属架上，以确保受热均匀。</li>
	<li>孵育完成后，在凝胶上覆盖150 µL的1×添加补充剂的M199培养基（见材料表），并在使用前继续孵育5天。</li>
</ol>
2. 冻存 HUVEC 的复苏与扩增：第 1 天
<ol>
	<li>用1 mL用1×PBS稀释的50 µg/mL纤连蛋白标记并包被直径10 cm的培养皿，在室温下孵育10分钟。</li>
	<li>将冻存的原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC，1.0 × 106 个细胞）等分试样在10 mL M20中解冻。 
	注意：HUVEC应按先前所述方法制备21，并使用低代次（&lt; 第4代）。此处可用人冠状动脉内皮细胞替代HUVEC。</li>
	<li>将HUVEC重悬于10 mL M20中，加入经纤连蛋白包被的培养皿中，在加细胞前吸除多余的纤连蛋白，培养至融合（约5天），在第3天更换培养基。</li>
</ol>
3. 在胶原凝胶上培养 HUVEC 单层细胞：第 5 天
<ol>
	<li>第5天，通过吸除培养皿中的培养上清液，并用10 mL无血清M199培养基洗涤去除含血清的培养基，使HUVEC脱落。</li>
	<li>向HUVEC中加入5 mL含0.05%胰蛋白酶/0.53 EDTA的M199培养基，在室温下轻轻摇动孵育1–2分钟，直至细胞脱落。</li>
	<li>细胞脱落后，迅速用5 mL M20冲洗培养皿，并将含有细胞的培养基转移至10 mL离心管中。</li>
	<li>在室温下以300 × g离心5分钟，吸除上清液，将细胞重悬于200 µL M20培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>将细胞以2.0 × 105 个/mL的浓度重悬于M20培养基中，吸除96孔板中凝胶上的M199培养基（步骤1.3），每孔加入100 µL重悬的HUVEC（含2.0 × 104 个细胞），即加入前述制备的胶原凝胶中（步骤1.2）。将培养板继续在37 °C、5% CO2条件下培养3天。 
	注意：此时可通过硝酸银染色22或紧密连接蛋白的免疫组织化学染色23来确认HUVEC单层的完整性。为此需额外制备凝胶样本。</li>
</ol>
4. 内皮单层细胞的活化及单核细胞的分离/活化用于跨内皮迁移：第8天
<ol>
	<li>第8天，在添加单核细胞之前，通过吸除覆盖在凝胶上的M20培养基来激活每孔HUVEC单层细胞，然后加入 100 µL 每凝胶中加入10 ng/mL 人TNFα至M20中。孵育于 37 °C/5% CO₂2 4小时。 
	注：如有必要，可将未活化的 HUVEC 条件作为对照纳入实验。</li>
	<li>在4小时HUVEC活化步骤期间，使用磁珠技术从PBMCs中分离单核细胞，按照制造商说明书进行阴性筛选。至少需要6.5 x 106 此步骤应使用PBMCs，以可靠地回收3.0 x 105 单核细胞是每种条件所需的一种细胞，因为单核细胞通常占外周血单个核细胞（PBMCs）的约10-15%。 
	注意：为了评估单核细胞在跨内皮迁移及泡沫细胞形成前被激活的影响，可在该阶段对单核细胞进行激活。如有需要，单核细胞可从解冻后的外周血单个核细胞（PBMCs）中分离获得。即，储存的患者样本）。通过FACS分选分离的单核细胞亚群可制备用于加入凝胶（图1).</li>
</ol>
5. 初代人单核细胞的迁移：第8天
<ol>
	<li>为检测单核细胞的跨内皮迁移，需移除含 TNFα 的培养基，并通过加入和吸出培养基的方式用 100 µL M199 洗涤凝胶两次。洗涤后，在 100 µL M20 培养基中加入 2.0 × 105 个新分离或解冻并洗涤后的冻存 PBMCs，或 5.0 × 104 个新分离的单核细胞或纯化的单核细胞亚群，接种至 HUVEC 单层细胞上。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 1 小时，使单核细胞向前迁移进入凝胶。每种实验条件建议设置 6 个孔。 
	注意：为评估自体血清对细胞迁移及泡沫细胞形成的影响，可将细胞与含所需浓度热灭活供体血清的 M20 培养基共同孵育，并与使用混合人血清对照的条件进行比较。此步骤中也可加入除单核细胞外的其他白细胞。若研究特定脂质/脂质种类（例如，HDL、oxHDL）的影响，后续所有步骤应使用含 20–50 µg/mL 脂质的无血清培养基进行。</li>
