Name: 胸腺1-gmcmp6 转基因小鼠在原代体血源皮质中的成像神经活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 了解双光子显微镜技术在Thy1-GCaMP6s转基因小鼠中进行钙成像的方法，用于记录双侧初级体感皮层的神经活动。该技术可实现长期稳定的神经元群体活动监测，为研究大脑功能和可塑性提供重要工具。

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我们非常感谢美国纽约大学医学院斯克尔普尔研究所生理学与神经科学系的甘文彪（Wenbiao Gan）在技术方面提供的卓越指导，以及印第安纳大学医学院神经外科系医学编辑帕蒂·雷利（Patti Raley）对本文手稿的编辑工作。我们感谢美国印第安纳大学医学院斯塔克神经科学研究所陈金辉博士（Dr. Jinhui Chen）提供 B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J 小鼠。本研究部分得到了中国解放军济南军区总医院院长基金 2016ZD03（XJL）、美国国立卫生研究院 NS059622、NS073636、美国国防部陆军医学研究与发展司令部 W81XWH-12-1-0562、美国退伍军人事务部杰出研究奖 I01 BX002356、克雷格·H·尼尔森基金会 296749、印第安纳脊髓与脑损伤研究基金会以及玛丽·胡尔曼·乔治捐赠基金（XMX）的资助。

