Name: 常压等离子体射流作为神经保护剂抗葡萄糖剥夺诱导 SH-SY5Y 细胞损伤的新应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 了解常压等离子体射流在SH-SY5Y细胞中的神经保护应用方法。该技术通过低剂量氦等离子体处理减轻葡萄糖剥夺诱导的损伤，为缺血性脑病治疗提供低成本新方案。

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本工作由北京神经外科研究所创新基金（2014-11）、国家自然科学基金（编号：11475019 和 81271286）以及北京市自然科学基金（编号：7152027）资助。

1. APPJ装置的制备
警告：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。进行所有操作时，请遵循适当的安全操作规范。&#160;实验，包括使用通风橱和个人防护装备（安全眼镜、防护手套、实验服） 等等。）。该方案需要标准的细胞操作技术（消毒、细胞复苏、细胞传代、细胞冻存、细胞染色， 等等。).
<ol>
	<li>选择内径为1 mm、外径为3 mm的石英管。使用抛光箔将两端的横截面打磨光滑。</li>
	<li>使用直径为1.0 mm的镍镀层不锈钢针作为高压电极。将其尖端研磨至曲率半径为0.05 mm。</li>
	<li>在距石英管喷嘴1 cm处，用宽2 mm的铝箔包裹石英管。将不锈钢针尖固定在铝箔另一端1 cm处。将铝箔环用作低压电极。</li>
</ol>
2. 射流的获取
<ol>
	<li>为了提供交流信号，将高压功率放大器连接到作为电源的函数信号发生器。为了记录施加到高压电极上的电压波形，将高压探头的一端连接到数字示波器，另一端连接到电源。为保护电路，使用一个2 kΩ的电阻作为保护电阻。按图2所示连接电路。 
	警告：切勿触碰高压线路。</li>
	<li>持续将氦气（体积分数99.999%）通入石英管中，并将气体流速稳定控制在1.4标准升每分钟（SLM）。 
	注意：在处理细胞培养物之前，我们不使用过滤器。实验中所用氦气的体积分数为99.999%，大多数微生物在此条件下无法存活。</li>
	<li>打开示波器、信号发生器和高压功率放大器的电源。将频率调节旋钮调至5 kHz，然后逐步升高电压至峰峰值6 kV。 
	注意：当施加在针电极上的电压峰峰值约为6 kV时，等离子体射流长度已足够（约3 cm）。</li>
</ol>
3. SH-SY5Y 细胞的制备
<ol>
	<li>在25 cm2培养瓶中，使用添加15%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系。将细胞置于含5% CO2和95%空气、37 °C的湿润培养箱中维持培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到85%时，小心吸除培养液，向细胞中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶 + 0.1% EDTA。</li>
	<li>室温孵育15秒后，小心吸除胰蛋白酶溶液，加入2 mL含15% FBS的RPMI 1640培养基以中和反应。</li>
	<li>轻柔吹打细胞，冲洗培养瓶底部，直至SH-SY5Y单层细胞完全脱落。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，用含15% FBS的RPMI 1640培养基将细胞浓度调整至2 × 105 cells/mL，然后将100 µL细胞悬液转移至96孔板的每个孔中。</li>
	<li>将细胞置于细胞培养箱中贴壁12小时后，再进行APPJ处理。</li>
</ol>
4. SH-SY5Y细胞的APPJ处理
<ol>
	<li>调节石英管喷嘴与放置96孔板平台之间的距离至3 cm。确保等离子体束能够接触到培养基表面。 
	注意：该距离并非从孔板底部测量，而是首先将石英管喷嘴与用于放置96孔板的平台之间的距离调整为3 cm。</li>
	<li>在进行APPJ处理前，除对照孔外，将每孔中的培养基更换为不含葡萄糖的RPMI 1640培养基。</li>
	<li>将孔板置于APPJ喷嘴下方，并确保等离子体射流可垂直进入各孔中。</li>
	<li>分别对不同孔中的细胞进行0 s、1 s、2 s、4 s、8 s和12 s的APPJ处理。 
	注意：APPJ通过电离氦气产生（图1）。为排除氦气本身对细胞的影响，对因葡萄糖剥夺而受损的细胞同时进行4 s和8 s的纯氦气流处理。所有处理均应设置三个重复。</li>
</ol>
5. 细胞活力检测
注意：此步骤中不要更换培养基。
<ol>
	<li>APPJ 处理后，将细胞在细胞培养箱中孵育 1 小时。</li>
	<li>向每孔中加入 10 µL 细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液。</li>
	<li>在 37 °C 下孵育细胞 4 小时。 
	注意：SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖剥夺条件敏感12。在葡萄糖剥夺 1 小时后，细胞活力下降至约 50%，此条件适用于药效学研究中的最佳细胞活力状态。CCK-8 对细胞无细胞毒性，因此在 APPJ 处理后，细胞在葡萄糖剥夺条件下继续与 CCK-8 试剂共同孵育 4 小时以检测细胞活力。经过 8 小时葡萄糖剥夺和 APPJ 处理后，APPJ 的保护作用显著减弱，因为长时间的葡萄糖剥夺导致 SH-SY5Y 细胞受到严重损伤。在葡萄糖剥夺 24 小时后未观察到存活细胞11。</li>
	<li>使用酶标仪在 450 nm 波长下测定吸光度。</li>
</ol>

