Name: 靶向半胱氨酸硫用于体外重组蛋白的特异糖基化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学习利用半胱氨酸硫醇位点特异性糖基化重组蛋白的方法，通过定点突变和体外葡萄糖连接技术评估糖基化效率及结构效应。该技术为结构生物学和疾病治疗研究提供重要工具。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究理事会（P.B.S. 项目编号 05239）、加拿大创新基金会/安大略省研究基金（P.B.S.）、前列腺癌抗击基金会—Telus 父亲骑行活动（P.B.S.）以及安大略省研究生奖学金（Y.J.C. 和 N.S.）资助。

1. 通过聚合酶链式反应（PCR）介导的定点突变将半胱氨酸引入细菌pET-28a表达载体。
<ol>
	<li>使用紫外（UV）消光系数0.020测定pET-28a载体（即双链DNA）的浓度μg/mL厘米-1 在 260 nm 处。</li>
	<li>为每个Cys突变设计一对互补的突变引物，使得 i模板上第一个碱基错配之前至少有15个核苷酸与模板互补，最后一个碱基错配之后也至少有15个核苷酸与模板互补， ii总引物长度不超过45个核苷酸，且 iii) 每个引物的第一个和最后一个核苷酸位置均为鸟嘌呤或胞嘧啶（表1）。确保引物合成使用 0.025 μmol 规模放大与柱纯化。</li>
	<li>使用高保真DNA聚合酶，设置两个反应 20 µL PCR反应体系：一种含有正向引物，另一种含有反向引物。每种体系均需配制为终浓度包含1x PCR缓冲液（含1.5 mM MgCl₂）2，0.2 mM dNTPs， 0.5 μM 引物， 0.4 μL DMSO，1.25 ng/μL 模板DNA，0.02 U/μL 高保真DNA聚合酶</li>
	<li>使用三步法对分离的混合物进行热循环： 98 °C 30 秒（变性），53 - 56 °C 30 秒（退火）， 72 °C 30秒，千碱基（kb）-1 （模板DNA的）延伸。重复该温度程序5个循环，并添加一个最终步骤 72 °C 延伸步骤，7.5 分钟。</li>
	<li>在分别使用正向引物和反向引物进行初始PCR反应后，将产物合并至同一管中（即 40 μL 总计）并使用与步骤1.4中所述相同的循环参数继续PCR反应20个循环。</li>
	<li>电泳 15 μL 使用0.5×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸（EDTA）电泳缓冲液（TAE），将PCR反应混合物在1%（w/v）琼脂糖凝胶上进行电泳。作为对照，同时电泳未经PCR扩增的等量模板DNA，以及一段含有大于和小于预期PCR产物大小的标记条带的参考DNA ladder。</li>
	<li>电泳 40 分钟（120 V）后，将凝胶浸入含有水的溶液中 0.5 μg/mL 溴化乙锭，室温下振荡30分钟。通过比较突变引物扩增产物条带与对照模板条带在紫外光（302 nm）下的溴化乙锭荧光强度，确认全长模板已被突变引物成功扩增，表现为扩增条带的相对荧光强度增加。
	<ol>
		<li>若无扩增产物出现，可调整退火温度后重新进行 PCR 0.5 °C 53 之间的增量 56 °C 温度范围</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在确认诱变引物对模板的扩增后，处理剩余的~25 μL 使用DpnI限制性内切酶处理PCR反应混合物，以消化甲基化的模板DNA。DpnI的使用量为 0.5 µL （10 单位）每 25 μL PCR反应混合物和终浓度为1×的DpnI反应缓冲液。在37°C下孵育2.5小时 37 °C.</li>
	<li>模板消化后，加入约 5 - 10 μL 消化混合物的 100 µL 热激感受态DH5α 大肠杆菌 将细胞置于1.75 mL 微型离心管中。将细胞-DNA混合物置于冰上孵育60 min。</li>
	<li>将微量离心管中的细胞-DNA 混合物进行热激处理 42 °C 在干式加热块上加热45秒。将混合物在冰上孵育3分钟后，加入 900 μL 向细胞中加入室温的Luria-Bertani液体培养基（LB），并将全部细胞悬液转移至一支无菌的14 mL圆底管中。</li>
	<li>将细胞悬液孵育于 37 °C 在190 rpm条件下持续振荡孵育90分钟。</li>
	<li>随后，将细胞悬液转移回1.75 mL微量离心管中，在室温下以10,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>离心后，移除 900 μL 上清液，并用移液管轻轻吹打重悬剩余的细菌细胞 100 μL LB培养基</li>
