无基因克隆的基因破坏的变形链球菌菌株的生成

该程序的总体目标是使用两步融合 PCR 和电穿孔生成靶向基因破坏的变异链球菌菌株。这种方法可以帮助回答微生物学领域的关键问题，例如目标基因是如何工作的。该技术的主要优点是不需要 PCR 以外的酶促反应，并且用于电穿孔的感受态细胞制备非常简单。虽然这种方法可以提供对变形链球菌基因破坏技术的见解，但它也可以应用于其他微生物物种，如金黄色葡萄球菌。通常，刚接触这种方法的个体会很困难，因为他们不熟悉巢式引物对第二次 PCR 的有效性。演示该程序的是我们实验室的研究讲师 Ayako Okada 博士。要开始此过程，请将原液 S.mutans UA159 划线到脑心输液或 BHI 琼脂平板上，并在厌氧条件下在 37 摄氏度下孵育平板过夜。第二天，使用消毒过的牙签挑选一个菌落，并将其接种到 5 毫升 BHI 肉汤中。在厌氧条件下，在 37 摄氏度下孵育变形链球菌培养物过夜。接下来，将培养物以 2000 倍 G 离心 15 分钟。去除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 ml PBS 中。再次以 2000 倍 G 离心 15 分钟。将所得细胞沉淀重悬于 200 微升 PBS 中。使用基于磁珠打动的基因组 DNA 提取试剂盒从悬浮液中提取基因组 DNA。首先，将细胞悬液转移到含有玻璃珠的 2 mL 样品管中。然后向细胞悬液中加入 750 μL 裂解液。盖紧试管，并将它们对称地放在珠子打碎装置的试管架中。以最高速度处理 5 分钟。将打碎的样品以 10， 000 次 G 离心 1 分钟。将上清液转移至 2 ml 收集管中的离心柱中，并以 7000 次 G 离心 1 分钟。向滤液中加入 1200 μL DNA 结合缓冲液，并将 800 μL 混合物转移到 2 mL 收集管中的离心柱中。以 10， 000 倍 G 离心 1 分钟。丢弃流出物。向离心柱中加入 200 μL 预洗缓冲液以洗涤柱基质，并以 10， 000 倍 G 离心 1 分钟。弃去流出液，向离心柱中加入 500 μL 洗涤缓冲液以洗涤柱基质并再次离心。将每个离心柱放入新的 1.5 mL 微量离心管中，并向柱基质中加入 100 μL 洗脱缓冲液。以 10， 000 倍 G 离心 30 秒以洗脱基因组 DNA。通过使用分光光度计测量 260 纳米和 280 纳米处的吸光度来估计 DNA 浓度和纯度。使用突变链球菌野生型基因组和合成链霉素抗性基因作为 PCR 模板进行第一次 PCR。三组引物分别用于扩增糖基转移酶 C 或 gtfC 基因的上游侧翼区、gtfC 基因的下游侧翼区和壮观霉素抗性基因。在 1% 琼脂糖凝胶上分离每种 PCR 产物。第一次 PCR 中每个产物的大小应约为 1 KB。使用凝胶条带切割器切除相应的条带，并按照文本方案中的说明纯化每个扩增的 DNA 产物。下一步是使用三个大致相等的摩尔片段作为 PCR 模板进行第二次 PCR。这些片段使用适当的引物进行扩增和剪接，以产生干扰构建体。由于该程序的成功取决于通过第二次 PCR 扩增破碎构建体，因此通过电泳确认第二次 PCR 产物非常重要。将 1/10 的 PCR 反应混合物上样到 0.8% 琼脂糖凝胶上，以确认生成的扩增子具有预测的条带大小。在这个例子中，巢式引物的扩增效果要好得多。将剩余的 PCR 混合物转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，加入 55 μL 超纯水，将总体积调节至 100 μL。加入 1/10 体积的三摩尔乙酸钠 pH 5.2，然后加入 2.5 体积的 100% 乙醇并混合，在零下 80 摄氏度下冷冻 30 分钟。在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 G 离心 20 分钟。离心完成后，检查试管底部的沉淀。丢弃上清液。用 1 毫升 70% 乙醇洗涤沉淀，并在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 G 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物风干约 30 分钟。最后，用 10 微升超纯水溶解沉淀。事先制备了感受态变异链球菌 UA159 细胞，并以 50 微升等分试样储存在零下 80 摄氏度下，将每 50 微升等分试样的冰冷感受态细胞与 5 微升破坏构建体混合。将混合物添加到电极之间距离为 0.2 cm 的电穿孔比色皿中。使用电穿孔仪的金黄色葡萄球菌模式进行电穿孔。电穿孔后，立即将细胞悬浮在 500 微升 BHI 肉汤中，并将 50 微升悬浮液添加到含有壮观霉素的 BHI 琼脂平板中。将板在 37 下孵育 2 到 6 天