所有外科手术和动物操作均按照《实验动物护理和使用指南》（美国国家研究委员会）以及印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会指南的规定批准后进行。双光子成像系统的示意图如图1所示。
1. 准备用于成像的动物
<ol>
	<li>将无菌纱布、棉签和高压灭菌的手术器械放置于手术区域（表1）。开启微型珠式灭菌器，用于手术间器械的快速灭菌。</li>
	<li>通过腹腔注射（i.p.）给予小鼠（雄性或雌性，1.5–2.5月龄，20–25 g）混合麻醉剂（氯胺酮 17.2 mg/mL、赛拉嗪 0.475 mg/mL 和乙酰丙嗪 0.238 mg/mL），剂量为 6 µL/g 体重。待小鼠对脚趾夹捏刺激无反应且角膜反射消失时，表明已达到适宜的麻醉深度。手术过程中，根据需要追加原始剂量1/3的麻醉混合液，以维持初始麻醉状态。</li>
	<li>术前皮下注射（s.c.）布托啡诺（0.05–0.10 mg/kg）作为镇痛剂。在动物眼部涂抹保护性眼膏，防止角膜干燥及白内障形成。</li>
	<li>将GCaMP6s转基因小鼠置于加热垫上以防止低体温，并用无菌手术单覆盖身体。使用小鼠头部固定适配器稳定动物头部。</li>
	<li>使用双面剃须刀片剃除大部分头皮区域的毛发。先用无菌酒精棉片清洁手术区域，再使用聚维酮碘溶液进行消毒。</li>
</ol>
2. 慢性颅窗制备
<ol>
	<li>使用剪刀在颅骨的一侧（右侧）头皮上做一个矩形切口（2 mm × 3 mm）。用棉签将皮肤推开，形成一个直径大于&#62;3 mm 的暴露区域（图 3A）。用钝头显微外科刀片（手术刀片 #10）轻轻刮除附着在颅骨上的结缔组织（图 3C）。</li>
	<li>使用牙科钻头在颅骨上轻轻画一个圆圈（直径 3 mm，中心坐标：前囟后方 1.5 mm，中线外侧 2.5 mm），以标记 S1 区域（图 2B）。</li>
	<li>在左侧颅骨上重复相同操作（图 2B）。</li>
	<li>在骨面上涂一层薄薄的氰基丙烯酸酯超级胶水，为后续涂抹牙科水泥提供基底。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用高速微型钻头在颅骨上围绕 S1 区域磨出一个环形凹槽（图 3D），目的是形成光滑的边缘，以便放置光学窗口。</li>
	<li>在减薄过程中，定期反复滴加人工脑脊液（ACSF，室温）至颅骨表面，以利于钻孔并散热。间歇性进行钻孔操作，避免因摩擦导致过热。使用实验室真空管线或真空泵吸除骨屑。</li>
	<li>当钻至骨层约 2/3 深度时，缓慢而小心地继续减薄剩余的 1/3 骨层，直至颅骨中形成一块完全游离的圆形骨片（骨瓣）。</li>
	<li>使用 #5/45 镊子缓慢而小心地移除该圆形骨瓣，暴露硬脑膜（图 2C；图 3E）。</li>
	<li>用 ACSF 保持暴露脑区湿润（图 3E）。避免损伤软脑膜血管，因为出血会改变脑血流、加速脑肿胀，并严重降低成像质量。</li>
	<li>在颅骨左侧（对侧）重复相同操作。</li>
	<li>组装光学窗口时，使用光学胶逐层粘合盖玻片并固化。如有必要，可将光学窗口置于培养箱中加热（50 °C，12 小时）以增强胶合强度。光学窗口由两部分组成：上部为一片直径 5 mm 的圆形盖玻片，下部为 1–3 片直径 3 mm 的圆形盖玻片（图 2D）。</li>
	<li>将光学窗口保存于乙醇（70%，体积比）中，使用前用无菌生理盐水冲洗。在安装光学窗口前，需在体视显微镜下检查其是否存在缺陷，例如光学胶用量不当或对位不准。</li>
	<li>将光学窗口安装在开颅区域上方（图 2D）。光学窗口的上部置于颅骨表面，下部嵌入开颅孔洞内，在脑脊液存在的情况下与硬脑膜接触（图 2D，E）。</li>
	<li>使用氰基丙烯酸酯超级胶水将光学窗口上部边缘密封固定于颅骨上（图 2F；图 3F）。</li>
	<li>待氰基丙烯酸酯超级胶水干燥后，用黑色牙科水泥（Dentsply）覆盖玻璃边缘，并将牙科水泥涂抹至所有暴露的颅骨及伤口边缘，以屏蔽光线（图 2G-H；图 3B）。</li>
	<li>在左侧重复相同操作。</li>
	<li>将动物置于加热垫上恢复，并在适当监测下送回原笼中继续恢复。提供湿粮以利于咀嚼和补水。为减轻疼痛，可在损伤后每 8–12 小时皮下注射一次布托啡诺（0.05–2.0 mg/kg），持续 2 天。成像前需额外恢复 7–10 天。</li>
</ol>
3. 双光子成像
<ol>
	<li>实验当天，使用氯胺酮和赛拉嗪对动物进行麻醉（麻醉剂量及维持方法同上）。用75%（体积/体积）乙醇清洁颅窗。</li>
	<li>将小鼠置于成像装置下，该装置由双光子显微镜和头部固定适配器组成，小鼠身下垫有加热垫，通过耳杆将其头部固定于小鼠头部固定器中。</li>
	<li>一次仅对光学窗口的一侧进行成像。为尽量减少光学像差，请确保光学窗口和右侧颅骨与显微镜的光轴垂直。</li>
	<li>以4倍放大倍率在明场照明下拍摄颅窗的初始图像，作为与高倍放大双光子血管造影图像进行配准的参考图谱图4A1).</li>
	<li>使用10倍放大倍数对目标区域进行放大观察图 4A2).</li>
	<li>在皮层第 I 或 II 层（软脑膜表面下不超过 150 µm）的 S1 区域选择一个感兴趣区域。如需更高放大倍数，可使用 20X 物镜。</li>
	<li>寻找包含多个神经元的视野。使用双光子显微镜采集图像（图4B）根据GCaMP6s的表达深度和水平确定曝光时间及激发光强度（≈910 nm），信号较弱时需延长曝光时间，但相应会降低时间分辨率。我们通常采用每像素约4 µs的曝光时间。以512 × 512像素的分辨率，以3–5 Hz的帧率采集图像。</li>
	<li>开始记录时间序列。在低倍镜图像中，相对于血管模式或参照标记点，存储每个感兴趣区域（ROI）的坐标。随时间对同一ROI进行成像。采用相同步骤观察左侧半球S1区域的钙动力学变化。计算各ROI的荧光强度变化。</li>
	<li>单独获取图像或以延时摄影方式获取图像（图4C1-C3、D、E).</li>
	<li>研究皮层血流动力学 体内 通过向啮齿类动物尾静脉注射荧光葡聚糖染料，并利用双光子显微镜成像。以血管系统作为解剖标志，识别并长期多次成像同一感兴趣区域（ROI）。</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>使用 ImageJ 和 Origin 进行图像分析。用 ImageJ 导入图像序列（图 5A-B）。对于单张图像（或时间序列视频），在成像神经元内选择一个感兴趣区域（ROI），并在其附近选择两个独立的区域用于背景测量（图 5C）。使用 ROI 管理器获取总荧光强度（图 5C）。 
	注意：图 6 展示了典型的钙成像图像。在初次安装窗口后第 7 天的小鼠中，钙瞬变信号（绿色）和血管（红色）在不同时间点（以秒为单位）的图像如（图 6A-D）所示。红色和绿色通道在 3 分钟记录期间的 z 投影图像（图 6E）或仅绿色通道的 z 投影图像（图 6F）也一并展示。z 投影显示了视频中所有图像的压缩结果，从中可手动选择一个大致呈圆形的边界（覆盖所有帧中目标神经元），同时选择两个独立的邻近背景区域（图 6G）。</li>
	<li>从每个 ROI 中计算平均荧光背景值 FB，FB = (FB1 + FB2) / 2，并计算胞体荧光变化（F），以 ΔF/F 表示，即 ΔF/F = (F - FB) / FB。</li>
	<li>使用 ImageJ 提供的功能逐步进行峰分析，包括基线校正、峰检测/确定、峰积分、峰拟合和/或节省时间的峰分析功能。</li>
</ol>