	<li>在单核细胞完成 1 小时的正向迁移后，用 100 µL 预热的含 1 mM EGTA 的 1× PBS 洗涤凝胶两次，再用 100 µL M199 洗涤一次（离心条件相同），将相同实验条件下各孔的上清液（通常为 6 孔）收集至冰上的 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，将未迁移细胞重悬于 30 µL 1× PBS 中。</li>
	<li>计数上清液中收集的细胞，以确定正向迁移的细胞数量。</li>
	<li>正向迁移细胞的百分比按以下公式计算： 
	<img alt="科学研究中的细胞迁移计算公式：总加入细胞数，已迁移细胞数。" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> <img alt="细胞迁移方程，未迁移细胞百分比计算，研究用公式示意图。" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> <img alt="跨内皮迁移方程：100% - 未迁移细胞(%) = 正向迁移(%)" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3"></li>
	<li>向含有已迁移细胞的洗涤后凝胶中加入 100 µL M20 培养基覆盖，并继续孵育 48 小时。</li>
	<li>48 小时后，收集上清液，并用 100 µL 预热的含 1 mM EGTA 的 PBS 洗涤未迁移细胞两次，按步骤 5.2 的方法收集并合并每种实验条件的上清液。 
	注意：可采用标准流式细胞术染色方案对反向迁移细胞的表型进行检测。</li>
	<li>在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，将细胞沉淀重悬于 30 µL 1× PBS 中。计数细胞，并通过台盼蓝染色法测定细胞活力。</li>
	<li>使用以下公式计算反向迁移细胞的百分比： 
	<img alt="反向迁移方程；反向迁移细胞与正向迁移细胞比值，用于细胞迁移研究。" src="/files/ftp_upload/56293/56293eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 4"> 
	注意：通过计入正向迁移细胞的总数，可更准确地反映反向迁移情况，因为正向迁移通常不会达到 100%。</li>
	<li>如需进行显微镜分析，向每孔加入 100 µL 2% 甲醛（终浓度）固定凝胶，用铝箔包裹培养板，4 °C 保存直至分析。若进行流式细胞术分析，此阶段无需固定细胞。显微镜分析（第 6 节）或流式细胞术分析（第 7 节）详见下文相应实验方案。 
	警告：甲醛具有毒性且具腐蚀性，操作时需佩戴个人防护装备（PPE）。添加甲醛时应小心操作，但由于所用浓度较低，此步骤无需在通风橱中进行。</li>
</ol>
6. 显微镜下泡沫细胞与巨噬细胞的定量分析（油红O染色）
<ol>
	<li>去除甲醛，并用缓冲液洗涤凝胶 100 µL 50% (v/v) 甲醇处理 5 分钟，然后 100 µL 78%（v/v）甲醇，15 分钟。 
	注意：染色步骤可在实验台面上进行，无需在二级生物安全柜内操作。</li>
	<li>通过添加染色剂对脂滴进行染色 100 µL 现配的0.2%（w/v）油红O（见 材料表 室温下孵育1小时（详见正文）。</li>
	<li>通过用洗涤液清洗凝胶4次以去除多余的染料 100 µL 用78%（v/v）甲醇洗涤，每次洗涤后吸出并弃去上清液。</li>
	<li>室温下复染15分钟 100 µL 吉姆萨染液，用蒸馏水按1:10比例稀释。</li>
	<li>吸去吉姆萨染色液，用蒸馏水洗涤凝胶一次。</li>
	<li>使用21 G针头（斜面朝外）沿凝胶边缘在孔周围划线，以将凝胶从板上剥离。</li>
	<li>将双面胶带裁成 2.54 cm × 1.5 cm 的条状，在其上打两个孔（直径 6.35 mm）。将胶带固定在标准显微镜载玻片上，并揭去顶部的保护膜。
	<ol>
		<li>使用移液管向胶带上的孔中加入一滴水。用镊子将凝胶轻轻转移至胶带上的孔中，并盖上1.5号玻璃盖玻片。轻轻按压盖玻片，使其粘附在胶带上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用倒置显微镜，以40倍物镜通过微分干涉相差明场显微镜观察。
