Name: 肾水动力肾盂注射非病毒蛋白在肾脏的表达 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学习通过肾盂注射质粒DNA实现小鼠肾脏特异性蛋白表达的方法。该技术利用流体动力学递送缓冲液，可在成年小鼠肾脏中产生可重复的转基因表达，为肾脏病学研究提供可靠工具。

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美国退伍军人事务部 [BX002797] 的职业发展奖资助了 L.E.W.，美国国立卫生研究院 [R01-DK095867] 和美国心脏协会 [15GRNT25700209] 资助了 J.C。美国国立卫生研究院 [DK093660]、美国退伍军人事务部 [BX002190] 以及范德堡肾脏疾病中心资助了 M.H.W。本研究工作得到了田纳西河谷医疗保健系统退伍军人事务部的资源和设施支持。

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</ol>

作者声明无任何披露事项，且不存在利益冲突。

本方案描述了一种在肾脏中实现可重复基因表达的稳健方法。对于具备中等经验的外科操作者而言，采用该技术转染的小鼠比例可达50–100%，具体数值取决于小鼠年龄及外源基因检测方法的灵敏度。在接受piggyBac转座子的小鼠中，荧光素酶基因的表达水平在数月内均高于背景值；在免疫缺陷小鼠中，相同转座子的表达可完全维持数周11。尽管在注射位点附近区域，许多细胞对外源基因呈现强染色信号，但整体转染效率相对较低（图3D）。实现理想实验结果最关键的材料是注射用注射器本身，必须使用29G × ½"的胰岛素注射器，配备固定针头，且无任何阻碍注射的安全装置。注射过程必须迅速，控制在3秒内完成。质粒DNA制备物应高度纯净，内毒素和细菌基因组DNA含量需极低19。
可以推测，其他物质（如RNA、病毒或蛋白质）的注射也可采用类似方法进行。与肾静脉或直接肾实质注射等其他注射位点相比，肾盂作为注射入路更具优势。这些其他注射方式易导致出血且基因表...

水动力尾静脉注射技术已成为在小鼠肝脏中实现高水平基因表达的常用方法1,2。该技术也可转染肾脏，但效率显著较低，约为肝脏的1/1003。本文所述的水动力肾盂注射方法提供了一种通过物理手段控制器官特异性表达的简便方法，其基于先前已在肝脏4,5、肌肉6及其他器官7,8中确立的水动力学原理。该方法通过压力和速度将含有DNA的液体强制导入活体动物in vivo的细胞中，从而实现细胞转染，同时会诱发器官轻微损伤，但该损伤可迅速修复9。通过成熟的外科手术技术，经侧腹切口暴露肾脏10，并使用胰岛素注射器进行单次注射，我们已成功实现了多种肾细胞类型的转染，主要包括间质成纤维细胞、肾小管和集合管11。对这些小鼠的解剖分析表明，其他器官的转染水平极低，无法通过荧光素酶成像技术检测到11。由于该技术为非病毒性方法，使用质粒DNA进行转染，可快速且简便地制备注射所需的试剂。
我们采用局部水动力注射法，在肾脏中表达了抗氧化酶谷胱甘肽S-转移酶A4、类胰岛素生长因子-1受体以及激素促红细胞生成素，均产生了预期的生物学效应11,12,13已对给药途径、注射体积、DNA剂量和启动子选择进行了详细评估11此外，两者均 piggyBac 转座子系统和/或环磷酰胺处理已被证明可通过抑制对转基因的免疫反应，改善长期基因表达效果11其他研究者已成功采用经肾静脉途径在大鼠中实现高效转染，并维持超过一个月的较长转染时间14然而，模拟人类疾病的表型进行基因校正通常首先在小鼠中进行概念验证，因为大多数哺乳动物遗传模型均为小鼠模型。我们比较了肾静脉注射与肾盂注射，发现肾盂注射在基因表达（约高出十倍）和存活率方面均优于肾静脉注射11肾盂是进入肾脏的理想途径，因为它具有足够的弹性，能够耐受尿液生成量的波动，即使在肾积水导致扩张的情况下，通常也能保持其结构完整性。此外，通过肾盂注射可避免穿刺肾脏包膜，使注入的液体能更明显地被肾脏保留，效果优于肾实质内注射。其他小鼠器官通常没有除血管系统以外的给药途径，而肾脏的尿液腔则是一个理想的注射部位。相比之下，经肾静脉注射则容易导致血液泄漏至腹腔。通过磁共振成像估算，野生型小鼠肾脏的总体积约为0.2 cm³。3因此，单个肾脏的体积约等于经肾盂水动力注射所注入的液体量（100 µL）15本文提供了实现肾脏可重复转染的水动力肾盂注射方案的全部详细技术要点。