<ol><li>Cichon, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branch-specific+dendritic+Ca%282%2B%29+spikes+cause+persistent+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Branch-specific dendritic Ca(2+) spikes cause persistent synaptic plasticity.</a> Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).</li>
<li>Andermann, M. L., Kerlin, A. M., Roumis, D. K., Glickfeld, L. L., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specialization+of+mouse+higher+visual+cortical+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Functional specialization of mouse higher visual cortical areas.</a> Neuron. 72 (6), 1025-1039 (2011).</li>
<li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475 (7357), 501-505 (2011).</li>
<li>Mittmann, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+evoked+activity+from+L5+somatosensory+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo.</a> Nat Neurosci. 14 (8), 1089-1093 (2011).</li>
<li>Katona, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+two-photon+in+vivo+imaging+with+three-dimensional+random-access+scanning+in+large+tissue+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes.</a> Nat Methods. 9 (2), 201-208 (2012).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+the+Dendritic+Spines+in+the+Hindlimb+Representation+of+the+Sensory+Cortex+after+Spinal+Cord+Hemisection+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Remodeling the Dendritic Spines in the Hindlimb Representation of the Sensory Cortex after Spinal Cord Hemisection in Mice.</a> PLoS One. 10 (7), e0132077(2015).</li>
<li>Keck, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+scaling+and+homeostatic+plasticity+in+the+mouse+visual+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic scaling and homeostatic plasticity in the mouse visual cortex in vivo.</a> Neuron. 80 (2), 327-334 (2013).</li>
<li>Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+miniature+head-mounted+two-photon+microscope.+high-resolution+brain+imaging+in+freely+moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals.</a> Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).</li>
<li>Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+functional+imaging+in+behaving+rats+using+voluntary+head+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution functional imaging in behaving rats using voluntary head restraint.</a> Neuron. 80 (2), 371-384 (2013).</li>
<li>Luongo, F. J., Horn, M. E., Sohal, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+Microcircuit-Level+Substrates+for+Attention+Are+Disrupted+in+Mouse+Models+of+Autism%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Putative Microcircuit-Level Substrates for Attention Are Disrupted in Mouse Models of Autism.</a> Biol Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).</li>
<li>Wachowiak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+dissection+of+odor+information+processing+in+vivo+using+GCaMPs+expressed+in+specified+cell+types+of+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical dissection of odor information processing in vivo using GCaMPs expressed in specified cell types of the olfactory bulb.</a> J Neurosci. 33 (12), 5285-5300 (2013).</li>
<li>Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protoc. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