	<li>将所得的浓缩细胞悬液转移至含有抗生素的LB-琼脂平板上，该抗生素用于筛选表达载体（即 60 μg/mLKa纳霉素）。将悬液无菌均匀涂布于琼脂平板上，在约37 °C下培养约16小时 37 °C.</li>
	<li>次日，从平板上挑取单菌落接种于5 mL含有抗生素筛选压力的液体LB培养基中（例如 60 μg/mL 卡那霉素）。在液体培养基中过夜培养 37 °C 持续振荡 37 °C.</li>
	<li>从扩增的质粒中分离并纯化 E. coli 使用基于碱裂解法的市售试剂盒进行细胞处理 45.</li>
	<li>通过质粒的Sanger DNA测序确认目标突变的存在及其正确的阅读框 46.</li>
</ol>
2. 在 BL21 ΔE3 Escherichia coli 中表达均匀 15N 标记的蛋白质。
注意：不同的重组蛋白需要不同的表达条件。以下是人源 STIM1 EFSAM 蛋白表达的优化方案。
<ol>
	<li>将含有Cys突变的表达质粒（例如pET-28a-EFSAM）转化至BL21 ΔE3密码子优化型热激感受态细胞中，并涂布于含有抗生素筛选压力的LB-琼脂平板上（操作步骤参见1.9–1.14），但作如下修改：直接取约1,000 μL总细胞悬液中的150 μL涂布于LB-琼脂平板，无需通过离心在微量离心管中浓缩细胞。</li>
	<li>次日，无菌操作挑取单克隆菌落接种至含有20 mL LB培养基（补充适当抗生素，例如针对pET-28a-EFSAM使用60 μg/mL卡那霉素）的200 mL锥形瓶中。在37 °C、约190 rpm持续振荡条件下培养过夜（约16 h），制备液体预培养物。</li>
	<li>在步骤2.2的同一天，准备用于15N标记蛋白表达的M9培养基：将1 L M9缓冲盐溶液（即42 mM Na2HPO4、22 mM KH2PO4、8.6 mM NaCl，pH 7.4）加入4 L锥形瓶中进行高压灭菌。待冷却后，使用0.2 μm无菌注射器滤器将以下混合物过滤至1 L无菌M9盐溶液中，使其终浓度分别为：0.2% (w/v) D-葡萄糖、100 μM CaCl2、50 μM硫胺素、1 mM MgSO4、1 μg/mL生物素和1 mg/mL15N-NH4Cl。该混合物包含20% (w/v) D-葡萄糖、1 M CaCl2、1 M硫胺素、1 M MgSO4、1 mg/mL生物素和0.2 g/mL15N-NH4Cl。</li>
	<li>次日，将20 mL过夜培养的液体预培养物无菌转移至50 mL无菌离心管中，在2,400 ×g条件下离心15 min以收集菌体沉淀。</li>
	<li>弃去LB培养基后，将所得菌体沉淀重悬于10 mL M9基本培养基中，并将重悬液转移至含抗生素（例如60 μg/mL卡那霉素）的1 L M9基本培养基中。</li>
	<li>将含有细菌预培养物的1 L M9基本培养基在37 °C、约190 rpm持续振荡条件下培养，直至600 nm处的光密度（OD600）达到约0.6–0.8。</li>
	<li>当OD600达到指定范围时，加入200 μM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导蛋白表达。</li>
	<li>加入IPTG后，继续在室温、约190 rpm持续振荡条件下孵育细胞约16 h（即过夜），以进行蛋白表达。</li>
	<li>次日，于约10,000 ×g、4 °C条件下离心30 min收集细菌菌体。</li>
	<li>弃去上清LB培养基，将菌体沉淀转移至50 mL离心管中，并于-80 °C保存，待后续纯化使用。</li>
</ol>
3. 从重组蛋白中纯化 E. coli.
注意：不同的重组蛋白需要采用不同的纯化步骤。以下是针对由 pET-28a 载体表达的包涵体中纯化 6×His 标签 EFSAM 蛋白的实验方案。
<ol>
	<li>使用电动10 mL移液器，在6 M盐酸胍、20 mM Tris-HCl（pH 8）和5 mM β-巯基乙醇溶液中手动匀浆冷冻的细菌细胞沉淀。此步骤中，每5 mL湿菌体沉淀加入约40 mL盐酸胍溶液。</li>
	<li>在杂交炉中于室温下持续旋转孵育90分钟后，将混合物在约15,000 ×g离心 8 °C 40分钟，以分离不溶性细胞碎片（即 沉淀）与可溶性蛋白质混合物（即上清液）分离。</li>
	<li>添加 750 µL 体积分数为50%的Ni2+将-nitrilotriacetic acid琼脂糖珠悬液加入澄清裂解物中，于室温下在杂交炉中翻转孵育90分钟。</li>
	<li>随后，捕获与Ni结合的6×His标签蛋白2+ 通过重力流蛋白纯化柱收集琼脂糖珠。在进入步骤3.5之前，让裂解液完全流经柱子。</li>