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>帕特森兽医用品公司</td><td>07-808-1947</td><td>麻醉剂 - 非管制物质</td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器 0.5 mL 29G 1/2 英寸</td><td>卡地纳健康集团</td><td>309306</td><td>必需注射器</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>药剂师/兽医</td><td></td><td>镇痛药 - 管制药品</td></tr><tr><td>Dynarex 一次性毛巾巾单</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>19-310-671</td><td>覆盖于加热垫上</td></tr><tr><td>EndoFree 质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>仅使用无内毒素质粒DNA</td></tr><tr><td>Endosafe 凝胶法LAL快速阳性对照品</td><td>查尔斯河实验室</td><td>PC200</td><td>内毒素检测的阳性对照</td></tr><tr><td>Endosafe 凝胶法LAL快速单次检测瓶</td><td>查尔斯河实验室</td><td>R13500</td><td>内毒素检测</td></tr><tr><td>超细显微解剖剪</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5882</td><td>外科手术工具</td></tr><tr><td>Fisherbrand 即时密封灭菌袋 - 9&quot;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>01-812-51</td><td>用于外科器械高压灭菌</td></tr><tr><td>Gaymar 循环水加热泵</td><td>Paragon 医疗公司</td><td>TP-700</td><td>水循环加热泵</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>DS-401</td><td>术中重复使用外科器械</td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5136</td><td>外科手术工具</td></tr><tr><td>Graefe 组织镊</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-5153</td><td>外科手术工具</td></tr><tr><td>Halsey 持针器，5&quot; 长度</td><td>Roboz外科器械公司</td><td>RS-7841</td><td>外科手术工具</td></tr><tr><td>加热垫 - 15&quot; x 21&quot; - 至少需要3个</td><td>Paragon 医疗公司</td><td>TP22G</td><td>与 Gaymar 加热泵配合使用</td></tr><tr><td>IsoFlo（异氟烷，USP）</td><td>雅培动物健康公司</td><td>5260-04-05</td><td>用于成像和安乐死</td></tr><tr><td>Isotec 异氟烷输送系统蒸发器</td><td>史密斯医疗公司</td><td>VCT3K2</td><td>用于成像和安乐死</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>药剂师/兽医</td><td></td><td>麻醉剂 - 管制药品</td></tr><tr><td>Kimwipes 纸巾</td><td>金佰利专业用品公司</td><td>34120</td><td>实验室用纸巾</td></tr><tr><td>Living Image 软件</td><td>Caliper 生命科学公司</td><td></td><td>用于活体动物成像</td></tr><tr><td>荧光素</td><td>珀金埃尔默公司</td><td>122796</td><td>用于活体动物成像</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>用于DNA浓度测定的分光光度计</td></tr><tr><td>Prevantics 消毒棉片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23-100-110</td><td>用于皮肤手术前准备</td></tr><tr><td>Prolene 5-0 缝线 Taper 30&quot;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NC0256891</td><td>皮肤用不可吸收缝线</td></tr><tr><td>Puralube 品牌眼用软膏</td><td>帕特森兽医用品公司</td><td>07-888-2572</td><td>术中保持眼睛湿润</td></tr><tr><td>Trans IT - QR 水动力递送溶液</td><td>Mirus Bio 公司</td><td>MIR-5240</td><td>用于稀释DNA的水动力递送缓冲液</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 缝线 J303H</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NC9816710</td><td>肌肉层用可吸收缝线</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco 电推剪</td><td>Med-Vet 国际公司</td><td>8787-1550</td><td>皮肤准备用剃毛器</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper 生命科学公司</td><td></td><td>用于活体动物成像</td></tr></tbody></table>