双光子成像能够在脑表面下深达约800 µm处以合理的分辨率同时测量大量细胞的活动。我们结合双光子成像与双光学窗口技术，并利用基因编码的GCaMP6s，以观察位于第V层的神经元胞体群体中的钙动力学 &#62;距软脑膜下500 µm处。通过在颅骨两侧建立开放的光学窗口，该方法可实现对称哺乳动物脑区神经活动的长期稳定钙成像记录 体内该方法的关键在于通过微创手术创建双侧开放式颅骨光学窗口，并对对称的S1区域进行双光子成像以观察神经元活动。
检查双侧S1区域的网络活动是利用双颅窗探究成年大脑局部及对称信息处理的一个示例 体内该方法也可用于研究神经元活动（例如 使用 Thy1-GCaMP6s 小鼠）和皮质可塑性 B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J 小鼠在单侧中枢神经系统损伤导致去传入后，从相应对称脑区的完整组织中恢复。该方法也可用于检测大脑皮层对周围刺激策略（如光遗传学、电或化学刺激）的响应活动。尽管本文仅在初级体感皮层（S1）区域展示了该技术，但该方法同样适用于研究活体脑中其他对称区域的神经活动，例如初级运动皮层（M1）的第五层神经元。对脑区重组现象的观察可能为适应性运动行为提供神经基础，而适应性运动行为在损伤后的功能恢复中起着关键作用。此外，该方法还能够在头固定小鼠进行行为任务时，对遗传学标记细胞的对称性活动进行长期测量。
从技术上讲，研究人员应仔细关注双颅窗的质量和一致性。减薄颅骨颅窗技术 12 初学者强烈建议进行练习。由于树突棘的形态及其局部的钙离子流入和排出机制，使其成为钙离子的区室化结构。在本研究中，我们使用了B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J 小鼠为例，演示树突棘动态 体内 (图4）。开放颅骨玻璃窗植入手术可能导致术后树突棘高周转率及反应性胶质细胞反应 12相比之下，使用去薄颅骨窗技术可以很好地保存树突棘和树突。
光学窗口的尺寸和厚度选择将取决于所需的视野范围、颅骨曲率、颅骨厚度以及成像类型13。若光学盖玻片对硬脑膜施加的压力不足，可能导致硬脑膜增厚、颅骨再生以及脑组织运动增加；相反，若光学盖玻片压力过大，则可能阻碍皮层血流。
在光学窗口组装过程中，使用光学粘合剂和长波长紫外光逐层粘合并固化盖玻片。为增强粘合强度，将制备好的窗口在培养箱中加热（50 °C，12 小时）。将光学窗口盖玻片保存在 70%（体积/体积）乙醇中，在手术前用无菌生理盐水冲洗。使用前需在体视显微镜下检查光学窗口是否存在缺陷（如光学粘合剂用量不当或对位不准确），以避免失败。若光学粘合剂过薄，可能产生气隙，导致光学像差或植入时盖玻片脱落；相反，粘合剂过多则可能导致其溢出颅窗边缘。
综上所述，本文描述了一种实验方法，利用双光子显微镜，通过颅窗对 Thy1-GCaMP6s 和 Thy1-YFP 转基因小鼠的两个对称的初级体感皮层区域，分别测量钙动力学或树突形态。该技术有望显著促进对神经网络复杂结构与功能关系的解析。