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</ol>

本文未声明任何利益冲突。

SH-SY5Y 细胞是一种来源于人神经母细胞瘤的细胞系，被广泛用作研究神经生物学和神经退行性疾病的合适细胞模型 体外 神经毒性或神经保护研究12SH-SY5Y 细胞系对葡萄糖剥夺条件敏感。在葡萄糖剥夺1小时后，细胞活力下降至近50%，此条件适用于药效学研究中的最佳细胞活力状态。此外，CCK-8试剂对细胞无细胞毒性，经APPJ处理后，细胞在葡萄糖剥夺条件下继续与CCK-8试剂共孵育4小时以检测细胞活力。本研究中，我们提供了一项详细的 体外 关于大气压等离子体射流（APPJ）在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中神经保护作用的治疗方案。
修改与故障排除 
若各孔中颜色发生显著变化，CCK-8孵育时间可相应缩短。但若SH-SY5Y细胞密度低于1 x 104 每孔细胞，在葡萄糖剥夺和APPJ处理后细胞将死亡。建议在确保等离子体束能够接触培养基表面的前提下，降低气体流速。APPJ也可用于其他神经元相关细胞系（HT-22、neuro-2A，甚...

在正常生理条件下，成年大脑几乎 exclusively 以葡萄糖作为能量代谢的底物。人类大脑仅占体重的 2%，但消耗了体内约 25% 的总葡萄糖。1众所周知，葡萄糖代谢功能障碍是缺血性脑卒中以及多种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病（AD）、亨廷顿病（HD）和帕金森病（PD））中的主要病理变化之一。2,3缺乏葡萄糖，或葡萄糖摄取受损，或氧化磷酸化功能障碍，均可直接影响ATP的生成，进而诱导神经细胞死亡，这可能增加神经元功能障碍的风险，提示维持细胞活力或延缓葡萄糖剥夺后的细胞损伤可能是治疗此类疾病的一种合理策略。通过调节葡萄糖代谢来研究神经保护作用，重点关注抗炎剂、离子通道调节剂、自由基清除剂、神经营养因子 等等。 一直备受关注。然而，这些神经保护策略从实验室到临床应用的转化尚未取得成功4.
大气压等离子体射流（APPJs）是一种新型的大气压低温气体放电技术，近年来受到来自多个学科领域众多研究人员的关注。APPJs 数十年来已被应用于多种生物医学领域，如癌细胞治疗、细菌失活、血液凝固、伤口愈合、口腔医学 等等。5,6，由于其会释放多种活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）（图1)7既往的等离子体生物医学应用主要集中在对细菌、细胞和组织的氧化和/或硝化应激作用8然而，APPJ 也可能是一种 &#34;双刃剑&#34; 由于活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）是与多种生理及病理生理过程相关的重要细胞内信号分子9一氧化氮（NO）调控多种生物过程，在人体内具有双重作用，尤其在中枢神经系统（CNS）中表现显著。低浓度的NO已显示出其神经保护活性 体外 和 体内 通过多种信号通路10我们之前的研究首次报道了氦气常压等离子体射流（APPJ）诱导的一氧化氮（NO）生成参与了APPJ对抗氧化应激损伤的神经保护作用11然而，关于APPJs对其他类型损伤的作用尚未见报道。因此，本研究旨在提供一种 体外 关于氦气常压等离子体射流（helium APPJ）在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中神经保护作用的治疗方案。与以往研究不同，本方案采用低剂量等离子体处理，实现神经保护效应，同时避免了过量等离子体引发的损伤，表明APPJ处理有望作为一种新型神经保护策略 &#34;NO供体药物&#34; 用于未来的研究，甚至临床转化。该方案还可建议用于其他类型细胞的细胞保护应用，但需重新调整APPJ处理条件，且处理剂量应相对较低。