	<ol>
		<li>在40倍放大倍数下将HUVEC单层调至清晰对焦，然后向凝胶内部移动视野，对凝胶全深度范围内的巨噬细胞/泡沫细胞进行计数。重复此操作，对距离凝胶边缘相近的三个不同视野区域进行计数，以尽量减少可能的边缘效应。此举可确保各计数区域间的凝胶深度保持一致。 
		注意：将凝胶中的细胞记分为泡沫细胞（定义为含有脂滴的细胞）或非泡沫细胞。 &gt;载玻片制备后2小时内，其细胞质的1/3以上呈现油红O染色的脂滴，或为巨噬细胞）图2）。泡沫细胞的形成以泡沫细胞占迁移细胞总数的百分比表示，每种条件检测6个凝胶，每个凝胶选取3个视野，以18个测量值的中位数表示。典型实验的原始细胞计数示例如下所示。 表2. 
		注意：通过显微镜将细胞分类为泡沫细胞或巨噬细胞具有主观性，因而可能依赖于研究者的判断。在持续较长时间的临床研究中，所有计数工作应由同一名研究者在盲法条件下完成，以确保一致性。凝胶中泡沫细胞与巨噬细胞的示例见 图2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过流式细胞术分析迁移细胞
<ol>
	<li>为在跨内皮迁移后对泡沫细胞和巨噬细胞进行表型表征，向每孔加入100 µL预先在37 °C下温育、用M199培养基稀释至1 mg/mL的胶原酶D，37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。 
	注意：将96孔板直接放置于洁净的金属架上并置于培养箱中，以确保受热均匀。</li>
	<li>孵育结束后，使用200 µL移液枪头反复吹打以破碎凝胶，并继续在37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。</li>
	<li>待凝胶完全消化后，将重复样本的消化液通过置于冰上的、带有35 µm尼龙滤网帽的FACS管过滤并合并，用FACS洗涤液（见材料表）在4 °C、300 × g条件下洗涤一次，然后将细胞重悬于100 µL FACS洗涤液中。</li>
	<li>按照标准流式细胞术操作流程，将所得细胞与荧光标记的抗体共同孵育，抗体应特异性针对CD45、活/死细胞标记物以及感兴趣的表面/细胞内表型或功能标记物。 
	注意：使用相应的荧光染料和Ig补偿微球制备用于补偿调节的对照管。提取的细胞也可通过细胞离心涂片法收集至玻片上，用于免疫荧光显微镜检测。此外，我们已成功应用本方案收集细胞，用于成像流式细胞术分析。</li>
	<li>使用流式细胞仪获取细胞数据，并根据需要进行补偿调节。 
	注意：由于泡沫细胞/巨噬细胞在光散射特性上可能无法形成独立的细胞群，且在大小和形态上可能存在显著差异，因此应设置较宽的前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）门限，以捕获所有迁移的细胞，如图3A所示。</li>
	<li>数据获取后，使用流式细胞分析软件进行数据分析。为鉴定迁移细胞，首先根据活/死细胞标记物阴性选择细胞，如图3B所示；随后，在SSC-面积与SSC-高度散点图上对单细胞进行鉴别，围绕细胞群设置紧密门限。</li>
	<li>选择CD45+细胞，并在FSC/SSC图中圈定迁移细胞的主要群体，该群体即为巨噬细胞/泡沫细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案结合单核细胞跨内皮迁移和泡沫细胞形成，提供了一种多功能且具有生理相关性的方法，用于评估来自人类临床队列的单核细胞致动脉粥样硬化能力。与传统的泡沫细胞形成方法相比，该模型具有优势，因为它不仅考虑了单核细胞跨内皮迁移对泡沫细胞形成的影响，还可测量逆向迁移过程6，同时评估单核细胞在存在或不存在外源性因素条件下分化为泡沫细胞的固有倾向。此外，本模型还考虑了内皮细胞活化的作用，因为我们已证明内皮细胞活化可上调与泡沫细胞形成相关的脂质物种的氧化14。最后，经历外排（与斑块消退相关的特性）的单核细胞表型可通过显微镜和流式细胞术进行定量和表征。
由于细胞向凝胶内三维迁移的特性，细胞在凝胶中迁移至不同深度，导致识别和判定迁移后的细胞为泡沫细胞或巨噬细胞较为困难19为辅助鉴定泡沫细胞，必须始终使用新鲜的油红O染液。还需注意，不同 离体 疾病状态或 体外 条件可能会改变单核细胞在凝胶中的跨膜迁移行为。我们采用活细胞...