钙及其调控在介导多种生理过程中至关重要。监测钙动态有助于理解大脑的正常功能以及脑部疾病的病理状态 1,2,3,4,5,6,7,8成像GCaMP6s荧光是量化神经元放电数量、时间、频率以及突触输入水平的有力工具，同时 体外 和 体内 9,10,11.
哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。尽管近期的神经科学研究已揭示了创伤性脑损伤或脊髓损伤所引发的大脑皮层重塑及神经元活动变化6,7，但对侧对称区域中完好组织在功能恢复过程中所起的作用仍不明确。
在本研究中，我们描述了制备双侧对称光学窗口的实验步骤 体内 成像。利用这些光学窗口，我们描述了使用双光子显微镜在GCaMP6s转基因小鼠的初级体感皮层（S1）中测量钙动力学的方法。在结果部分，我们还展示了 体内 利用双光子成像技术观察EGFP转基因小鼠S1区在不同时间点的树突形态。针对双侧S1区域网络动态的观测方法，仅是双侧开放颅窗技术助力神经科学家研究成年哺乳动物大脑在正常状态或不同疾病模型下局部及对称信息处理能力的初步范例。 体内.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J-Tg(Thy1-GCaMP6s)GP4.3Dkim/J</td><td>Jackson</td><td>24275</td><td>可以是任何通过遗传编码的神经元指示剂和效应器在大脑皮层部分兴奋性神经元中表达绿色荧光钙指示剂GCaMP的品系。</td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Thy1-EGFP)OJrs/GfngJ.</td><td>Jackson</td><td>7919</td><td>可以是任何在大脑皮层特定神经元群体中表达EGFP的品系；可提供明亮的、类似高尔基染色的活体标记。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dumont no. 5 forceps, standard, Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Dumont no. 5SF forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Micro Bead Sterilizer</td><td>Southern Labware</td><td>B1201</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Harishige&amp;rsquo;s SG-4N Head Holding Adaptor</td><td>Tritech Research</td><td>SG-4N</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Ideal Micro-Drill Complete Kit</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-6065</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Round cover glass, 3 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0720</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Round cover glass, 5 mm</td><td>Harvard Biosciences</td><td>W4 64-0700</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Norland optical adhesive</td><td>Norland Products</td><td>7106</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Loctite liquid super glue</td><td>WB Mason</td><td>LOC1647358</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Grip cement kit, powder and solvent</td><td>Dentsply</td><td>675570</td><td>可选用任意品牌。将5份白色牙科水泥粉（Grip Cement）与1份黑色水粉颜料（用于避光；部分使用者偏好10:1的比例）混合。</td></tr><tr><td>Gel foam</td><td>Moore Medical</td><td>2928</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>Micro dissecting scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td>可选用任意品牌。</td></tr><tr><td>人工脑脊液（ASF）</td><td>-</td><td>-</td><td>ACSF包含125 mM NaCl、4.5 mM KCl、26 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;、1.25 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;、2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;和20 mM葡萄糖。用氧气（95%氧气，5%二氧化碳）饱和ACSF，并将pH值调节至7.4。每次实验前需新鲜配制ACSF溶液。</td></tr></tbody></table>

使用 thy1-gcamp6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

哺乳动物的大脑在矢状面上表现出明显的对称性。然而，关于成年哺乳动物大脑对称区域中神经动态的详细描述仍然尚不明确。在本研究中，我们描述了一种实验方法，利用双光子（2P）显微镜，通过在Thy1-GCaMP6s转基因小鼠双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方设置的双光学窗口，测量钙动力学。该方法能够在同一实验中长时间地对小鼠大脑双侧区域依次进行神经活动的记录与定量分析，且整个操作过程可在体内（in vivo）完成。该方法的关键步骤包括创建双光学窗口的微创手术操作以及双光子成像技术的应用，整个流程可在一小时内完成。尽管本研究仅在S1区域演示了该技术，但该方法可推广应用于活体大脑的其他区域，有助于阐明脑神经网络的结构与功能复杂性。