<table><tbody><tr><td>SH-SY5Y细胞系</td><td>中国典型培养物保藏中心</td><td>3111C0001CCC000026</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>21875091</td><td>4℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>无葡萄糖 RPMI 1640 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11879020</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16000044</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Solarbio</td><td>T1300</td><td>4 ℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>96孔板</td><td>corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数试剂盒-8（CCK-8）</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04</td><td>4 ℃ 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>微孔板读板机</td><td>Tecan</td><td>M200 Pro</td><td>用于在 450 nm 处测量吸光度</td></tr><tr><td>高 &amp;ndash; 电压功率放大器</td><td>跋涉</td><td>PD06087</td><td>用于增强功率</td></tr><tr><td>函数信号发生器</td><td>MaZe Electronics Science&amp;与技术</td><td>AT30120</td><td>用于提供特异性信号</td></tr><tr><td>高 &amp;ndash; 电压探针</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td>用于检测高电压</td></tr><tr><td>数字示波器</td><td>Tektronix</td><td>DPO4104B</td><td>用于显示信号</td></tr></tbody></table>

一种新型常压等离子体射流在对抗sh-sy5y细胞葡萄糖剥夺损伤中的神经保护作用应用

New Application of an Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells

近年来，大气压等离子体射流（APPJ）因其可产生多种活性氮物种（RNS）和活性氧物种（ROS）而受到来自多个学科领域研究人员的广泛关注。我们先前的研究已证实APPJ对氧化应激所致损伤具有细胞保护作用。本研究旨在提供一份详细的体外（in vitro）治疗方案，用于描述氦气APPJ在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的神经保护应用。人源神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系在补充有15%胎牛血清的RPMI 1640培养基中维持培养。在进行APPJ处理前，将培养基更换为无葡萄糖的RPMI 1640培养基。在细胞培养箱中孵育1小时后，使用细胞计数试剂盒8（Cell Counting Kit 8）测定细胞活力。结果显示，与葡萄糖剥夺组相比，经APPJ处理的细胞表现出显著更高的细胞活力，且呈剂量依赖性，其中以每孔8秒为最佳处理剂量。同时，氦气气流本身对葡萄糖剥夺引起的细胞损伤无任何影响。我们的结果表明，APPJ有望作为治疗中枢神经系统中与葡萄糖剥夺相关疾病的一种方法。该方案也可拓展应用于其他不同类型损伤的细胞保护，但需重新调整细胞培养条件和APPJ处理参数，且处理剂量应相对较低。

数据以至少三次独立实验的均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析（ANOVA）对组间结果进行方差分析。所有统计分析均使用统计分析软件 Prism 进行，以 p&lt;0.05 作为具有统计学显著性的阈值。
在CCK-8孵育4小时后测定细胞活力。如图3所示，与对照组（在含15% FBS的RPMI 1640培养基中正常培养的细胞）相比，葡萄糖剥夺使SH-SY5Y细胞的活力降低至44.1 ± 2.6%。APPJ处理以剂量依赖性方式显著提高了细胞活力，在每孔8秒的最佳剂量下，细胞活力达到62.27 ± 3.1%。气体流量对葡萄糖剥夺引起的细胞损伤无影响（Table 1）。

<img alt="大气化学反应示意图，展示臭氧、NOx 和自由基的转化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56323/56323fig1.jp...

