检测线粒体膜电位以研究CLIC4敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外

该方法有助于回答细胞生物学领域中的关键问题，包括理解细胞凋亡和线粒体功能障碍。该技术的主要优势在于，研究人员能够通过罗丹明-123 对单个细胞内的线粒体膜电位进行简便且准确的实时监测。按照文本方案所述，培养头颈部鳞状细胞癌的 HN4 细胞系。

转染前一天，将50万个细胞接种于6孔板中，每孔加入2毫升不含抗生素的培养基。用250微升低血清培养基轻轻稀释100皮摩尔的CLIC4小干扰RNA或乱序小干扰RNA。然后，用250微升低血清培养基稀释5微升脂质体试剂，室温孵育5分钟。

将稀释的小干扰RNA与稀释的脂质体试剂混合，并轻轻混匀。将混合物加入含有培养基中细胞的每孔中。通过前后轻轻摇动培养板进行混匀。

在37摄氏度的CO2培养箱中孵育细胞。转染后4小时，更换为正常培养基。继续孵育细胞额外20小时，然后进行罗丹明-123标记实验。

在六孔板中的 HN4 细胞经 CLIC4 小干扰 RNA 处理后，使用镊子将圆形盖玻片放入新的 12 孔板底部。用移液器向 12 孔板内每张盖玻片中央加入 150 微升浓度为 100 微克/毫升的多聚赖氨酸。两分钟后，用移液器彻底吸除多聚赖氨酸。

接下来，移除培养皿中 HN4 细胞的培养基，并加入 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶以消化细胞。六分钟后，加入 2 毫升培养基以中和胰蛋白酶。用移液器轻轻吹打 HN4 细胞 5 次，混匀后将细胞接种于圆形盖玻片上。

将细胞置于37摄氏度、5% CO2的培养箱中。培养8小时后，加入2微摩尔/升的罗丹明-123，并轻轻上下吹打培养基数次，以确保其在培养基中均匀分布。将HN4细胞在37摄氏度下继续孵育40分钟。

使用镊子取下盖玻片，并将其短暂转移至预热的 NPSS 缓冲液中，以洗去残留液体。将盖玻片置于容积为 500 微升、底部带有可更换的 25 毫米圆形玻璃盖玻片（由 O 型密封圈固定密封）的不锈钢腔室底部。通过拧紧腔室盖子将盖玻片固定到位。

向组装好的腔室中加入 450 µL 预热的 NPSS 缓冲液。然后将浴槽置于荧光显微镜或共聚焦激光扫描荧光显微镜的视野下。按照制造商的说明打开荧光显微镜。

打开成像系统软件，从命令栏中选择“新建”按钮以开始新实验。调整视野和焦距，在白光下找到细胞的位置。然后关闭白光并点击按钮以关闭白光光源。

单击命令栏中的对焦按钮，选择开始对焦以开启荧光。通过显微镜使用507纳米激发光和529纳米长通发射波长再次找到细胞位置。如有需要，调整视野并重新对焦。

选择一个仅包含 20 至 30 个分散的 HN4 细胞的视野。当获得清晰的视野后，点击对焦栏中的“close focusing”（近焦）。然后点击命令栏中的“acquire one”（采集一张），以获取一组图像。

接下来，从命令栏中点击“区域”并点击“确定”按钮以编辑测量区域。为适应不同形状的单个细胞，选择“轨迹区域”工具。围绕单个细胞的区域进行圈选，完成后双击。

重复该步骤，直至所有细胞均被圈出。点击“完成”并选择“保存图像”以找到保存位置。点击“归零时钟”，然后快速按下 F4 键以开始监测荧光强度的变化。

每五秒记录一次荧光强度的实时变化，持续五分钟。当基线趋于稳定后，通过移液器向样品室中加入50 µL NPSS与0.5 µL 100 mmol/L ATP的混合液。按照制造商的说明开启共聚焦激光扫描荧光显微镜，并打开配套软件。

在采集菜单下点击物镜，选择63倍、数值孔径1.4的油镜。观察样本，在明场下找到清晰的视野。按下光源选择按钮，切换至荧光模式，并选择正确的荧光滤光片，通过显微镜在暗视野下定位细胞位置。

观察结束后，按下快门以保护样品。在“采集”菜单下，调节合适的PMT通道，然后点击“采集”以激活已设定的光路。单击“配置”菜单并选择激光器，以确定所需的激光类型。

点击实时按钮以获取实时图像，并确保视野中仅包含20至30个分离的HN4细胞。接下来，在“采集”菜单下的采集子菜单中，选择采集模式为XYT。将时间间隔设置为5秒，持续时间设置为20分钟。

当所有参数设置完成后，点击应用。在量化菜单下，使用绘制多段线工具圈出每个细胞的记录区域。选择线轮廓，并选择开始以进行观察。

记录荧光强度的实时变化，持续五分钟。当基线趋于稳定后，通过移液器向腔室中加入50微升NPSS混合液，其中包含0.5微升浓度为100毫摩尔每升的ATP。若需使用普通荧光显微镜进行统计分析，请打开成像系统软件，并在命令栏中选择“打开”按钮，以载入已保存的实验文件。

单击命令栏中的区域，然后单击“确定”按钮以编辑测量区域。选择轨迹区域工具，圈选一个单细胞的区域，完成后双击。

重复该步骤，直到所有细胞均被圈出。点击完成，然后选择 F4 前进按钮，以获得显示荧光强度的曲线。完成后，点击图表右下角的向下箭头按钮，然后点击显示图表数据。

单击“确定”两次，然后选择日志数据按钮，以打开数据处理软件的界面。再次单击日志数据，即可在电子表格中查看荧光强度实时波动的记录。此处展示的是通过常规荧光显微镜检测到的，在不同干预条件下HN4细胞中线粒体去极化随ATP诱导变化的代表性结果。

在两组中，线粒体膜电位去极化在ATP处理后迅速增加，并逐渐恢复至正常水平。罗丹明-123荧光强度的代表性轨迹显示，与对照组相比，CLIC4小干扰RNA处理增强了线粒体去极化。一个代表性直方图进一步揭示，与对照组相比，CLIC4基因敲低增强了线粒体去极化。

此处代表性共聚焦激光扫描显微镜结果还显示，在不同干预条件下，ATP诱导的HN4细胞线粒体去极化发生改变。ATP处理后，两组细胞的线粒体膜去极化均迅速增加，随后逐渐恢复至正常水平。罗丹明-123荧光强度的代表性轨迹表明，与对照组相比，CLIC4小干扰RNA处理增强了线粒体去极化程度。

类似地，代表性直方图进一步显示，与对照组相比，CLIC4 基因敲低增强了线粒体去极化。观看本视频后，您将更清楚地了解如何利用罗丹明-123 通过常规荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜对线粒体膜电位进行实时监测。一旦掌握该技术，若操作得当，每份样品使用罗丹明-123 进行显微镜检测可在 20 分钟内完成。

在进行该操作时，重要的是要注意在注射后等待扫描过程中，切勿触碰腔室。完成该操作后，可进一步采用其他方法，如蛋白质印迹（Western Blot）和流式细胞术，以回答更多问题，例如细胞是否发生了凋亡或坏死。该技术建立后，为生命科学领域的研究人员探索线粒体功能障碍以及在多种活细胞中寻找细胞凋亡的有力证据开辟了道路。

请注意，使用罗丹明-123可能存在极高危险性，在进行该实验操作时，必须采取佩戴手套和口罩等防护措施。