利用双侧光学窗口，我们获得了两次独立实验的结果。第一次实验采用表达EGFP的小鼠来成像树突上的串珠状膨大结构。图4C1-3展示了在光学窗口植入后不同时间点所采集图像的示例。请注意，在两次观察之间，树突分支及树突棘的数量和位置均表现出显著的稳定性（图4D、E，z轴投影）。
第二个实验采用了 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠用于测量细胞内钙瞬变，从而展示如何在单个神经元内测定钙生理学特性 体内 (图6）。该技术可用于记录并定量分析位于深层（深达第V层）的锥体神经元群体的自发性活动 &gt;500 µm 软脑膜下方。可通过多次试验计算随时间变化的平均自发反应（即计算每个时间点的平均反应）。与多电极记录相比，双光子技术的优势在于可在较长时间内同时检测大范围或分散的神经元群体的活动，且对脑组织的机械干扰极小。
为获得可接受的平均测量值，建议进行5–10次试验。试验次数取决于对特定刺激的自发反应或反应本身固有的变异性。若严格按照上述步骤操作，且研究者同时接受过减薄颅骨颅窗技术以及 体内 双光子钙成像应能够每天从1至2只动物的双侧记录100–200个神经元。
峰分析完成后，可获得一系列结果，包括每个峰的实际位置、实际峰高、峰面积以及半高全宽（FWHM）。
<img alt="显微镜用颅窗示意图，显示各层结构：皮肤、颅骨、硬脑膜，以及透镜和神经元。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1： 用于双光子（2P）成像的颅骨光学窗口组件示意图。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="开颅窗手术过程示意图；步骤包括皮肤、硬脑膜处理及颅骨窗放置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 示意图展示制备颅骨窗的关键步骤。（A）在解剖显微镜下，使用手术剪去除手术区域上方的皮肤。（B）使用高速微型钻头在S1区颅骨上钻出一个环形凹槽（直径3 mm），直至凹槽内的骨瓣与周围骨质分离。（C）缓慢移除骨瓣以暴露其下方的硬脑膜。（D）使用两种不同直径的盖玻片组装光学窗。上层盖玻片直径较大（5 mm），下层盖玻片（通常为1–3片）直径较小（3 mm）。所安装盖玻片的厚度应根据颅骨厚度进行选择。（E）将盖玻片置于颅骨的圆形开口上以形成光学窗。盖玻片的下部应嵌入颅骨开口内，其底部应轻柔接触硬脑膜。（F）使用氰基丙烯酸酯胶水将窗缘密封固定于颅骨上。（G）待氰基丙烯酸酯胶水干燥后，在胶水壁侧方涂抹黑色牙科水泥。（H）用ddH2O填充颅骨窗，并使用水浸物镜进行成像。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠脑成像、脑膜显微观察、实验装置、血管结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 颅骨双侧窗口的制备。（A）照片显示在颅骨两侧S1区域上方各有一个颅骨光学窗口。（B）图像（A）中框选区域的高倍放大图，显示双侧光学窗口暴露了下方的硬脑膜和血管。比例尺 = 680 µm。（C）暴露的颅骨。（D）在颅骨上制作一个环形凹槽，其中可见中央骨瓣。比例尺 = 900 µm。（E）去除骨瓣后，颅骨开孔处填充人工脑脊液（ACSF）。比例尺 = 720 µm。（F）在颅骨开孔上安装光学窗口，并用超级胶水密封窗口边缘。通过光学窗口可清晰观察到硬脑膜和血管。比例尺 = 600 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示神经结构的显微镜图像；实验；荧光标记；图像分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 4"> 
图4： 钙离子与树突成像。（A1）在Thy1-GCaMP6s小鼠中，利用血管（BV）作为解剖标志物确定感兴趣区域。（A2）使用相同的标志物并结合记录，随时间识别相同的标记细胞（红色箭头）。（B）初级躯体感觉皮层（S1）神经元中钙信号的代表性Z轴投影图像（红色箭头）。比例尺 = 10 µm。（C1-3）在光学窗口植入后第1天，于S1区第II层不同深度处观察B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)HJrs/J小鼠的树突（绿色）和一条血管（红色）。（D）光学窗口植入后第1天，同一区域多张图像的Z轴投影。（E）光学窗口植入后第7天，同一区域多张图像的Z轴投影。注意，在光学窗口植入后第1天至第7天期间，成年树突棘和树突分支的数量与位置表现出显著的稳定性。比例尺 = C-E 5 µm（C-E）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a><img alt="时间轨迹平均图、神经元数据图表、峰分析、荧光强度测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 5"> 
图5： 钙信号追踪。（A、B）使用ImageJ导入的时间序列电影示例，用于分析两个神经元（分别为神经元1和神经元2）的数据。（C）电子表格显示了来自感兴趣区域（ROI）的照明强度数据（位于神经元内部以及两个独立的邻近区域作为背景测量值）。（D）峰值计算公式：ΔF/F = (F-FB)/FB，其中FB = (FB1+FB2)/2（平均荧光背景[FB]，以及胞体荧光变化[F]以ΔF/F表示）。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="延时显微镜、细胞迁移、荧光分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56297/56297fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 代表性钙成像图像。（A-D）在植入光学窗口后第7天的小鼠中，不同时间点（单位：秒）的钙瞬变信号（绿色）与血管（红色）。黄色箭头：相对活性较低的神经元；白色箭头：放电神经元。（E、F）红色通道（血管）和绿色通道（钙信号）在3分钟记录期间的Z轴投影图像（E），以及仅绿色通道的投影图像（F）。（G）选定的神经元及其邻近背景区域的标记。比例尺 = 10 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56297/56297fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了一种通过双侧初级躯体感觉皮层（S1）上方的双光窗记录神经元活动的实验方法 Thy1- 使用双光子（2P）显微镜的GCaMP6s转基因小鼠 体内.