	<li>用 10 mL 的 6 M 尿素、20 mM Tris-HCl（pH 8）和 5 mM β-巯基乙醇将收集的珠子洗涤三次。每次洗涤前，确保前一次的 10 mL 溶液完全流经层析柱后，再加入下一次的 10 mL 洗涤液。</li>
	<li>使用6 M尿素、20 mM Tris-HCl pH 8、300 mM咪唑和5 mM β-巯基乙醇，以2 mL为一份进行系列洗脱，每份之间孵育90秒。确保在每次后续洗脱步骤前，全部2 mL洗脱液均通过层析柱。</li>
	<li>在此阶段，采用 Laemmli 方法，通过考马斯亮蓝染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测洗脱组分中是否存在目标蛋白 47通过与标准分子量蛋白标记物条带（其分子量应小于和大于目标蛋白的预期分子量）进行比较，评估目标蛋白的大小、数量和纯度。</li>
	<li>将洗脱的蛋白质组分汇集至截留分子量为3,500 Da的透析膜中，置于1 L复性缓冲液（20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl₂）中孵育2，pH 8）于 4 °C 过夜，同时用磁力搅拌器搅拌缓冲液。</li>
	<li>在复性约 16 小时后，直接向透析袋中加入约 1 U 的凝血酶（每毫克蛋白），并在 4 °C 额外约 24 小时。</li>
	<li>通过考马斯亮蓝染色验证6×His标签的切割程度~15 μL 透析袋中在凝血酶孵育前后取出的蛋白等分试样，采用Laemmli方法在变性聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上进行电泳 47如果观察到迁移出现约 2 kDa 的偏移，对应于被切割的 6×His 标签的分子量，则继续进行步骤 3.11；如果考马斯亮蓝染色仍可检测到部分未消化的蛋白质，则直接向透析袋中每毫克蛋白质加入约 0.2 U 凝血酶，并在 4 °C 再继续培养约 24 小时。</li>
	<li>使用尺寸排阻或离子交换色谱进一步纯化蛋白质。对于EFSAM的阴离子交换色谱，将蛋白质溶液从透析袋中取出，使用截留分子量为10,000 Da的超滤离心浓缩管浓缩约10倍。随后，用不含NaCl的缓冲液（20 mM Tris，5 mM CaCl₂，pH 8.0）将溶液重新稀释约20倍。2，1 mM DTT，pH 8）</li>
	<li>用步骤3.11中所述不含NaCl的缓冲液平衡预装的阴离子交换柱，缓冲液体积为10个柱体积。将缓冲液装入无菌无气泡的鲁尔锁紧式注射器中，以逐滴方式推动溶液通过层析柱，避免施加过大的压力导致溶液以连续流速流出。使用强阴离子交换剂（例如带有季铵盐功能基团的交联琼脂糖）。</li>
	<li>将步骤3.11中用不含NaCl的缓冲液稀释的蛋白溶液按照步骤3.12所述方法上样至层析柱中。</li>
	<li>以 NaCl 缓冲液（20 mM Tris，1 M NaCl，5 mM CaCl₂）浓度递增的梯度 [即 0 - 60% (v/v)] 洗脱蛋白质2，1 mM DTT，pH 8）缓冲液，使用双泵快速蛋白液相色谱（FPLC）系统进行纯化。设置FPLC系统收集约1–1.5 mL的组分，并通过280 nm紫外吸光度及0.5 mL/min的流速监测蛋白洗脱曲线。</li>
	<li>通过Laemmli方法的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶鉴定目标蛋白的洗脱峰及组分，并评估蛋白纯度 47.</li>
	<li>显示池分馏结果的 &gt; 95%（即在考马斯亮蓝染色凝胶上仅显示单一条带的组分）转入透析袋，并按照步骤3.8所述方法通过透析置换至目标实验缓冲液中。</li>
</ol>
4. 通过透析法将葡萄糖-5-MTS化学连接至蛋白质。
<ol>
	<li>通过将 10 mg 该化合物溶解于溶剂中，配制 55 mM 的 N-(β-D-吡喃葡萄糖基)-N'-[2-甲硫基磺酰基乙基]脲（glucose-5-MTS）储备液 500 μl 体积分数为100%的DMSO。将未使用的溶于DMSO的葡萄糖-5-MTS储存于-20 °C.</li>
	<li>通过透析约 1.5 mL 的蛋白质样品以进行修饰前的准备60 μM 将蛋白加入1 L修饰缓冲液中，该缓冲液由20 mM MOPS、150 mM NaCl、5 mM CaCl组成2 以及 0.1 mM TCEP，pH 8.3。使用截留分子量小于待修饰蛋白质大小的透析膜（例如，对于约 17,500 Da 的 EFSAM，使用 3,500 Da 截留值）。</li>
	<li>24 h后 4 °C将样品从透析袋转移至微量离心管中，加入DMSO溶解的葡萄糖-5-MTS，使其终浓度为2 mM。</li>
