Name: 化重构法 (的) 对肠道干细胞和小生境细胞功能分析的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学习利用分选的Lgr5+肠道干细胞和Paneth小生境细胞进行类器官重构的方法，实现细胞类型特异性功能分析。该技术支持基因或生化修饰，为干细胞微环境研究提供精确工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由荷兰癌症协会（KWF；EMCR 2012-5473）和国际世界癌症研究基金会（WCRF；项目编号 2014-1181）的资助得以实现

所有操作均根据当地的动物福利法律法规和指南进行。
1. 仪器、培养基和培养皿的准备
<ol>
	<li>将一套肠剪、普通剪刀和镊子放入无菌容器中进行高压灭菌。</li>
	<li>将一个96孔（平底）培养板放入37 °C的培养箱中。</li>
	<li>根据材料表中列出的试剂，制备10 mL完全培养基。</li>
	<li>将完全培养基置于37 °C水浴中孵育。</li>
	<li>将重建的基底膜置于冰桶中解冻。重建的基底膜在4 °C时将变为液体状态。</li>
	<li>用4 °C的冷磷酸盐缓冲液（简称PBS）填充4个培养皿。</li>
</ol>
2. 小肠隐窝的分离
<ol>
	<li>使用 CO2 吸入法处死一只背景为 C57BL6/J 的 Lgr5-eGFP-IRES-CreERt2 小鼠。用剪刀沿纵向解剖腹膜。</li>
	<li>用镊子夹住胃部，并横向将其切成两半。</li>
	<li>此后使用肠用剪刀，将肠道拉出并置于含有 PBS 的培养皿中。 
	注意：肠用剪刀一端为锐利尖端，另一端为钝头。钝头设计用于在打开肠道时避免损伤隐窝-绒毛结构。</li>
	<li>首先将钝头插入胃部，轻柔地通过幽门推进。随后一边用剪刀剪开，一边用镊子牵拉。</li>
	<li>当整个小肠被纵向完全打开后，用镊子夹住组织，在冷 PBS 中以 U 形动作轻轻冲洗清洗。</li>
	<li>待所有粪便残留物清除后，将小肠平铺于切板上，腔面朝上。腔面可通过无血管分布及颜色较外侧更苍白的特征进行识别。</li>
	<li>用载玻片沿组织全长轻轻刮除绒毛，此步骤需重复两次。</li>
	<li>用无菌手术刀片将小肠切成 2–5 mm 的小段。</li>
	<li>将小肠片段放入含有 10 mL 冰冷 PBS 的 50 mL 离心管中。</li>
	<li>通过在 PBS 中反复吹打去除组织片段中的残余杂质，清洗组织。弃去上清液，并重复此步骤直至 PBS 完全澄清。</li>
	<li>加入 15 mL 冷 PBS，使 PBS 总体积达到 25 mL。加入 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），在 4 °C 条件下于旋转仪上孵育 45 分钟。</li>
	<li>弃去 PBS/EDTA 溶液。</li>
	<li>加入 10 mL PBS，通过剧烈吹打组织片段（至少三次）使隐窝脱落。收集上清液。</li>
	<li>重复步骤 2.13 四次。加入培养基，使最终体积达到 50 mL。</li>
	<li>通过离心（300 × g，5 分钟）沉淀细胞。</li>
	<li>将沉淀重悬于 10 mL 培养基中，再次离心以沉淀隐窝（80 × g，3 分钟）。</li>
</ol>
3. 单细胞制备
<ol>
	<li>弃去沉淀的隐窝上清液，加入1 mL类胰蛋白酶溶液和50 µL DNA酶（50 µg/mL），重悬隐窝。</li>
	<li>将细胞置于32 °C水浴中孵育2分钟。</li>
	<li>加入10 mL培养基，通过剧烈吹打至少5次，将隐窝解离为单个细胞。</li>
	<li>将溶液经40 µm细胞筛过滤（以去除团块和其他杂质），在300 × g离心5分钟，沉淀单细胞。</li>
</ol>
4. 流式细胞术与铺板
<ol>
	<li>配制 50 mL 的 1×&#160;Hank's 平衡盐溶液（HBSS）/2% 胎牛血清（FCS）溶液，并按每 106 个细胞加入 1 mL 的量重悬细胞沉淀。</li>
	<li>向细胞悬液中加入 BV421 标记的 Lin−（CD31、CD45、TER119）抗体（1:100 稀释度）、CD24-APC 抗体和 CD117-PE 抗体（均为 1:250 稀释度），4°C 避光孵育 30 分钟。</li>
	<li>将 Lgr5+ 干细胞和潘氏细胞分选至不同的低吸附离心管中。有关 Lgr5+ 干细胞和潘氏细胞的分选方案详情，请参见 Roth 等7 和 Schewe 等6。
	<ol>
		<li>将分选后的细胞以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清。用 100 µL 含有步骤 1.3 所述组分的培养基重悬细胞（参见 材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对潘氏细胞（n = 2000）或 Lgr5+ 干细胞（n = 2000）进行处理（例如，通过化学或基因修饰）。
	<ol>
		<li>处理细胞时，在 100 µL 培养基中加入 5 µL 脂质体介导的转染试剂和终浓度为 100 nM 的小干扰 RNA（siRNA）。在 37 °C 孵育 30 分钟（或根据所选修饰方法所需的相应时间）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 500 µL 培养基洗涤细胞两次。</li>
	<li>以 300 × g 离心 5 分钟，弃上清，用 10 µL 培养基重悬细胞。</li>
	<li>将两种细胞组分（潘氏细胞或 Lgr5+ 细胞）合并至总体积为 20 µL 的体系中，室温下以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>在室温下共同孵育潘氏细胞与 Lgr5+ 细胞 10 分钟。</li>
	<li>小心吸除 10 µL 上清液，保留液面弯月面，确保不吸走细胞沉淀。</li>
	<li>向细胞中加入 30 µL 重悬的基底膜基质，终体积为 40 µL，轻柔重悬细胞后接种至预热的 96 孔板中。10 分钟后，每孔加入 200 µL 完全培养基（参见 材料表）。每 48 小时更换一次培养基。</li>
	<li>在第 5 天计数类器官形成数量。</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突