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

哺乳动物的大脑在矢状面上表现出显著的对称性。然而，关于对称脑区中神经动态活动的详细描述仍存在不足……

该方法能够长期在活体小鼠双侧皮层区域记录并量化神经活动。双光子技术的优势在于可长时间同步检测大范围或分散的神经元群体的活动。该技术的应用拓展至对活体脑内不同区域特定神经元群体活动模式的研究。在开始操作前12小时，将光学窗在70%乙醇中于50摄氏度下预热。光学窗由一个直径为5毫米的圆形顶部盖玻片和一个包含直径为3毫米圆形底部盖玻片的部分组成。完成预热孵育后，确认一只麻醉的、体重20至25克、年龄1个半至2个半的月大的Thy1 GCaMP6s小鼠对脚趾夹捏无反应，并为其眼睛涂抹眼膏。将小鼠置于覆盖无菌手术巾的加热垫上，并使用小鼠头部固定装置以稳定头部。用双刃剃刀剃除大部分头皮毛发，随后依次使用无菌酒精棉片和聚维酮碘溶液擦拭清洁暴露的皮肤。然后使用剪刀在颅骨右侧的头皮上做一个2毫米×3毫米的矩形切口。使用棉签将皮肤推开，形成一个直径大于三毫米的暴露区域，并用钝头显微外科刀片轻轻去除附着在颅骨上的结缔组织。使用牙科钻在 S1 区域周围轻轻标记一个直径为三毫米的圆圈。在颅骨左侧完成类似圆圈标记后，在骨面两侧均涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯超级胶水，以为后续涂抹牙科水泥提供基底。在解剖显微镜下，使用高速微型钻头在颅骨右侧S1区域周围磨出一个环形沟槽，使边缘平滑，必要时用真空装置吸除骨屑。当钻至约三分之二骨厚度时，缓慢而仔细地继续减薄剩余三分之一的骨质，直至形成一个完全游离的环形骨瓣。使用5/45镊子缓慢而小心地移除该环形骨片，暴露硬脑膜，注意避免损伤软脑膜血管。以相同方式去除颅骨左侧的骨瓣后，用无菌生理盐水冲洗右侧颅骨的光学窗口，并在体视显微镜下检查是否存在缺陷。将光学窗口安装至颅骨开窗区域，使窗口上部置于颅骨表面，下部位于颅骨开窗孔内， resting on the dura，在脑脊液存在的情况下完成安装。使用氰基丙烯酸酯超级胶水将光学窗口边缘的上部与颅骨密封固定。胶水干燥后，将黑色牙科水泥涂抹在玻璃边缘、暴露颅骨右侧的其余部分以及伤口边缘，以阻隔光线。然后安装左侧光学窗口，并在密切监测下让动物恢复，直至完全恢复卧姿。手术后 7 至 10 天，将麻醉后的动物置于加热垫上的双光子显微镜头部固定适配器中，注意确保光学窗口和颅骨右侧与显微镜的光轴垂直。使用四倍放大倍率的明场照明获取颅窗的初始参考图谱图像。在获取同一感兴趣区域的多张图像后，对左侧半球S1区域内的钙动力学进行成像，并计算颅骨两侧各感兴趣区域荧光强度的变化。在这些代表性图像中，于光学窗口植入后一天，在S1区域第二层的不同深度处观察到表达EGFP的小鼠的树突和一条血管。 在植入光学窗口后的第1天和第7天获取了Z轴投影图像，显示在实验期间树突分支和树突棘的数量与位置均保持显著稳定。通过测量Thy1 GCaMP6s转基因小鼠的细胞内钙瞬变，可对皮层第五层深度超过500微米以下的锥体神经元的自发钙活动进行定量分析，并计算随时间变化的平均自发反应次数。经过颅窗制备和活体双光子钙成像技术培训的研究人员，每天可在一至两只动物的颅骨两侧各记录到100至200个神经元。通过在颅骨两侧建立开放的光学窗口，该方法可实现对称哺乳动物脑区神经活动的记录，从而在活体中进行长时间且稳定的钙成像。该方法还可用于研究外周或中枢神经系统单侧损伤后的皮层活动与可塑性。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在 Thy1 GCaMP6s 转基因小鼠中安装双侧颅窗，以利用双光子显微镜测量钙动力学。