单核细胞跨内皮迁移是动脉粥样硬化斑块形成过程中的关键步骤，可能导致血栓、中风和心肌梗死。动脉粥样硬化斑块起源于脂质条纹，通常出现在中等至大动脉中血流缓慢且呈振荡性的部位。在这些部位，沉积的脂质可导致内皮细胞活化并引发局部炎症1。单核细胞通过单核细胞趋化蛋白（如CCL2）被募集至脂质条纹处的内皮细胞，并迁移至内膜层2。迁移完成后，单核细胞可通过摄取脂质、合成脂质、胆固醇外排下调，或上述因素的联合作用，转变为具有致动脉粥样硬化特性的富含脂质的巨噬细胞，即泡沫细胞。此外，单核细胞也可能在血液循环中积累脂质，呈现“泡沫样”表型，这可能使其更易转化为泡沫细胞3,4。泡沫细胞是脂质条纹和早期动脉粥样硬化斑块的典型特征，其形成受到脂质和炎症介质的共同影响5。此外，单核细胞还具有从动脉壁反向迁移回血液循环的能力6，从而将脂质从内膜层清除，有助于维持动脉的健康状态。
确定单核细胞向动脉内皮迁移并在内膜中形成泡沫细胞的倾向，或反向迁移并将脂质从斑块中运出的能力，是理解单核细胞活化在增加动脉粥样硬化风险中作用的关键要求。动脉粥样硬化等冠状动脉疾病（CAD）的小鼠模型对于阐明脂肪条纹/动脉粥样硬化斑块形成的实时体内信息具有重要意义。然而，这些模型通常需要对动物天然的胆固醇代谢能力进行基因改造，并常伴随饮食上的剧烈改变（如ApoE-/-小鼠的西方饮食模型）7,8，从而诱导循环脂质水平的非生理性积累，驱动斑块形成。这些模型在慢性炎症性人类疾病（如HIV感染）中的相关性可能有限，因为后者并不伴有循环胆固醇或低密度脂蛋白（LDL）水平的升高。此外，人与小鼠之间单核细胞生物学的差异，使得针对单核细胞亚群（如中间型单核细胞（CD14++CD16+））相关免疫学问题的研究变得困难9。这一点在研究心血管疾病发病机制时尤为重要，因为中间型单核细胞计数可独立预测心血管事件10,11。尽管已有检测方法可分别依次测量单核细胞迁移或泡沫细胞形成，但目前尚无经过验证的体外检测方法能够使用来自临床队列的相同细胞同时定量评估动脉粥样硬化早期的这两个方面。Transwell模型采用改良的Boyden双室系统，将细胞加入上室，使其穿过一层多孔塑料膜或细胞单层，迁移至含有趋化因子培养基的下室12,13。尽管该模型被广泛用于分析白细胞迁移，但通常未包含代表内膜的结构层，导致迁移后的细胞进入溶液中，且无法对同一细胞的泡沫细胞形成或反向迁移进行检测。相反，现有的泡沫细胞形成模型未考虑单核细胞在迁移过程中可能发生的变化，也未纳入内皮细胞活化的影响，而后者已被证实可促进泡沫细胞形成14。此外，这些系统通过向贴附于细胞培养板的巨噬细胞添加饱和浓度的外源性氧化低密度脂蛋白（oxLDL）来诱导泡沫细胞形成15,16，oxLDL是泡沫细胞形成的关键诱导因子。这些模型中使用的LDL通常通过非生理性相关的方法（如CuSO4处理）进行氧化17，因而对使用这些模型的研究结果的生理学意义提出了质疑。
在此，我们描述了一种可定量检测同一细胞中单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的实验方法，该方法无需外源添加氧化型低密度脂蛋白（oxLDL），因而能更真实地模拟单核细胞在泡沫细胞形成过程中的作用。该模型最初由美国西北大学（芝加哥）威廉·穆勒（William Muller）教授团队开发。18，并已在我们的实验室中进一步优化，用于评估 离体 在非激活条件下从伴有炎症性疾病的个体（如HIV感染）中分离出的单核细胞的致动脉粥样硬化性19 以及衰老20，这些与动脉粥样硬化风险增加相关。该模型还为回答不同单核细胞亚群形成泡沫细胞倾向性的基础生物学问题提供了平台20细胞因子（如TNF）对内皮细胞活化在泡沫细胞形成中的影响14，以及单核细胞在凝胶中迁移的特性，如迁移深度和速度19此外，可利用标准显微镜、活细胞成像、流式细胞术和成像流式细胞术对单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成进行定量分析，从而提供一种多功能的方法以评估单核细胞在动脉粥样硬化发生中的作用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;凝胶制备试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-500G</td><td>0.1 M NaOH 溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>10x M199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0650</td><td></td></tr><tr><td>AcCOOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td>20 