一种低剂量常压等离子体处理用于葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤的神经保护应用方案。

一种新型常压等离子体射流在对抗SH-SY5Y细胞葡萄糖剥夺损伤中的神经保护作用应用

近年来，大气压等离子体射流（APPJ）因其发射特性而受到来自多个学科领域的众多研究人员的关注……

本治疗方法的总体目标是提供一种详细的体外处理方案，用于氦气常压等离子体射流在葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤中的神经保护应用。该方法有助于解答等离子体应用领域中的关键问题，例如等离子体医学。该技术的主要优势在于，与以往方法相比，其等离子体处理强度相对较低，但仍可实现一致性的处理效果。我们每个人都可以预防过度的等离子体诱导损伤。该技术的应用意义延伸至缺血性脑病的治疗，因为葡萄糖供应不足是该疾病的一个共同特征。尽管该方法可为等离子体在医学领域的新应用提供见解，但它也可应用于其他系统，例如心血管系统。初学者通常可能因不同等离子体设备需要重新调整处理参数而遇到困难。首先，将高压功率放大器连接至作为电源的函数信号发生器，以提供交流信号。为了记录施加到高压电极上的电压波形，将高压探头的一端连接至数字示波器，另一端连接至电源。持续将氦气通入常压等离子体射流装置的石英管中，并将气体流速控制在稳定的 1.4 标准升每分钟。接着，打开示波器、信号发生器和高压功率放大器。将频率调节旋钮旋转至 5 千赫兹。然后逐渐将电压升高至峰峰值6 kV。在培养SH-SY5Y人神经母细胞瘤衍生细胞系后，当细胞达到85%融合度时，小心吸除细胞培养基。向细胞中加入1 mL含0.1% EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液。室温孵育15秒后，小心吸除胰蛋白酶，并加入2毫升含15%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基以中和。轻轻吹打洗涤每个孔的底部，直至SH-SY5Y单层细胞完全脱落。随后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过添加含15% FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度。然后将100 µL细胞悬液转移至96孔板的每个孔中。调节石英管喷嘴与放置96孔板平台之间的距离为3 cm，以确保光束能够接触到培养基表面。处理前，将每孔中的培养基更换为不含葡萄糖的RPMI 1640培养基。现在，将培养板置于常压等离子体射流喷嘴下方。然后，分别对不同孔中的细胞进行0、1、2、4、8和12秒的处理。处理结束后，将细胞在37摄氏度的细胞培养箱中孵育1小时。孵育后，向每个孔中加入10 µL细胞计数试剂盒8溶液。然后在37°C下将细胞孵育4小时。最后使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。与对照组相比，葡萄糖剥夺使 SH-SY5Y 细胞的存活率降低至 44.1 ± 2.6%。大气压等离子体射流处理以剂量依赖的方式显著提高了细胞存活率，最佳剂量为每孔 8 秒，此时细胞存活率达到 62.27 ± 3.1%。气体流速对葡萄糖剥夺引起的细胞损伤无影响。一旦掌握，若操作得当，该技术可在30小时内完成。在实施该步骤时，重要的是务必记住在使用前查阅所有材料的安全数据表。该技术问世后，为等离子体医学领域的研究人员探索其他类型脑损伤的新应用以及构建更新的损伤模型开辟了道路。观看本视频后，您应能充分了解如何将常压等离子体射流应用于新的实际场景。请务必注意，使用高压功率放大器时可能存在极高危险性，因此在执行该操作时，必须采取相应的预防措施，例如切勿触碰高压线路。

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常压等离子体射流作为神经保护剂抗葡萄糖剥夺诱导 SH-SY5Y 细胞损伤的新应用

已开发出一种使用霍普金森杆装置的新型脉冲式细胞加压实验，用于研究爆炸所致创伤性脑损伤的分子/细胞机制。...