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胸腺1-gmcmp6 转基因小鼠在原代体血源皮质中的成像神经活性

本视频展示了通过转基因小鼠颅骨上的光学窗口记录大脑神经活动的过程。这些小鼠表达一种荧光蛋白，可用于检测神经活动。通过小心移除一小部分颅骨以安装光学窗口，随后用黑色水泥覆盖颅骨，以在成像前阻断光线。...

在转基因小鼠脑内植入光学窗口以成像神经活动

我们描述了一种利用光遗传学方法在体外光刺激神经元群体，以表征前脑环路功能拓扑结构和突触特性的方法 in...

光遗传靶向前脑环路的激光扫描光刺激

本方案详细介绍了如何实施和进行多光纤光度记录，如何校正钙离子非依赖性伪影，以及双色光度成像的重要注意事项。...

用于记录自由活动动物神经活动的多光纤光度法

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

本方案描述了背根神经节（DRG）的手术暴露过程，随后在对同侧后爪施加多种刺激的同时，利用Pirt-GCaMP3小鼠对神经元集合进行GCaMP3（基因编码的Ca2+指示剂；绿色荧光蛋白-钙调蛋白-M13蛋白3）Ca2+成像。...

体内完整背根神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

本方案详细描述了在清醒小鼠上丘（SC）中成像钙反应的实验流程，包括在野生型小鼠中利用双光子显微镜对单个神经元活动进行成像，同时保持皮层完整；以及在部分皮层缺失的突变型小鼠中利用宽场显微镜对整个上丘进行成像。...

小鼠上丘钙成像

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活体单神经元分辨率下新生小鼠感觉皮层自发活动的可视化

本方案概述了 体内 利用钙成像技术测量腰段6背根神经节（L6...

体内背根神经节神经元对躯体和内脏刺激反应的钙成像

本研究介绍了一种在麻醉小鼠中暴露胸段背根神经节（T-DRG）的外科操作方法 体内...

活体胸段背根神经节（DRG）钙成像与心电图记录用于外周神经刺激研究

本方案描述了 体内 完整三叉神经节（TG）神经元的GCaMP钙成像。该描述包括TG暴露手术， 体内 共聚焦显微镜成像三叉神经节神经元、在三叉神经节神经元显微成像期间施加体感刺激，以及分析 体内 GCaMP...

体内完整三叉神经节初级感觉神经元网络中神经元集群的钙成像

了解双光子显微镜技术在Thy1-GCaMP6s转基因小鼠中进行钙成像的方法，用于记录双侧初级体感皮层的神经活动。该技术可实现长期稳定的神经元群体活动监测，为研究大脑功能和可塑性提供重要工具。

使用 Thy1-GCaMP6s 转基因小鼠对初级躯体感觉皮层中的神经活动进行成像

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