mM 乙酸溶于 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0</td></tr><tr><td>Cultrex 牛 I 型胶原蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3442-050-01</td><td>I 型纤维状胶原蛋白</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细胞培养&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>含 Earle 盐、L-谷氨酰胺和 2.2 g/L 碳酸氢钠的 M199 培养基。&lt;br/&gt; 培养基中补充 100 &amp;micro;g/mL L-谷氨酰胺&amp;nbsp; 和 100 U/mL 青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M20</td><td></td><td></td><td>补充了 20% 热灭活混合或供体血清的 M199 培养基。&lt;br/&gt; 可向 M199 中添加 LDL 等单个脂质成分。</td></tr><tr><td>HUVEC</td><td></td><td></td><td>人脐静脉内皮细胞（HUVEC）可从经知情同意和伦理批准捐赠的脐带中分离获得。分离后的 HUVEC 也可商业购买。</td></tr><tr><td>人冠状动脉内皮细胞</td><td></td><td></td><td>人冠状动脉内皮细胞可从经知情同意和伦理批准捐赠的动脉中分离获得。分离后的细胞也可商业购买。</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH Merck</td><td>10093.5V</td><td>乙二胺四乙酸（EDTA）— 0.5 M，pH 8.0</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889-500G</td><td>乙二醇双（&amp;beta;-氨基乙基醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）— 1 mM，pH 8.0</td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶 EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>0.05% 胰蛋白酶/0.53 EDTA（1X）</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>青霉素/链霉素（10,000 单位/mL 青霉素和 10,000 &amp;micro;g/mL 链霉素）</td></tr><tr><td>新生牛血清</td><td>Gibco</td><td>16010-142</td><td>新生牛血清：新西兰来源</td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056-1MG</td><td>纤连蛋白 — 制备并储存为 50 &amp;micro;g/mL 分装液</td></tr><tr><td>PBS（1x）</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td>杜氏磷酸盐缓冲液（10x）：用无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释至 1x</td></tr><tr><td>0.1% TNF</td><td>Gibco</td><td>PHC3015</td><td>重组人 TNF — 溶于 H20 并储存为 10 &amp;micro;g/mL 分装液</td></tr><tr><td>低密度脂蛋白</td><td>Merck Millipore</td><td>LP2-2MG</td><td>低密度脂蛋白（LDL）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;显微镜&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1% 或 2% 甲醛</td><td>Polysciences</td><td>4018</td><td>1% 或 2% 甲醛用无菌 