水动力肾盂注射法实现肾脏内非病毒蛋白表达

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

水动力注射通过产生局部高压环境，将质粒DNA及其他物质转染到多种组织中。例如，水动力尾静脉注射是一种已建立成熟的方法，可用于肝脏的转染。本文描述了一种基于水动力原理的应用方法，即直接向小鼠肾脏注射含质粒DNA的溶液，以实现肾脏特异性的基因表达。实验过程中，小鼠经麻醉后，通过侧腹部切口暴露肾脏，并将含有质粒DNA的溶液快速注入肾盂。针头留置10秒后取出，随后缝合切口。次日可采用活体动物成像、Western blot或免疫组织化学方法检测基因表达水平，也可根据所选目的基因的特点选用其他适宜的检测方法来分析目标蛋白的表达。已有文献报道的延长基因表达的方法包括转座子介导的转基因整合以及使用环磷酰胺抑制机体对转基因的免疫反应。

掌握后，手术和注射技术操作简单，无需大型设备或昂贵材料。如果初次进行侧腹切口肾脏手术，建议安排一天培训时间，使用数只计划实施安乐死的小鼠进行练习，且术后不需复苏动物，因为首次尝试该手术所需时间可能远长于正常情况。或者，熟悉类似技术的研究人员可能会发现该操作相当简便。请仔细参照图1中的示意图以及图2中的图解说明。为准确确定切口位置，可将小鼠侧卧放置，术者用手指轻压其腹部，此时肾脏会因轻微腹压而在靠近脊柱处形成一个小隆起，切口应位于该区域上方（图1和图2）。切口需准确穿过皮肤和肌肉层，并保持合适大小（图1）。若切口过大，肾脏容易滑回腹腔，导致注射困难；若切口过小，则难以将肾脏推出腹腔，可能造成器官损伤。另一个关键点是针头在肾盂内的定位。术者应先用闭合的镊子轻压肾脏使其下移，然后以平...

本方案描述了一种通过肾盂将质粒DNA注射到小鼠肾脏中，以在肾脏内特异性表达外源基因的方法。

水动力注射通过产生局部高压环境，将质粒DNA及其他物质转染到多种组织中。水动力尾静脉注射...