	<li>在室温下避光孵育样品1小时。在1小时的孵育期间，每10分钟轻轻敲击管壁以混匀溶液。</li>
	<li>随后，通过透析将蛋白质重新置换至不含还原剂的最终实验缓冲液中 4 °C 如步骤4.2所述或通过离心超滤法进行。对于超滤操作，将约1.5 mL蛋白质样品浓缩至 &lt; 0.5 mL，随后在同一浓缩装置中用实验缓冲液稀释。重复此浓缩-稀释步骤两次，使总置换倍数至少达到30×30×30 = 27,000倍。对于EFSAM，使用20 mM Tris、150 mM NaCl、5 mM CaCl₂2，pH 7.5 作为实验缓冲液。</li>
	<li>通过透析或超滤置换将样品制备用于电喷雾电离质谱分析，具体方法如步骤4.2和4.5所述，分别置换至25 mM碳酸氢铵或25 mM乙酸铵缓冲液中。若采用透析法，需确保至少置换三次，以彻底去除残留的NaCl和CaCl₂2 盐类</li>
	<li>使用电喷雾电离质谱法测定目标蛋白的精确质量（即 ± 1 Da） 48,49预期每次通过甲硫基磺酸盐化合物将葡萄糖共价添加至半胱氨酸巯基时，蛋白质分子量增加 281.3 Da（即，葡萄糖-5-MTS 添加 360.4 Da，减去 CH 79.1 Da）3SO2 共价连接过程中的离去基团</li>
</ol>
5. 通过溶液核磁共振评估修饰效率与结构扰动。
<ol>
	<li>确保修饰蛋白的浓度为 &gt; 100 μM 在葡萄糖连接和最终缓冲液置换后。对于EFSAM，使用280 nm处的紫外消光系数1.54（mg mL⁻¹）⁻¹ cm⁻¹估算蛋白浓度。-1厘米-1.</li>
	<li>向蛋白质溶液中补充 60 μM 4,4-二甲基-4-硅代戊烷-1-磺酸（DSS）用于匀场和脉冲校准，以及10%（v/v）D2O 代表信号锁定。为获得高信噪比，请使用 600 μL 样品置于频率匹配的5 mm NMR管中，插入配备三共振HCN低温探头的最低600 MHz谱仪。</li>
	<li>收集标准 1H-15N HSQC 谱图，具体方法如前所述 50,51 在室温下 1H 和 15N 扫描宽度、瞬态和增量设置应适合特定样品。对于 EFSAM 谱，使用 20 °C, 256 1H瞬变，64 15N 维增量和 1H 和 15N 扫描宽度分别设置为 8,000 和 1,800 Hz。</li>
	<li>在获得糖基化蛋白谱图后，从1 M储备液中加入二硫苏糖醇（DTT）至核磁共振（NMR）样品中，使其终浓度为15 mM。DTT通过还原二硫键介导的连接，将葡萄糖基团从蛋白质上移除。</li>
	<li>获取第二个 1H-15在这些还原/未修饰条件下进行N HSQC，以提供参考谱图，用于评估葡萄糖连接所引起的修饰效率和结构扰动。</li>
	<li>使用 NMRPipe 处理核磁共振数据，具体步骤如前所述 52确保处理过程至少包括数据转换、相位校正、溶剂抑制、傅里叶变换以及谱图的初步可视化。</li>
	<li>使用 CARA 软件中的 NEASY 插件，通过测定修饰后及还原后谱图中的酰胺峰强度和化学位移值来评估修饰效率 53确保评估半胱氨酸酰胺在葡萄糖结合谱和还原谱中的峰强度。如果无法在两张谱图中可靠地定位半胱氨酸酰胺峰，则使用邻近残基的强度作为读数。</li>
	<li>将Cys修饰谱图中酰胺峰的强度除以Cys还原（即DTT处理）谱图中酰胺峰的强度，再乘以100，计算效率： 
	<img alt="效率计算公式 \(Efficiency = \frac{I_M}{I_R} \times 100\)；数学公式" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">，其中 IM 是半胱氨酸修饰光谱中酰胺峰的强度，以及 IR 是Cys还原谱中酰胺峰的强度。或者，可通过多个酰胺峰计算平均效率： 
	<img alt="平均效率公式：平均效率 = (1/n) Σ 从 i=1 到 n 的 Efficiency_i。" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2">，其中 效率i 是为每个残基单独确定的计算效率， i, 和 n 用于计算的残基总数。</li>
	<li>根据两组观测谱图之间的化学位移差异，计算化学位移扰动（CSP） 15氮和 1每个峰的H维度并针对较大的峰进行归一化 15N 化学位移范围使用以下公式计算： 
	<img alt="CSP 公式：ΔH² 与 (0.14×ΔN)² 之和的平方根。热力学中的数学概念。" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3">，其中 ΔH 是质子维度的ppm变化以及 ΔN 是氮维的 ppm 变化。</li>
</ol>