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释</td></tr><tr><td>50% 和 78% 甲醇</td><td>Ajax Finechem</td><td>318-2.5L GL</td><td>50% 或 78% v/v 甲醇，用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释</td></tr><tr><td>油红 O 染色液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>用 22% 1M NaOH 和 78%（v/v）甲醇稀释至 2 mg/mL</td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Mikro-Glass</td><td>S41104AMK</td><td>双面磨砂 45 度斜边载玻片（25 × 76 mm）</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>MENCS224015GP</td><td>22 × 40 mm #1.5 规格玻璃盖玻片</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>3M Scotch</td><td>4011</td><td>高强度外用安装胶带（25.4 mm × 1.51 m）</td></tr><tr><td>吉姆萨染色液</td><td>Merck Millipore</td><td>1.09204.0500</td><td>吉姆萨伊红亚甲蓝溶液（将原液用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 稀释 1:10）</td></tr><tr><td>打孔器</td><td></td><td></td><td>手持式单孔打孔器（6.35 mm 打孔直径）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;流式细胞术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 D</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11088858001</td><td>胶原酶 D 用 M199 培养基稀释至 1 mg/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>35 &amp;micro;m 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>35 &amp;micro;m 尼龙网帽聚苯乙烯 FACS 管</td></tr><tr><td>活/死可固定黄色死细胞染料</td><td>Life Technologies</td><td>L34959</td><td>活/死可固定黄色死细胞染料</td></tr><tr><td>FACS 洗涤液</td><td></td><td></td><td>将 1 × PBS&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;、2 mM EDTA 和 1% 新生牛血清混合配制</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;塑料器皿&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Nunclon</td><td>167008</td><td>Delta 表面平底 96 孔板</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td>无菌 10 cm 培养皿</td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf 管</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td>Eppendorf 管</td></tr><tr><td>移液管</td><td>Samco Scientific</td><td>222-20S</td><td>无菌移液管（1 mL，大球泡）</td></tr></tbody></table>

慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