本手术操作的总体目标是在成年小鼠肾脏中实现质粒DNA的蛋白表达。该方法是一种研究肾脏病学关键问题的新工具，例如，特定目标蛋白的表达如何影响成年肾脏的功能。该技术的主要优势在于，它能够在肾脏中以可重复的方式特异性地实现蛋白表达，而不同于其他可能在多个器官中同时引发基因表达的方法。该方法的可视化演示至关重要，因为肾盂注射需要仔细暴露，并且必须快速完成，以确保质粒 DNA 进入细胞。首先将质粒 DNA 重悬于水动力转染缓冲液中。将小鼠放置在覆盖蓝色垫片的循环水加热垫上。使用专为宠物美容设计的剃毛器，将小鼠背部左侧从肩部到臀部、侧腹到脊柱的毛发剃除。清除松散的毛发和碎屑，并在小鼠双眼涂抹兽用眼膏，以防止角膜干燥。随后，为每只已麻醉的小鼠准备一支独立的注射器，其中含有100 µL稀释的质粒DNA溶液，DNA含量为10至50 µg，确保注射器内无气泡。针头应为永久固定且不带安全装置。在实施手术前，将无菌手术器械取出并放置在加热垫上的无菌托盘中，注意不要触碰。现在拿起小鼠，将其固定在光照充足的视野范围内。从包装中取出3.15%葡萄糖酸氯己定和70%异丙醇皮肤消毒片，放置在动物附近。佩戴无菌外科手套，从切口部位开始，使用新的含氯己定的酒精消毒片以环形方式擦拭动物皮肤三次。现在，确定切口位置。用镊子夹住皮肤，使用剪刀在肋骨下方、距脊柱约一厘米处切开皮肤层。在肌肉层下方同样做一处一厘米的切口。找到肾脏，在不触碰肾脏的情况下，用手指对腹部施加稳定而轻柔的压力，将其从腹腔中轻轻暴露出来。暴露肾脏有时较为困难。应轻柔地对腹部和脊柱施加压力，以避免损伤脾脏。如果除肾脏外的其他器官脱出，必要时可用闭合的镊子轻轻将其送回体腔内。然后，轻轻分离肾脏周围的脂肪组织，直至能够看到肾盂，肾盂呈现为一个微小白点。观察到肾盂后，用闭合的镊子轻压肾脏右侧，以保持肾盂处于视野中。接着，右手握住胰岛素注射器，使其与操作台面平行，小心地将针头插入肾盂内。针头插入后，应在三秒内迅速注射溶液。让针头原位停留约10秒，以防止溶液回流。随后，缓慢而小心地拔出针头，并用闭合的镊子轻轻牵拉切口部位，将器官复位至腹腔内。现在，使用5-0可吸收缝线缝合肌肉层，并打2到4个独立结。同样，使用5-0或6-0不可吸收尼龙缝线缝合皮肤层，并打2到4个独立结。为评估转染效率，可在注射用稀释DNA中加入10 µg表达荧光素酶的质粒，于次日进行活体动物成像。将第一笼小鼠放入腔室并密封。麻醉后，每只小鼠腹腔注射100 µL解冻的荧光素，记录注射时间。选择正确的用户ID，从顶部菜单栏点击采集，然后从下拉菜单中选择自动保存二。单击“初始化”以启动系统。等待初始化完成，然后将视野更改为 D，以对五只小鼠进行成像。确保动物按所需顺序放置，并使其背部朝向相机，以便观察肾脏。然后，在注射后五分钟按下采集按钮以获取图像。采集完成后，将小鼠从成像仪器中取出，并关闭气体。清洁腔室、鼻梳和成像平台。分析数据时，单击 ROI 工具后，点击圆形图标，并从下拉菜单中选择一项，在图像中放置新的 ROI，该 ROI 以红色椭圆及周围的四个方块标示。要调整 ROI 的大小，请将光标置于红色方块上并拖动，以圈定覆盖注射侧肾脏的紫色区域。现在，右键单击此感兴趣区域（ROI），选择“复制 ROI”以在当前窗口中复制该 ROI，并将其移动到下一只小鼠上方。将所有来自图像正上方菜单的 ROI 放置完毕后，将单位从计数更改为辐射光子数。最后，通过点击 ROI 工具，然后点击铅笔与标尺图标，从工具面板导出 ROI 数据，生成测量值的电子表格。图中显示了报告质粒在肾脏中的特异性基因表达。所有小鼠均注射了表达增强型萤火虫荧光素酶的 pTet 质粒，其中第二、第三和第五只小鼠 additionally 注射了 pEF1-alpha-tdtomato 质粒，该质粒表达红色荧光蛋白 tdtomato。通常情况下，幼年小鼠的辐射强度差异在同一个数量级内。某些小鼠可能未表现出明显的发光水平，这可能是由于转染效率较低或缺乏转基因本身所致。注射水动力缓冲液可作为对照。仅给予水动力缓冲液时，未观察到质粒表达。转染后的最初几天内，表达外源基因的阳性染色细胞数量可能较少。这些细胞通常局限在注射液体渗透区域的斑块状部位。在本图像中，绿色信号来自近端小管，经莲藕四棱豆凝集素染色标记；红色信号则来自转染并表达tdtomato报告基因的细胞。一旦掌握该手术技术，手术本身可在10分钟内完成；然而，麻醉的诱导和恢复需要一定时间。因此，两名经过培训的人员密切配合，每天大约只能完成10至15只小鼠的手术。在实施该操作时，务必注意使用年轻的小鼠。流体动力学技术在较老的纤维化器官中效果不佳。完成此操作后，可进行其他方法，例如对血液、尿液和肾组织样本进行分析，以评估目的基因的表达情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何向肾盂注射质粒DNA，以实现肾脏特异性蛋白表达。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肾水动力肾盂注射非病毒蛋白在肾脏的表达