用于创伤性脑损伤研究的神经元细胞冲击性加压

取一只经激光诱导眼内视神经乳头损伤的小鼠。这种损伤会导致供应神经的血管内皮细胞受损并形成血栓，从而减少血流，引起缺血。缺血使视神经乳头中的视网膜神经节细胞轴突失去氧气供应。在RGC细胞体中，这种破坏会损害线粒体功能并增加活性氧的产生。由此产生的氧化应激会激活凋亡信号通路，导致视网膜神经节细胞（RGC）损伤。将小鼠放入加压舱中，并使其暴露于富氧环境中。在高浓度下，氧气溶解于血浆中并扩散到缺血的神经内。作为响应，视网膜神经节细胞中的抗氧化酶被激活，以中和活性氧（ROS）。抗凋亡基因表达增加，从而增强视网膜神经节细胞的存活。此外，增加的氧气可激活血管中溶解血栓的酶。氧气还会触发血管扩张，恢复神经的血液供应。...

高压氧治疗作为前部缺血性视神经病变的神经保护策略

本视频介绍了一种利用低温大气等离子体诱导神经干细胞分化的实验方法。该方法通过产生紫外辐射和活性分子，刺激神经细胞长出突起，表明神经元细胞发生了分化。...

利用冷大气等离子体处理促进神经干细胞分化

来源：Yan, X., 等., 大气压等离子体射流作为抗葡萄糖剥夺诱导的SH-SY5Y细胞损伤神经保护剂的新应用。J. Vis. Exp.

评估大气压等离子体处理对葡萄糖剥夺神经母细胞瘤细胞的影响

缺血性脑卒中是一种复杂的病理事件，其中星形胶质细胞在暴露于氧糖剥夺（OGD）的脑区所发挥的特定作用难以研究。本文介绍了一种获取分离星形胶质细胞的方法，并研究其在氧糖剥夺条件下的反应性及增殖能力。...

监测星形胶质细胞反应性与增殖 体外 在模拟缺血条件下

酸性后处理可保护脑缺血损伤。本文介绍了两种实施酸性后处理的模型，分别通过在氧糖剥夺后将皮质-纹状体脑片转移至酸性缓冲液中来实现。 体外 并通过吸入20% CO2 大脑中动脉闭塞后 体内.

研究酸性后处理对脑缺血神经保护作用的实验模型

本文介绍了一种原发性冲击波致创伤性脑损伤的新型模型。采用压缩空气驱动的激波管对受试对象进行暴露 体外 小鼠海马脑片培养单次冲击波处理。该方法是一种简单、快速的方案，可高通量地产生可重复的脑组织损伤。...

一种新型方法 体外 爆炸性创伤性脑损伤模型

本方案旨在提供关于冷大气等离子体处理神经干细胞以及通过免疫荧光检测促进其分化的详细实验步骤。...

一步式冷大气等离子体处理诱导神经干细胞分化 体外

本文报道了一种通过小鼠颈总动脉或大鼠颈外动脉在缺血性脑卒中后递送神经干细胞的方法，该方法适用于注射溶液或悬浮液。注射后的细胞广泛分布于脑实质中，并可在递送后长达30天内被检测到。...

向大鼠和小鼠脑内动脉内递送神经干细胞：应用于脑缺血

本研究描述了用于三维脑肿瘤模型的柔性叉指电极的开发，即 体外 培养 在卵内 模型，以及 体内...

用于胶质母细胞瘤脉冲电场治疗的柔性有机电子器件

脂肪来源的间充质基质细胞（AdMSCs）具有强大的免疫调节特性，可用于治疗与炎症相关的疾病。本文演示如何分离和培养小鼠AdMSCs及原代混合神经胶质细胞，刺激AdMSCs以使其上调抗炎基因和生长因子，评估AdMSCs的迁移能力，并将AdMSCs与原代混合朊病毒感染的神经胶质细胞进行共培养。...

脂肪来源的间充质基质细胞与原代混合神经胶质细胞共培养以减轻朊病毒诱导的炎症

了解常压等离子体射流在SH-SY5Y细胞中的神经保护应用方法。该技术通过低剂量氦等离子体处理减轻葡萄糖剥夺诱导的损伤，为缺血性脑病治疗提供低成本新方案。

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