胸腺1-gmcmp6 转基因小鼠在原代体血源皮质中的成像神经活性
2019年1月7日
我们描述了一种实验程序, 测量双光窗口以上的双光窗口双侧原生体感骨 (s1) 在 thy1-gcmp6 转基因小鼠使用2光子 (2p) 显微镜在体内 .
此方法允许在体内长时间记录和定量小鼠双边皮质区域的神经活动。两种光子技术具有在较长时期内同时检测大或分散神经元群体活动的优点。该技术的影响扩展到对活脑不同区域定义神经元群体的活动模式的调查。
手术开始前12小时，用70%乙醇将光学窗口加热50摄氏度。光学窗口由直径五毫米的圆形顶盖玻璃和包含圆形三毫米直径盖玻璃的底层玻璃组成。在加热孵育结束时，确认对麻醉的 20 至 25 克 1 1 1/2 至 2 1/2 个月大的 Thy1 GCaMP6s 小鼠的手指趾捏紧缺乏反应，并在动物的眼睛上涂抹软膏。
将鼠标放在覆盖着无菌窗帘的加热垫上，并使用头部保持适配器为小鼠稳定头部。用双刃剃须刀剃掉大部分头皮，用连续的无菌酒精制备垫和波维酮碘溶液磨砂清洁裸露的皮肤。然后用一把剪刀在头骨右侧的头皮上剪成长方形的两三毫米。
使用棉签，将皮肤推到一边，形成直径大于三毫米的暴露区域，并使用钝显微手术刀片轻轻去除附着在头骨上的结缔组织。使用牙科钻，轻轻标记 S1 区域周围直径三毫米的圆。在头骨左侧形成类似的圆圈后，在骨骼两侧涂抹一层薄薄的氰丙烯酸酯超级胶水，为牙科水泥应用提供基础。
在解剖显微镜下，使用高速微钻将S1区域周围头骨右侧的圆形凹槽薄下来，形成平滑的边缘，必要时用真空吸进骨骼碎片。在达到大约 2/3 的骨深后，缓慢而小心地将剩余的 1/3 骨薄，直到圆形骨瓣从周围的头骨中完全释放出来。使用一对 5/45 钳子缓慢而小心地取出圆形骨片以暴露杜拉，注意避免损坏皮亚尔血管。
以相同方式从头骨左侧取出骨瓣后，用无菌盐水冲洗头骨右侧的光学窗口，并在立体显微镜下检查是否不完美。将光学窗口安装在颅骨切除区域上，窗口的顶部位于颅骨上，颅骨切除开口内的底部在脑脊髓液存在的情况下，在杜拉上休息。使用氰丙烯酸酯超级胶水将光学窗口边缘的顶部密封到头骨。
当胶水干燥后，将黑色牙水泥涂抹在玻璃的边缘，将外露头骨右侧的其余部分，以及伤口边缘阻挡光线。然后安装左侧光学窗口，并允许动物通过监控恢复，直到完全恢复。手术后7至10天，将麻醉动物放入双光子显微镜下加热垫上的头握适配器，注意光学窗口和头骨右侧垂直于显微镜的光学轴。
使用四倍放大倍的亮场照明获取颅窗的初始参考贴图图像。获取同一感兴趣区域的多个图像后，对左半球 S1 区域内的钙动力学进行成像，并计算头骨两侧每个感兴趣区域的荧光变化。在这些具有代表性的图像中，在安装光学窗口一天后，在S1区域第二层的不同深度上，对EGFP表达小鼠内的树突和血管进行了可视化。
Z投影图像是在光学窗口植入后的第一天和第七天拍摄的，表明在实验期间树突状和脊椎的数量和位置非常稳定。测量Thy1 GCaMP6s转基因小鼠的细胞内钙瞬态，可以量化自发钙活性和五层金字塔神经元的种群，其深度大于皮娅以下500微米，并计算一段时间内自发反应的平均数量。接受过颅窗制备和体内双光子钙成像技术训练的研究人员应该能够在每天一到两只动物中获得头骨两侧100到200个神经元的录音。
该方法在头骨的每一侧都有一个开放的光学窗口，能够记录对称哺乳动物大脑区域的神经活动，从而在体内进行长期稳定的钙成像。该方法还可用于研究外周或中枢神经系统发生单伤后皮质活性和可塑性。看完这段视频后，您应该对如何在 Thy1 GCaMP6s 转基因小鼠中安装双基颅窗以测量钙动力学有了很好的了解。
概述
本文描述了一种使用双光学窗口和双光子显微镜测量Thy1-GCaMP6s转基因小鼠神经元活动的方法。该技术允许对双侧主要体觉皮层进行长期的体内神经活动记录。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经影像
- 钙成像
背景
- 双光子显微镜能够同时检测大量神经元群体的活动。
- 该方法适用于研究特定神经元群体的活动模式。
- Thy1-GCaMP6s小鼠用于可视化神经元中的钙动力学。
- 记录技术可以用于评估损伤后的皮质活动。
研究目的
- 提供安装颅窗以进行体内成像的详细协议。
- 使得能够量化皮质神经元中的自发钙活动。
- 促进对活体脑组织中神经元动力学的研究。
使用的方法
- 光学窗口的准备和开颅手术程序。
- 在主要体觉皮层上安装光学窗口。
- 用于成像钙动力学的双光子显微镜。
- 分析荧光变化以量化神经元活动。
主要结果
- 随时间稳定地成像树突分支和树突刺。
- 每天能够记录100到200个神经元。
- 量化五层锥体神经元中的细胞内钙瞬变。
- 该方法适用于研究损伤后的皮质可塑性。
结论
- 双光学窗口方法允许有效的体内钙成像。
- 该技术增强了对皮质中神经元活动的理解。
- 它为研究脑功能和可塑性提供了宝贵的工具。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables prolonged, stable in vivo imaging of neural activity across symmetric brain regions, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By quantifying calcium dynamics in defined neuronal populations, it provides mechanistic de-risking for CNS-targeted therapeutics. The bilateral imaging capability enhances predictive confidence in pathway modulation studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring spontaneous calcium activity in layer five pyramidal neurons.
- Operational Value: Supports functional target validation through stable imaging of dendritic structures over 7 days.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by quantifying intracellular calcium transients in deep cortical neurons (>500 µm).
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation via dual optical window implantation.
- Quantitative Output: Enables fluorescence change calculations from regions of interest for activity quantification.
- Scalability: Allows recording of 100–200 neurons per side per day in 1–2 animals.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to studying cortical activity and plasticity after unilateral peripheral or central nervous system injury.
- Translational Continuity: Connects discovery imaging to preclinical validation of neuronal dynamics in living brain tissue.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by stabilizing imaging of dendritic branches and spines over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through hypothesis testing and pathway clarification in symmetric cortical regions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling quantification of neural activity in bilateral S1 regions.
- Screening: Delivers assay readiness via stable calcium imaging windows for prolonged in vivo recordings.
- Analytics: Provides quantitative fluorescence measurements to compare conditions across hemispheres.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling post-injury cortical plasticity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for longitudinal neural activity monitoring across studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through quantification of spontaneous calcium activity.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via stabilized dendritic imaging over experimental periods.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling mechanistic de-risking of CNS targets.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization via longitudinal neural activity tracking in disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cranial window preparation and in vivo two-photon calcium imaging.
- Needs instrumentation for two-photon microscopy and surgical tools for bilateral craniotomy.
- Demands cross-team standardization for optical window installation and fluorescence analysis.
- Involves adaptation considerations when applying to other brain regions beyond S1.
- Limited by the need for postoperative recovery period (7–10 days) before imaging.