ORA 方法可对肠干细胞微环境的两个关键组分，即 Lgr5+ 细胞和潘氏细胞，进行精细的功能分析。我们及他人此前已采用过该方法，并进行了细微改进6,10,11。本文中，我们将 ORA 操作流程呈现为一种可重复且标准化的实验室方案。此外，我们以 Lgr5+ 干细胞中 Apc 基因下调为例，展示了对分选后的细胞组分实施遗传学（或生物化学6）改造的可能性。综合数据显示，通过 siRNA 介导的 Apc 基因敲低可增强 Lgr5+ 细胞的干细胞功能，这体现在类器官形成数量的增加上（图 1B）。
使用肠道三维类器官培养的多个优势已在综述中列出<su...

肠上皮是哺乳动物体内更新速度最快的组织，因此成为大量研究的对象，这些研究旨在鉴定并功能表征位于Lieberkühn隐窝底部的成体干细胞，这些干细胞以表达特定标记分子为特征 Lgr5 基因且依赖于经典Wnt信号1值得注意的是， Lgr5+ 干细胞由特化的微环境细胞包围并提供支持， 即 潘氏细胞，其成熟过程也依赖于Wnt信号通路2这两种细胞共同维持肠道上皮层的自我更新，并保持每日的稳态平衡： Lgr5+ 干细胞快速分裂，产生祖细胞及更特化的肠上皮细胞；潘氏细胞提供关键的微环境因子（例如，Dll1、Wnt3、EGF）至 Lgr5+ 干细胞2肠道隐窝接种后的增殖能力 离体 形成称为类器官的有序且具有自我更新能力的结构，或 &#34;迷你肠道&#34;，已被用作一种实验工具，以深入研究正常和病理条件下（包括癌症）的自我更新和分化等过程4已从多种组织（包括小鼠和人类样本的肠道、胰腺、肝脏和肾脏）成功建立类器官培养体系。4提取方法及用于建立这些类器官培养物的生长因子具有组织特异性，旨在促进多谱系分化，并尽可能模拟原始的干细胞微环境。 体内 类器官可能具有多种应用前景，包括遗传性疾病的治疗、癌症治疗效果的评估、药物毒性的分析以及器官发生过程的研究 体外5.
总体而言，从组织样本建立类器官培养的主要局限性在于缺乏细胞特异性。例如，由完整肠隐窝建立的肠类器官无法对组织来源中包含的各个细胞组分进行单独分析。例如，整个隐窝包含 Lgr5+，潘氏细胞和前体细胞）。
本文介绍了一种称为 ORA 的新方法，该方法结合了肠道类器官培养与其最基本组分——干细胞（Lgr5+）和微环境细胞（潘氏细胞）——功能分析的优势。这一方法基于潘氏细胞与 Lgr5+ 细胞在共孵育时能够相互发生物理结合并形成类器官的独特能力2,6,10。我们利用这一特性，在让两种细胞类型重新组合形成类器官之前，分别对它们进行预处理。通过这种方式，可在类器官重建和形成之前，将每一种细胞组分单独暴露于特定药物、生长因子、生化抑制剂、基因修饰或化学处理条件下。因此，使用 ORA 检测可明确判断特定药物处理或基因修饰是否对干细胞或其对应的微环境细胞产生特异性作用。

<table><tbody><tr><td>高级DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>终浓度：10 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>终浓度：1%</td></tr><tr><td>Hepes *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>终浓度：10 mM</td></tr><tr><td>重组小鼠EGF *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>终浓度：50 ng/ml</td></tr><tr><td>重组小鼠Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>终浓度：100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>终浓度：10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>终浓度：1 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>重组小鼠R-spondin *</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>3474-RS-050</td><td>终浓度：1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Gene solution siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>终浓度：100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>低吸附离心管</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* 这些试剂的组合构成完全培养基</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ora）