蛋白质糖基化是一种翻译后修饰，其中糖类通过与氨基酸侧链连接，共价附着于多肽上。据估计，高达50%的哺乳动物蛋白质经过糖基化修饰54，这些糖基化蛋白质可产生多种生物学效应，包括改变生物分子的结合亲和力、影响蛋白质折叠、调节通道活性、靶向分子降解以及参与细胞内运输等（详见综述33）。糖基化在哺乳动物生理过程中的重要作用体现在已有数百种蛋白质进化出来，以构建哺乳动物糖链结构的全部多样性33。异常的N-和O-糖基化模式已与多种疾病状态相关，包括前列腺癌（升高和降低）、乳腺癌（升高和降低）、肝癌（升高）、卵巢癌（升高）、胰腺癌（升高）和胃癌（升高）55。此外，Tau蛋白、亨廷顿蛋白（huntingtin）和α-突触核蛋白（α-synuclein）的糖基化被发现可调节这些蛋白在阿尔茨海默病、亨廷顿病和帕金森病中的毒性作用56，并且已鉴定出一组由于介导糖基化的酶存在遗传性缺陷所导...

钙库操纵性钙离子（Ca2+）内流（SOCE）是免疫细胞从细胞外空间将 Ca2+ 摄取至胞质溶胶的主要途径。在 T 淋巴细胞中，位于质膜（PM）上的 T 细胞受体结合抗原，从而激活蛋白酪氨酸激酶（综述见1,2,3）。磷酸化级联反应导致磷脂酶-γ（PLCγ）的活化，后者进一步介导膜磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸（PIP2）水解为二酰甘油和肌醇 1,4,5-三磷酸（IP3）。IP3 是一种可扩散的小分子信使，能够结合内质网（ER）上的 IP3 受体（IP3R），从而打开该受体通道，使 Ca2+ 顺浓度梯度从内质网腔流入胞质溶胶（综述见4）。在多种其他可兴奋和非可兴奋细胞类型中，G 蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体的信号传导同样会导致 IP3 的生成及 IP3R 的活化。
由于有限的 Ca2+ 内质网的储存能力，IP3介导的释放及胞质内 Ca 的相应增加2+ 是暂时性的；然而，内质网腔内 Ca 的这种耗竭2+ 显著影响基质相互作用分子-1（STIM1），一种主要存在于内质网膜上的I型跨膜（TM）蛋白 5,6,7STIM1 包含一个面向腔内的 Ca2+ 由一对EF手结构域和无菌α基序（EFSAM）组成的感应结构域。三个朝向胞质的卷曲螺旋结构域通过单一的跨膜结构域与EFSAM相分离（综述见 8). 当内质网腔内 Ca2+ 耗竭后，EFSAM 发生与去稳定化偶联的寡聚化 7,9 导致跨膜区和卷曲螺旋结构域的结构重排 10这些结构变化最终导致STIM1在内质网-质膜连接处被滞留 11,12,13,14 通过与质膜磷脂酰肌醇相互作用 15,16 和 Orai1 亚基 17,18Orai1蛋白是质膜亚基，可组装形成Ca2+ 通道 19,20,21,22. 内质网-质膜连接处的STIM1-Orai1相互作用促进Ca²⁺通道开放2+ 释放活化的 Ca2+ （CRAC）通道构象，该构象允许 Ca²⁺ 的移动2+ 进入细胞质，以对抗细胞外空间的高浓度。在免疫细胞中，持续的细胞质 Ca2+ 通过CRAC通道的升高诱导Ca2+-钙调蛋白/钙神经磷酸酶依赖性的活化T细胞核因子去磷酸化，随后该因子进入细胞核，启动促进T细胞活化的基因转录调控 1,3STIM1激活CRAC通道的过程 23,24 通过激动剂诱导的内质网腔内Ca2+ 耗竭及由此导致的持续性胞质 Ca2+ 升高 collectively 称为 SOCE 25STIM1和Orai1的遗传性突变可导致严重联合免疫缺陷综合征，这充分表明SOCE在T细胞中的关键作用。 3,19,26,27EFSAM在感知内质网腔内Ca²⁺后启动SOCE2+ 通过钙流失实现耗竭2+ 在经典EF手结构域的配位，最终导致去稳定化偶联的自缔合 7,28,29.
糖基化是指在内质网和高尔基体中通过多种生物合成步骤，将寡糖结构（也称为聚糖）共价连接并进行加工的过程（详见文献30,32,33的综述）。真核生物中存在两种主要类型的糖基化：N-连接和O-连接，其分类依据是参与连接的特定氨基酸及其连接原子。在N-连接糖基化中，聚糖连接到天冬酰胺（Asn）侧链的酰胺基上，且大多数情况下，该修饰的起始步骤发生在多肽链进入内质网腔时34。N-糖基化的第一步是由寡糖基转移酶将由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）组成的十四糖核心结构（即Glc3Man9GlcNAc2）从内质网膜脂质分子上转移至蛋白质35,36。随后，在内质网中由特定的糖苷酶和糖基转移酶催化进一步的反应，例如葡萄糖残基的切除或转移。某些离开内质网进入高尔基体的蛋白质可继续接受进一步加工37。O-连接糖基化是指将聚糖通常连接到丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基侧链羟基上的过程，这种修饰完全发生在高尔基复合体中33,34。多种O-聚糖结构可由N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、半乳糖和唾液酸等单糖依次添加形成33。
尽管尚未发现任何特定序列是多种类型所必需的前提条件 O-糖基化，一种常见的共识序列已与之相关联 N连接修饰：Asn-X-Ser/Thr/Cys，其中X可为除Pro以外的任何氨基酸 33. STIM1 EFSAM 包含两个此类保守序列 N-糖基化位点：Asn131-Trp132-Thr133 和 Asn171-Thr172-Thr173。事实上，先前的研究已表明 EFSAM 可被 N在哺乳动物细胞中位于 Asn131 和 Asn171 位点发生糖基化 38,39,40,41然而，以往关于其后果的研究 N-glycosylation 对 SOCE 的影响结果不一致，表明这种翻译后修饰对 SOCE 激活具有抑制、增强或无显著作用的效果 38,39,40,41因此，针对EFSAM的潜在生物物理、生物化学及结构效应的研究 N糖基化对于理解该修饰的调控作用至关重要。由于这些研究需要高水平的均一蛋白质 体外 实验采用位点选择性方法将葡萄糖基团共价连接至EFSAM。有趣的是，Asn131和Asn171的糖基化引起了结构变化，这些变化汇聚于EFSAM核心区域，并增强了促进STIM1介导的SOCE的生物物理特性 42.
通过一项开创性研究，已充分确立了将糖基化学连接至半胱氨酸巯基的方法，该研究首次证明了这种无需酶参与的方法在理解糖基化对蛋白质功能的位点特异性影响方面的实用性43,44。最近，针对STIM1蛋白，研究人员将Asn131和Asn171残基突变为半胱氨酸，并利用葡萄糖-5-(甲烷硫代磺酸酯)[glucose-5-(MTS)]共价连接葡萄糖至游离巯基42。本文中，我们描述了这一方法，该方法不仅通过定点突变引入可修饰的特异性半胱氨酸残基，还结合溶液核磁共振（NMR）波谱技术，快速评估糖基化修饰的效率及其引起的结构变化。值得注意的是，该通用方法可轻松适用于研究任何重组表达蛋白的O-或N-糖基化的效应。