来源：Gupta, K., 等. 肾盂肾炎大鼠模型中大肠杆菌的肾内注射. J. Vis. Exp. (2017).本视频演示了将E.

向大鼠肾盂内注射E. coli

来源：Van Lidth de Jeude, 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析实验方案。 J. Vis. Exp.

聚乙烯亚胺介导的胚胎肾细胞转染以生产重组病毒

在本视频中，我们介绍了将质粒通过水动力注射法导入小鼠肾脏肾盂以实现核酸转染的实验方案。该技术利用高静水压的原理，可在不造成组织损伤的情况下，将质粒强制导入特定器官部位，实现器官特异性的质粒递送。...

水动力肾盂注射：一种将DNA直接递送至小鼠模型肾细胞的技术

在本视频中，我们演示了通过肾动脉对大鼠进行肾内给药的方法。该方法有助于提高药物靶向性、药效，并最大限度地减少全身毒性。...

大鼠肾内药物递送：通过动脉内注射将治疗药物递送至大鼠肾脏的方法

本文介绍了一种利用命运图和谱系示踪技术，将注射靶向至个体卵裂球的实验方案，这些卵裂球将发育为非洲爪蟾（Xenopus...

靶向显微注射技术用于发育中的 非洲爪蟾 肾脏

由肾毒性物质（包括从抗生素到化疗药物等多种药物）引起的肾脏损伤可导致复杂的疾病，其发病机制尚未完全阐明。本方案展示了如何利用斑马鱼对这些疾病进行建模，进而用于筛选和鉴定具有肾保护作用的干预措施。...

斑马鱼肾毒素显微注射建立急性肾损伤模型

为恢复肾功能而给予药物时，需要控制治疗化合物的定位和分布。本文详细描述了一种在大鼠中进行肾内给药的简单技术。该操作易于实施，无死亡率，且具有高度可重复性。...

向大鼠肾脏血管内递送生物制剂

本论文描述了一种通过直接肾内感染建立大鼠肾盂肾炎的外科手术模型 大肠杆菌...

肾内注射 大肠杆菌 在肾盂肾炎大鼠模型中

本论文描述了一种通过在小鼠肾下腹主动脉放置导管，实现向单侧肾脏靶向递送的方法。...

经肾动脉直接向肾脏递送药物

在此，我们将外源性人工合成的miRNA模拟物递送至肾脏 通过 在多种肾脏疾病小鼠模型中，通过尾静脉注射非病毒载体和聚乙烯亚胺纳米颗粒，导致肾脏中靶向miRNA显著过表达，从而抑制了多种小鼠模型中肾脏疾病的进展。...

利用聚乙烯亚胺纳米颗粒在多种肾病小鼠模型中向肾脏递送外源性人工合成的miRNA模拟物

本报告详细介绍了腺相关病毒载体的局部注射方法 通过...

高效且安全的小鼠肾脏基因递送 通过 腺相关病毒载体的缓慢逆行性肾盂注射

学习通过肾盂注射质粒DNA实现小鼠肾脏特异性蛋白表达的方法。该技术利用流体动力学递送缓冲液，可在成年小鼠肾脏中产生可重复的转基因表达，为肾脏病学研究提供可靠工具。

水动力肾盂注射法实现肾脏内非病毒蛋白表达

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