Quantification of Monocyte Transmigration and Foam Cell Formation from Individuals with Chronic Inflammatory Conditions

冠状动脉疾病（CAD）是全球发病率和死亡率的主要原因。动脉粥样硬化是导致CAD的主要病因，其起始过程为固有免疫单核细胞迁移至富含脂质的沉积部位（称为脂质条纹），这些脂质条纹存在于中等至大动脉的动脉壁内。在动脉粥样硬化的早期阶段，病变的关键致病特征是迁移至动脉内的单核细胞成熟为泡沫细胞或脂质负荷的巨噬细胞。大量证据支持以下假说：类风湿关节炎和HIV等疾病伴随的慢性炎症状态以及普遍的衰老过程会增加动脉粥样硬化的风险，而这种风险可通过单核细胞的活化来预测。尽管小鼠模型为研究单核细胞在动脉粥样硬化发生中的作用提供了良好的平台 体内，它们需要对天然胆固醇代谢进行基因改造，并大幅改变小鼠的正常饮食，因此在研究人类共病疾病对动脉粥样硬化影响方面的适用性有限。这促使我们开发一种人类 体外 用于评估来自特定疾病状态个体的单核细胞致动脉粥样硬化潜能的模型。目前，人类 体外 模型的局限性在于其仅孤立地评估单核细胞的跨内皮迁移和泡沫细胞形成。本文描述了一种实验方案，该方案中从患者血液中分离的单核细胞穿过人源内皮细胞层进入Ⅰ型胶原基质，并检测其在有或无外源性脂质存在条件下向泡沫细胞分化的倾向性。该方案已验证可用于从HIV感染者及老年非HIV感染者中纯化的单核细胞。此模型具有良好的可变性，既可通过显微镜观察也可通过流式细胞术来评估单核细胞的跨内皮迁移和泡沫细胞形成，同时还能检测血清或血浆中存在的促动脉粥样硬化因子。

单核细胞迁移的定量分析
单核细胞按图1所述加入模型中，每种条件准备6个凝胶。每个供体用于6个凝胶的单核细胞（i.e.，每个凝胶5.0 × 104个单核细胞 × 6个凝胶 = 每个供体3.0 × 105个单核细胞）重悬于600 µL含指定血清/分离脂质的M199培养基中，终体积为600 µL。随后将细胞（i.e.，每凝胶100 µL = 5.0 × 104个单核细胞）分装至凝胶上，并按前述条件孵育1小时，以促进单核细胞跨膜迁移。跨膜迁移后，按前述方法计数未迁移的细胞。本示例中，回收到1.5 × 104个未迁移细胞。前向迁移百分比通过步骤5.4中所述公式计算：
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我们描述了一种用于测量单核细胞穿过人内皮单层并进一步成熟为泡沫细胞的跨内皮迁移实验方案。该方法可灵活评估来自不同疾病状态个体的单核细胞的致动脉粥样硬化特性，并可用于评价血液中可能增强这种倾向的各类因素。

冠状动脉疾病（CAD）是全球范围内导致发病和死亡的主要原因。动脉粥样硬化是导致CAD的主要病因，其起始过程由……

本实验的总体目标是定量评估来自人类临床样本的单核细胞穿越内皮细胞迁移及形成泡沫细胞的能力。该方法可用于回答心血管领域中的关键问题，例如评估有急性冠状动脉疾病风险个体的细胞致动脉粥样硬化潜能。该技术的主要优势在于，既可使用新鲜全血，也可利用储存的患者队列样本进行检测。此外，泡沫细胞的形成可以通过显微镜和流式细胞术进行定量。首先，从新鲜的胶原蛋白悬浮液制备聚合的胶原凝胶。向一个5毫升的聚苯乙烯管中，依次加入氢氧化钠、10倍浓度的M199培养基、乙酸，最后加入纤维状胶原蛋白。用移液器充分混匀。随后，将50微升分装至无菌平底96孔细胞培养板的内侧孔中。在板的外周孔中加入200微升1倍浓度的杜氏磷酸盐缓冲液，以防止干燥。在37摄氏度孵育两小时后，胶原蛋白将发生聚合。随后，每孔加入150微升一倍浓度的补充M199培养基覆盖凝胶，并继续孵育至使用前，通常为五天后。为扩增保存的人脐静脉内皮细胞，用1毫升纤连蛋白溶液处理一个25平方厘米的培养瓶，室温孵育10分钟。 同时，将储存的细胞在水浴中解冻，以M20重悬细胞。细胞解冻后，吸除培养皿中残留的纤连蛋白溶液，并接种细胞。随后，每两到三天更换一次培养基，培养至细胞融合。培养至第5天时，HUVECs应达到汇合状态。通过吸除培养瓶中的上清液来分离细胞，然后使用2至3毫升的1×PBS洗去含血清的培养基。随后，加入5毫升稀释的胰蛋白酶，在室温下短暂孵育，并轻轻摇动细胞，直至细胞脱落。然后，用5毫升M20快速收集细胞，将悬液转移至10毫升离心管中并离心收集细胞。接着，将细胞重悬于M20中，浓度为每毫升200,000个细胞。随后，吸除预先制备的胶原板中的M199培养基，并向每孔凝胶中加入100微升HUVECs。继续培养三天。在培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的第8天，在加入单核细胞之前激活单层细胞。吸除上层培养基后，向每个孔中加入100 µL人肿瘤坏死因子-α（TNF-α）溶液。