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA 聚合酶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>用于步骤 1.3。</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>用于步骤 1.6。</td></tr><tr><td>DpnI 限制性内切酶</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>用于步骤 1.8。</td></tr><tr><td>Presto Mini 质粒提取试剂盒</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>用于步骤 1.16。</td></tr><tr><td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>用于步骤 2.1。</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>用于步骤 1.9。</td></tr><tr><td>0.22 mm 注射器滤器</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>用于步骤 2.3。</td></tr><tr><td>HisPur Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-NTA 琼脂糖树脂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>用于步骤 3.3。</td></tr><tr><td>3,500 Da 截留分子量透析管</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>用于步骤 3.8、3.16、4.2、4.5 和 4.6。</td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>用于步骤 3.9。</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap Q FF 阴离子交换柱</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>用于步骤 3.11。</td></tr><tr><td>葡萄糖-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>用于步骤 4.1。</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 超滤离心浓缩管</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>用于步骤 3.11、4.2、4.5 和 4.6。</td></tr><tr><td>PageRuler 未标记广谱蛋白Marker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>用于步骤 3.7、3.10 和 3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF 阴离子交换柱</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>用于步骤 3.12。</td></tr><tr><td>AKTA Pure 快速蛋白液相色谱系统</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>用于步骤 3.14。</td></tr><tr><td>600 MHz Varian Inova 核磁共振波谱仪</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>用于步骤 5.2 和 5.5。</td></tr></tbody></table>

