利用多电极阵列评估内分泌干扰物对脊椎动物神经网络功能发育的影响

本实验方案的总体目标是检测内分泌干扰物（如双酚类化合物）对建立在多电极阵列上的脊椎动物神经元网络簇状放电活动的影响。该方法有助于回答发育神经生物学和环境毒理学领域的一些关键问题，例如环境毒素对胚胎大脑神经网络活动发育作用机制的问题。该技术的主要优势在于，现在可以研究这些化合物对神经元网络参数的影响，包括平均放电率、总放电次数、放电幅度以及同步性等。

我们之前的研究表明，环境内分泌干扰物（EDCs）会影响词语和行为，而词语和行为是神经网络的直接输出。本方案旨在探究EDCs对这些神经网络的影响。在神经元铺板当天，从零下20摄氏度冰箱中取出一管细胞外基质，用70%乙醇喷洒后置于冰上。务必在冰上解冻细胞外基质。

切勿在室温下解冻，因为细胞外基质（ECM）在零摄氏度以上会聚合。在生物安全二级（BSL2）通风橱内操作，通过向100微升的分装样品中加入300微升冷的Neurobasal培养基，将细胞外基质稀释至25%。然后，使用P200移液器吸取100微升25%的细胞外基质溶液，滴加至多电极阵列的中央，注意避免触碰电极。

立即去除细胞外基质，仅在表面留下一层薄膜。盖上多电极阵列，置于组织培养孵育箱中，直至准备接种神经元。开始鸡神经元分离：用70%乙醇对E7期鸡蛋的外壳进行表面消毒。

从现在开始，保持无菌条件至关重要。确保所有器械均使用70%乙醇灭菌，所有溶液均为无菌状态。使用解剖罩会有所帮助，但如果操作迅速，解剖罩并非绝对必要。

取出胚胎并去头后，围绕眼睛周围进行切割，取出眼球。接着使用5号Dumont精细镊子和弹簧剪，在腹侧做切口，去除外层皮肤以暴露前脑和视顶盖。小心剥离并移除脑膜。

将前脑转移至另一含有HBSS的培养皿中，用弹簧剪将其剪成约两毫米大小的小块。使用无菌移液管将前脑组织块转移至15毫升离心管中。待前脑组织块沉降至离心管底部后，尽可能吸除HBSS。

接着，加入1 mL预热的0.5%胰蛋白酶EDTA，于37°C孵育15分钟。使用巴斯德吸管小心吸除胰蛋白酶，避免扰动组织块。加入1 mL神经基础培养基，使组织块沉降至底部。

吸除培养基并重复洗涤后，加入 2 毫升神经基础培养基，轻轻吹打至肉眼不可见组织碎片。用神经基础培养基将重悬的细胞按 1:10 比例稀释。使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。

计数后，将解离的细胞以每平方毫米2,200个细胞的密度接种于细胞外基质包被的多电极阵列上。次日，向处理组的多电极阵列中加入含10微摩尔双酚A的神经基础培养基。在数据采集当天，更换为新鲜的神经基础培养基，并将阵列放回CO2培养箱中孵育至少两小时，然后开始记录。

启动记录软件，通过点击温度图标将多电极阵列的温度设置为 37 摄氏度。在左侧窗口面板中选择信号流，然后右键点击 muse 图标以设置采集参数。接着，选择添加处理和脉冲检测器，并在弹出窗口中点击“确定”。

STD 六通道峰电位检测器将显示在文件名下方。接下来，右键单击峰电位检测器，选择添加处理和簇状放电检测器，然后在弹出窗口中点击“确定”。簇状放电检测器 ISI 将显示在 muse 图标下方。

然后，右键单击爆发检测器，选择添加处理和神经统计编译器。在弹出窗口中，确保选中文件头、汇总的孔统计信息和同步性，然后单击“确定”。统计编译器将显示在下方。单击屏幕底部的时钟图标，并在设置部分中修改信息，以每 5.1 分钟记录一次，每次记录持续 5 分钟。

立即开始并执行一次。从培养箱中取出多电极阵列后，将其放置在记录单元上并固定到位。在计划记录部分，单击“开始记录”以开始记录网络活动。

通常，五分钟的记录时间已足够，但也可获得长达10分钟的记录。记录完成后，将多电极阵列放回培养箱中。与对照组培养物相比，经BPA处理的E7鸡前脑培养物中的平均脉冲数量显著降低。

BPA处理的E7鸡前脑培养物的平均同步性指数显著低于对照组培养物。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三小时内完成。在进行此操作时，必须始终牢记保持无菌条件，即使在记录峰电活动时也不例外。

通过该实验流程，可评估潜在药物（如抗癫痫药和抗抑郁药）对神经网络活动的影响，从而有助于理解其作用机制。许多内分泌干扰物（EDCs）在大脑发育过程中会产生细微影响，这些影响会表现为行为的改变。而行为正是神经网络活动的直接输出结果。

我们的实验方案旨在解析这些化合物对网络活性的影响。