慢性炎症状态个体的单核细胞轮回和泡沫形成的定量研究
2017年10月17日
我们描述了一项协议, 以测量单核细胞在人的内皮单分子膜的轮回, 并随后成熟成泡沫电池。这提供了一种通用的方法来评估的动脉粥样硬化性质的人单核细胞分离的不同疾病的情况下, 并评估血液中的因素, 可能会提高这种倾向。
该测定的总体目标是量化人类临床样本中单核细胞经历跨内皮迁移和泡沫细胞形成的能力。该方法可用于回答心血管领域的关键问题，例如有急性冠状动脉疾病风险的个体细胞的动脉粥样硬化潜力。该技术的主要优点是可以从新鲜全血或储存的患者队列中测量临床样本。
此外，泡沫细胞的形成可以通过显微镜和流式细胞术进行量化。首先，从新鲜的胶原蛋白悬浮液中制备聚合的胶原蛋白凝胶。向 5 毫升聚苯乙烯管中加入氢氧化钠，然后加入 10 倍 M199，然后加入酸性，最后加入纤维状胶原蛋白。
通过移液将其充分混合。接下来，将 50 μL 分装到无菌平底 96 孔组织培养板的内孔中。在孔的外边缘，加载 200 微升 1 倍的 Dulbecco PBS 以防止干燥。
在 37 摄氏度下孵育 2 小时后，胶原蛋白会聚合。然后，用 150 微升 1 次补充的 M199 覆盖凝胶，并孵育它们直到 5 天后需要使用。为了扩增储存的人脐静脉内皮细胞，用 1 毫升纤连蛋白溶液制备一个 25 平方厘米的培养瓶，并在室温下孵育培养皿 10 分钟。
同时，在水浴中解冻储存的细胞，以将它们重悬于 M20 中。细胞解冻后，从培养皿中吸出任何残留的纤连蛋白溶液并对细胞进行铺板。然后，在 2 到 3 天后更换培养基培养以汇合。
HUVEC 应在培养的第 5 天汇合。从培养瓶中吸出培养物的上清液，将其分离，然后使用 2 至 3 毫升 1 倍 PBS 洗去含血清的培养基。然后，加入 5 mL 稀释的胰蛋白酶，在室温下短暂孵育细胞，轻轻摇动细胞，直到它们出现分离。
然后，用 5 毫升 M20 快速收集它们，并将悬浮液转移到 10 毫升试管和离心细胞中。现在，以每毫升 200， 000 个细胞的速度将细胞重悬于 M20 中。然后，从准备好的胶原蛋白板中吸出 M199，并向每个凝胶中加入 100 微升 HUVEC。
继续培养 3 天。在培养 HUVEC 的第 8 天，在添加单核细胞之前激活单层。吸出覆盖培养基后，向每个孔中加入 100 微升人 TNF-α 溶液。
然后，将板在 37 摄氏度下孵育 4 小时。孵育后，去除培养基，每次洗涤使用 100 μL M199 洗涤凝胶两次。现在，将 50， 000 个新鲜分离的单核细胞或纯化的单核细胞亚群添加到 100 微升 M20 中到 HUVEC 单层中。
添加单核细胞后，将板孵育一小时，以允许细胞向前迁移。一小时后，将非转袭细胞收集在洗涤液中。首先合并两次 EGTA 洗涤液，每孔使用 100 μL。
然后，在 4 摄氏度下以 300 G 的浓度离心混合洗涤液 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 30 微升 PBS 中，并计数细胞以确定正向转袭细胞的百分比。现在，用 M199 洗涤板孔一次，向板孔中加入 100 微升新鲜 M20，并将板孵育两天。
两天后，重复在 EGTA 洗涤液中收集非转袭细胞的程序，以收集反向转袭的细胞并继续进行细胞的表型分析。为了通过 FACS 分析对凝胶结合细胞进行表型表征，通过添加 100 微升 37 摄氏度胶原 D 并在 37 摄氏度下孵育 20 分钟来消化细胞。孵育后，使用 200 μL 移液器吸头浸渍凝胶，再孵育 20 分钟以完全消化凝胶。
完全消化后，通过 35 微米尼龙网将消化的复制凝胶过滤并汇集到冰上的 FACS 管中。现在，用冷的 FACS 洗涤液洗涤过滤的细胞一次。离心细胞并将它们重悬于 100 微升冷洗溶液中。
然后，根据文本方案进行 FACS 染色和分析。要通过显微镜分析细胞，首先按照文本方案中的说明对细胞进行染色。要分离染色的细胞，请使用 21 号针头将孔边缘固定，斜面朝外。
接下来，准备载玻片以封片凝胶。在一条双面胶带上打两个小孔，然后将胶带固定在载玻片上并去除保护涂层。接下来，在胶带的每个孔中加入一滴水。
然后，使用镊子轻轻地将两块凝胶转移到两个孔上并盖住胶带。最后，小心地将盖玻片贴在胶带上，然后进行细胞的可视化。迁移后，如所述对未迁移的细胞进行计数。
共回收了 15， 000 个未迁移的细胞，确定正向迁移的百分比为 95%进一步孵育 48 小时后，回收了 36， 000 个反向迁移细胞，相当于 12.6% 的反向迁移。用油红色 O 染色凝胶，显示白色箭头指出的泡沫细胞和黑色箭头指出的巨噬细胞。这些单核细胞在迁移过程中用氧化的 LDL 处理，这是一种在常规泡沫细胞诱导模型中用于诱导泡沫细胞形成的物质。
来自 12 名供体的细胞计数汇总数据证实，与单核细胞单独使用天然 LDL 或 M199 培养基孵育单核细胞相比，单核细胞与氧化 LDL 一起孵育诱导了更多的泡沫细胞形成。还通过流式细胞术分析转袭细胞。在排除死细胞、双峰和 CD45 阴性 HUVEC 后，选择迁移细胞的主要群体，并将目标受体的平均荧光强度与荧光减 1 或同种型对照数据进行比较。
观看此视频后，您应该对如何使用该检测试剂盒定量人类临床样品中的单核细胞跨内皮迁移和泡沫细胞形成有很好的了解。不要忘记，处理人类临床样本可能非常危险，必须始终使用良好的实验室技术。
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概述
本文介绍了一种测量单核细胞跨越人类内皮单层并成熟为泡沫细胞的协议。该方法对于评估来自不同疾病状况个体的单核细胞动脉粥样硬化特性非常有价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 心血管研究
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 单核细胞在动脉粥样硬化中扮演着至关重要的角色。
- 了解它们的行为可以为心血管疾病提供洞察。
- 跨内皮迁移是单核细胞功能的关键过程。
- 泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化发生的重要事件。
研究目的
- 量化人类临床样本中单核细胞的跨内皮迁移。
- 评估泡沫细胞的形成作为动脉粥样硬化潜力的测量。
- 评估血液中各种因素对单核细胞行为的影响。
使用的方法
- 从新鲜胶原悬液中制备聚合胶原凝胶。
- 使用人类内皮单层进行跨迁移测定。
- 通过显微镜定量分析泡沫细胞的形成。
- 使用流式细胞术对细胞变化进行详细分析。
主要结果
- 证明了有效测量单核细胞跨迁移的能力。
- 显示临床样本可以从新鲜血液和储存的队列中分析。
- 建立了单核细胞行为与动脉粥样硬化风险之间的相关性。
- 验证了使用显微镜和流式细胞术定量泡沫细胞的方法。
结论
- 该协议为研究心血管研究中单核细胞行为提供了一种多功能的方法。
- 它可以帮助识别急性冠状动脉疾病风险个体。
- 未来的研究可以利用这种方法探索治疗干预。
常见问题
Executive Industry Relevance
This human in vitro model enables direct assessment of monocyte transmigration and foam cell formation from clinical samples, providing a disease-relevant system for evaluating atherogenic potential in comorbid conditions such as HIV and aging. By capturing key early atherogenic events in a human cellular context, the assay supports mechanistic de-risking in cardiovascular target validation and lead identification efforts. It bridges the gap between murine model limitations and human pathophysiology, offering predictive value for prioritizing therapeutic candidates targeting monocyte-driven inflammation in atherosclerosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying monocyte transmigration and foam cell