然后，将培养板在37摄氏度下孵育4小时。孵育结束后，移除培养基，并用100微升M199培养基洗涤凝胶两次。接着，在100微升M20培养基中加入50,000个 freshly isolated monocytes 或纯化的单核细胞亚群，加入至HUVEC单层细胞中。加入单核细胞后，将培养板孵育1小时，以允许细胞进行正向转迁移。1小时后，收集洗液中的未转迁移细胞。首先，使用每孔100微升的EGTA溶液进行两次洗涤并合并洗液。然后，在 4 摄氏度条件下，以 300 ×g 离心 5 分钟，沉淀合并的洗涤液。弃去上清液，将细胞重悬于 30 µL PBS 中，并对细胞进行计数，以确定前向迁移细胞的百分比。接着，用 M199 洗涤培养板孔一次，每孔加入 100 µL 新鲜 M20 培养基，将培养板继续孵育 2 天。两天后，重复使用 EGTA 洗涤液收集非迁移细胞的操作步骤，以收集反向迁移的细胞，并继续进行细胞的表型分析。为了通过流式细胞术对凝胶结合细胞进行表型表征，加入 100 µL 37°C 的胶原酶 D，37°C 下孵育 20 分钟以消化细胞。孵育结束后，使用 200 µL 移液枪头研磨凝胶，并继续孵育 20 分钟，以彻底消化凝胶。完全消化后，将消化后的重复凝胶样品通过35微米尼龙滤网过滤，并收集到预冷的FACS管中。随后，用冷的FACS洗涤液将滤过的细胞洗涤一次。离心细胞，并将其重悬于100微升冷洗涤液中。然后，根据文中的实验方案进行FACS染色和分析。若需通过显微镜分析细胞，首先按照文中的实验方案对细胞进行染色。为分离染色后的细胞，使用21号针头沿孔壁划圈，针头斜面朝外。接下来，准备用于固定凝胶的载玻片。在一条双面胶带上打两个小孔，然后将胶带固定在载玻片上，并移除保护层。接着，向胶带上的每个孔中加入一滴水。然后，使用镊子将两块凝胶轻轻转移至两个孔上，并覆盖胶带。最后，小心地将盖玻片贴附到胶带上，进行细胞的观察。跨膜迁移结束后，按照前述方法对未迁移的细胞进行计数。共回收了 15,000 个未发生前向迁移的细胞，前向迁移率确定为 95%。经过 48 小时的进一步培养后，回收了 36,000 个反向迁移的细胞，相当于 12.6% 的反向迁移率。用油红 O 染色凝胶后，可见由白色箭头指示的泡沫细胞和由黑色箭头指示的巨噬细胞。这些单核细胞在迁移过程中经氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）处理，该物质在传统的泡沫细胞诱导模型中用于诱导泡沫细胞的形成。来自12名供体的细胞计数数据汇总证实，单核细胞与氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）共孵育时，比与天然型低密度脂蛋白（native LDL）或单独M199培养基孵育时诱导形成更多的泡沫细胞。对跨内皮迁移的细胞也进行了流式细胞术分析。在排除死细胞、双联体以及CD45阴性的HUVECs后，选取主要的迁移细胞群体，并将目标受体的平均荧光强度与荧光减一（fluorescence minus one）或同型对照数据进行比较。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用该检测方法对人源临床样本中的单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成进行定量分析。请务必注意，处理人源临床样本可能具有极高的危险性，必须始终采用规范的实验室操作技术。

quantification-monocyte-transmigration-foam-cell-formation-from

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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体内单核细胞趋化活性的定量分析及血液单核细胞来源巨噬细胞的表征

本文介绍了一种详细且可重复的流式细胞术方案，利用已建立的小鼠骨关节炎手术模型，通过胞外和胞内染色实验，鉴定小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织中的单核细胞/巨噬细胞和T细胞亚群。...

骨关节炎模型中经由流式细胞术分析小鼠脾脏、骨髓、淋巴结及滑膜组织内的免疫细胞亚群

了解单核细胞跨内皮迁移和泡沫细胞形成的定量研究方法。该技术使用人内皮单层和聚合胶原蛋白凝胶，通过显微镜和流式细胞术进行分析，可评估心血管疾病风险个体的致动脉粥样硬化潜力。

慢性炎症状态下单核细胞跨内皮迁移及泡沫细胞形成的定量分析

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