靶向半胱氨酸巯基 体外 重组蛋白的位点特异性糖基化

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

基质相互作用分子-1（STIM1）是一种I型跨膜蛋白，位于内质网（ER）和质膜（PM）上。内质网定位的STIM1通过一种称为钙库操纵性钙（Ca2+) 进入，这是主要的 Ca2+ 驱动免疫反应的信号传导过程。STIM1 经历翻译后修饰 N在Ca的两个腔内Asn位点上的糖基化2+ 分子的感应结构域。然而，其生物化学、生物物理及结构生物学效应 N-glycosylated STIM1 的糖基化修饰在近期之前仍不甚清楚，原因是难以获得高水平的均一修饰产物 N-糖基化蛋白。在此，我们描述了一种实施方案 体外 一种将葡萄糖基团连接至特定蛋白质位点的化学方法，适用于理解其潜在效应 N糖基化对蛋白质结构与机制的影响。利用溶液核磁共振波谱技术，我们可在单个样品中同时评估该修饰反应的效率以及葡萄糖连接所引起的结构变化。该方法可便捷地推广用于研究自然界中大量存在的糖基化蛋白质。

该方法的第一步需要将候选糖基化位点的残基突变为可被葡萄糖-5-MTS修饰的Cys残基。EFSAM不含内源性Cys残基，因此在进行突变前无需特殊考虑。然而，在执行所述化学修饰之前，必须将内源性Cys残基突变为不可修饰的残基。为了尽可能减少对天然结构的影响，我们建议对目标蛋白进行全局序列比对，并确定在内源性Cys位点处最常出现的其他残基类型。将Cys突变为在其他生物中自然存在的这些残基，可能对蛋白结构的影响最小。如果内源性Cys残基高度保守，我们建议将其突变为Ser，因为Ser在结构上与Cys最为相似。 图1 显示典型的PCR定点突变琼脂糖凝胶电泳结果，用于评估PCR反应的成功与否，其中扩增后的DNA样本条带强度显著高于作为对照的未扩增模板pET-28a DNA。后续步骤包括模板DNA的消化处理以及转化入 E. coli 用于质粒修复。在液体培养基中扩增质粒后，提取质粒并通过测序确认突变位点，随后可将突变载体用于蛋白表达。 图2A 显示EF...