formation as functional readouts of atherogenic potential in disease-relevant human cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets involved in monocyte-endothelial interactions using primary monocytes from defined clinical cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating monocyte behavior with known atherogenic stimuli like oxidized LDL, enhancing confidence in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative outputs via microscopy or flow cytometry to assess monocyte migration and lipid-laden macrophage formation under controlled conditions.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for screening serum or plasma factors that modulate monocyte transmigration or foam cell maturation.
- Scalability: Compatible with 96-well format and cryopreserved samples, enabling batch processing of clinical cohorts for biomarker discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant human monocytes from individuals with chronic inflammatory conditions (e.g., HIV, aging) to model human-specific atherogenic mechanisms not fully recapitulated in mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase monocyte behavior to preclinical validation by measuring responses to pro-atherogenic ligands like oxidized LDL.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables evaluation of how comorbid diseases alter monocyte phenotype, informing patient stratification strategies in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immune cell assays that inform early cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on monocyte activation states and endothelial crosstalk in atherosclerosis pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized readouts for evaluating compound effects on monocyte transmigration and foam cell formation.
- Analytics: Generates quantitative metrics (e.g., % transmigration, mean fluorescence intensity) enabling comparison across experimental conditions and donor groups.
- Translational Research: Uses primary human monocytes to enhance clinical relevance of mechanistic findings before preclinical investment.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various stimuli (e.g., cytokines, lipids, serum) and readouts across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by measuring functional monocyte behavior in a human disease-relevant system.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined steps for collagen gel preparation, endothelial monolayer formation, and cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying targets that modulate monocyte-driven atherogenic processes early in discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on effects in human monocyte assays from clinically relevant cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, endothelial cell culture, and sterile technique for handling clinical blood samples.
- Dependent on consistent sourcing of fibrinolytic collagen, endothelial cells (HUVECs), and endotoxin-free reagents for reproducible gel polymerization.
- Necessitates standardized protocols for monocyte isolation (e.g., PBMC purification) and activation status assessment across donor cohorts.
- Requires access to flow cytometry or fluorescence microscopy platforms for endpoint quantification of transmigrated and foam cells.
- Limited by donor variability and sample availability; necessitates adequate cohort sizing for statistical power in comparative studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Culturing HUVEC Monolayer on Collagen Gels
3:38
Activation of HUVEC Monolayer and Isolation/Activation of Monocytes for Transmigration
5:44
Quantification of Foam Cells and Macrophages by Microscopy or Flow Cytometry
7:42
Results: Characterizing the Transmigrating Mice
9:09
Conclusion