糖基化蛋白的生化与结构分析需要相对大量的均一性样品。本文介绍一种高效的化学方法，通过靶向反应性半胱氨酸巯基，实现从细菌中纯化的重组蛋白的位点特异性糖基化。

基质相互作用分子-1（STIM1）是一种I型跨膜蛋白，位于内质网（ER）和质膜（PM）上。驻留于内质网的……

本实验的总体目标是通过定点突变技术，在天然糖基化位点处将半胱氨酸残基引入蛋白质，并利用体外葡萄糖连接及评估方法，评价糖基化的效率及其对蛋白质结构的影响。该方法有助于解答结构生物学领域中的关键问题，例如：蛋白质糖基化会带来哪些结构上的后果？这些修饰如何影响蛋白质功能的内在机制？该技术的主要优势在于其易于调整，可用于研究或操作糖基化过程。该方法效率很高，可快速评估结构扰动和效率变化。该技术的应用意义延伸至疾病治疗领域，因为异常的糖基化模式已与多种癌症及神经退行性疾病相关。尽管该方法可揭示天然糖基化蛋白效应的机制，但也可能为如何调控糖基化模式以应对这一系列疾病提供亟需的信息。为了在表达载体中引入单个半胱氨酸突变，准备两个独立的PCR反应管。在第一个管中加入正向突变引物，在第二个管中加入反向突变引物。向两个管中均加入终浓度为1X的PCR缓冲液。然后，为两个独立的PCR反应管设置五个循环的程序。在第五个循环结束时，在72摄氏度下延伸七分半钟。完成五个循环后，将两个独立的PCR反应混合至同一管中，离心约三秒钟，随后按照相同的PCR条件再进行额外20个循环。接下来，在120伏电压下将15微升样品在1%的DNA琼脂糖凝胶中电泳40分钟。然后，将凝胶浸入含有0.5毫克/毫升溴化乙锭的水中，室温下摇动30分钟。随后，在302纳米波长的紫外光下确认模板的扩增情况。随后，向剩余的 25 微升 PCR 反应体系中加入 0.5 微升 DPN1 限制性内切酶。在 37 摄氏度下孵育 2.5 小时，以消化甲基化的模板 DNA。然后，将约 5 至 10 微升的消化产物加入 100 微升感受态 E.coli 细胞中，冰浴孵育 60 分钟。然后，将细胞与DNA的混合物置于干式加热块中，在42摄氏度下热激45秒。接着，立即将混合物置于冰上孵育3分钟。随后，向细胞中加入900微升LB液体培养基，并将菌液转移至无菌的14毫升圆底试管中。在37摄氏度、190 rpm恒定振荡条件下孵育90分钟。然后，将离心后的细胞沉淀涂布于添加抗生素的琼脂平板上。将平板在37摄氏度孵育16小时。次日，从平板上无菌接种单个菌落至5 mL含抗生素的LB培养基中。然后，在37°C条件下振荡培养过夜。通过热激法将半胱氨酸残基突变的质粒转化至大肠杆菌（E.coli）细胞中，随后在含抗生素的LB培养基中过夜培养。第二天，将150微升细胞悬液直接涂布于添加卡那霉素的LB琼脂平板上，于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，无菌条件下挑取单菌落接种于20毫升LB液体培养基中（装于锥形瓶内），于37摄氏度过夜培养。第三天，将过夜培养的菌液转移至50毫升锥形离心管中。然后，将过夜培养的液体培养物在2,400 × g条件下离心15分钟，收集细胞沉淀。接着，向细胞沉淀中加入10毫升M9最低培养基，并将细胞混合物悬浮于含有卡那霉素的一升M9培养基中。在37°C下持续振荡（约190 rpm）培养M9液体培养物，直至其在600纳米处的光密度达到约0.6至0.8。然后，向M9培养基中加入200 µM的IPTG以诱导蛋白表达，并将培养物过夜培养。次日，通过在4 °C、约10,000 × g条件下离心30分钟，收集过夜培养的菌体细胞沉淀。使用10 mL电动移液器，将冷冻的菌体细胞沉淀在约40 mL裂解缓冲液中进行匀浆处理。然后，将匀浆液置于杂交炉中，在持续旋转条件下孵育90分钟。在8°C条件下以约15,000 × g离心40分钟，以分离可溶性蛋白组分与不溶性沉淀。随后，向上清液中加入体积比为50%的镍-次氮基三乙酸琼脂糖珠悬液，并在室温下于杂交炉中倒置孵育90分钟。接下来，使用重力流蛋白纯化柱收集与镍结合的带有六聚组氨酸标签蛋白的琼脂糖珠。最后，将收集的琼脂糖珠洗涤三次。以一系列两毫升的洗脱液组分洗脱蛋白质。接下来，通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶电泳确认洗脱组分中纯化的六组氨酸标签蛋白。将洗脱的蛋白组分收集至截留分子量为3,500道尔顿的透析膜中，加入复性缓冲液，在4°C下磁力搅拌过夜。然后，向透析膜中的合并蛋白中每毫克蛋白加入约一个单位的凝血酶，并再次在4°C下孵育一天。第二天，从透析袋中取出蛋白质，使用截留分子量为10,000道尔顿的超滤离心浓缩器将其浓缩约十倍。随后，用不含氯化钠的复性缓冲液将浓缩后的蛋白质再稀释约20倍。为纯化蛋白质，将其上样至预先装填的阴离子交换柱，该柱已用相同的不含氯化钠的缓冲液平衡。使用含有1 M氯化钠的复性缓冲液，以0至60%的梯度开始洗脱蛋白质。将合并的蛋白组分转移至透析袋中。在4°C条件下过夜透析，以将蛋白质置换至含有最佳摩尔浓度氯化钠的实验用复性缓冲液中。首先，将约 1.5 毫升、浓度约为 60 微摩尔的蛋白质在 1 升糖基化修饰缓冲液中于 4 摄氏度透析 24 小时。之后，将修饰后的蛋白质转移至微量离心管中，并加入二甲基亚砜（DMSO）溶解的葡萄糖-5-MTS，使其终浓度为 2 毫摩尔。在室温避光孵育 1 小时期间，每隔 10 分钟轻轻敲击微量离心管。孵育后，在4 °C下进行透析，将蛋白质重新置换至最终的实验缓冲液中。采用电喷雾电离质谱法测定蛋白质的精确质量。最后，利用溶液核磁共振（NMR）计算糖基化修饰效率，并鉴定蛋白质中糖基化半胱氨酸残基的结构变化。本图展示了一个典型的突变PCR成功扩增的模板DNA，在1% DNA琼脂糖凝胶中的结果。凝胶中使用了DNA标记物以及等量未经PCR扩增的模板DNA作为对照。最上方一条具有强溴化乙锭染色信号的条带，显示了大小符合预期的扩增模板产物。接下来，使用阴离子交换柱对蛋白质进行纯化。色谱图中蓝色曲线显示了在280纳米处观察到的洗脱谱图，共出现三个峰，洗脱过程中使用红色曲线表示的氯化钠梯度浓度逐渐升高，直至0.6摩尔。底部图显示了各蛋白质组分经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶结果。通过电喷雾电离质谱法测定半胱氨酸残基的糖基化。色谱图显示了半胱氨酸残基糖基化前后未修饰和已修饰蛋白质的质量。为验证结果，进行了溶液核磁共振（NMR）分析，展示了残基特异性酰胺化学位移的HSQC谱图叠加，表明糖基化蛋白的两种修饰及其结构扰动。掌握该技术后，从诱变到核磁共振（NMR）分析的所有步骤可在约12天内完成，不包括引物合成、DNA测序和质谱检测所需等待时间。在实施该实验流程时，重要的是要记住，需在未进行巯基修饰的情况下，评估半胱氨酸突变对结构和生物物理性质的影响，作为基线对照。在完成本流程后，还可进一步采用其他方法，如稳定性分析、二级结构分析、离子结合分析、蛋白质-蛋白质相互作用评估等，以揭示糖基化如何影响蛋白质功能背后的生物物理特性。该技术建立后，为钙信号领域的研究人员提供了分别和联合评估天冬酰胺131位点、天冬酰胺171位点以及STIM1蛋白糖基化在钙库操纵性钙离子进入相关钙信号传导中作用的途径。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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我们将介绍一种在单细胞水平上结合荧光技术测量膜蛋白离子转运动力学及构象变化位点特异性分析的方法。该技术适用于离子通道、转运蛋白和离子泵，并可用于确定蛋白质亚基之间的距离限制。...

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合成用于制备位点选择性修饰免疫偶联物的巯基反应性试剂及其生物偶联方法

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树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

学习利用半胱氨酸硫醇位点特异性糖基化重组蛋白的方法，通过定点突变和体外葡萄糖连接技术评估糖基化效率及结构效应。该技术为结构生物学和疾病治疗研究提供重要工具。

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