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

肠上皮具有极高的更新速率。在哺乳动物中，整个上皮层可在4至5天内完成更新。成体肠干细胞位于利贝昆隐窝的底部，其特征是表达 Lgr5 基因，并通过其特征性的高增殖速率维持稳态1在整个小肠中， Lgr5+ 干细胞与一种称为潘氏细胞的特化分泌细胞相互混杂。潘氏细胞分泌抗菌化合物（即，溶菌酶和隐窝素/防御素）对肠道菌群具有调控作用。最近，潘氏细胞被发现具有新的功能，即为干细胞微环境提供支持 Lgr5+ 通过Wnt3、EGF和Dll1等多个关键配体的干细胞2.
当分离后 离体 在特定生长因子和细胞外基质成分存在下培养时，完整的肠隐窝可形成长寿且具有自我更新能力的三维结构，称为类器官，其形态高度类似于成年小肠的隐窝-绒毛上皮结构3类器官培养若由完整的隐窝建立，可用来研究肠干细胞微环境的自我更新与分化，但无法解析其各个组分（即）的各自贡献 Lgr5+ 和潘氏细胞。
本文介绍了一种新型类器官检测方法，该方法利用潘氏细胞与Lgr5+细胞在共培养条件下能够相互结合并形成类器官的特性。此方法在此称为&#34;类器官重建检测&#34;（ORA），可对潘氏细胞或Lgr5+干细胞进行遗传学和生物化学修饰，随后将其重建为类器官。因此，该方法可用于对肠干细胞微环境中的两个主要组分进行功能分析。

类器官重建实验能够分别对肠上皮中关键的微环境和干细胞组分进行功能分析，本文通过Apc基因的小干扰RNA（siRNA）对此进行了演示。
为实现这一目标，我们首先利用荧光激活细胞分选（FACS）从近交系 C57BL6/J 小鼠中分离出 8000 个 Lgr5+ 细胞和 6000 个潘氏细胞。在图 1a中展示了 ORA 检测的流程图。类器官重建能力通过将 Lgr5+ 细胞与靶向 Apc mRNA 的 siRNA 寡核苷酸或含乱序序列（SCR）的对照 siRNA 共同孵育来评估。处理后，将经相同 siRNA 处理的 Lgr5+ 细胞直接接种于类器官培养基/重建基底膜中，或与等量未经处理的潘氏细胞共孵育后再接种。作为对照，将未经处理的 Lgr...

肠道类器官培养通常由完整的隐窝建立，无法实现对自我更新和分化过程的细胞特异性分析。本方案描述了分离纯化的干细胞（Lgr5+）和微环境细胞（潘氏细胞）的重建培养，这些细胞能够形成类器官，同时允许在培养前对其进行生化和遗传修饰，并开展功能分析。

用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）

肠上皮具有极高的更新速率。在哺乳动物中，整个上皮层可在4至5天内完成更新。

类器官重建实验的总体目标是通过遗传或生化修饰潘氏细胞中Lgr5阳性的肠道干细胞微环境的两个主要组分，随后将其重建为可自我更新的类器官，从而实现对这些组分的功能分析。该方法可用于解答肠道干细胞领域中的关键特异性问题，例如干细胞和微环境细胞中的遗传或生化修饰。该技术的主要优势在于，与使用完整隐窝的其他实验方法不同，它采用分选后的干细胞和微环境细胞，从而实现对特定细胞类型的分析。该方法的视频演示至关重要，尤其是在组织解离和细胞处理步骤中。如果操作不当，这些步骤将导致细胞活力低下，特别是在流式分选后。请按照文本方案中的描述，准备所需材料，并处死一只背景为C57BL/6J的Lgr5小鼠，以此开始本实验流程。用剪刀纵向切开腹膜。用镊子夹住胃部，从此处开始，使用肠剪横向将胃切成两半。拉出肠管并将其置于含有PBS的培养皿中。首先将钝头插入胃部，并轻柔地通过幽门。接着用剪刀进行切割，同时用镊子牵拉。当整个小肠被纵向打开后，用镊子夹住小肠，在冷PBS溶液中以U形动作轻轻冲洗清洗。待所有粪便残留物清除后，将肠段置于切板上展平，黏膜面朝上。与肠外侧相比，黏膜面无血管分布，颜色较浅，易于识别。用载玻片轻轻刮拭展平的肠段，以去除绒毛。沿组织全长重复该步骤两次。然后，用无菌手术刀将小肠切成2至5毫米长的小段。将小肠片段放入含有10毫升冰上预冷的PBS的50毫升离心管中。用移液器将组织碎片在 PBS 中反复吹打，以清除残留的杂质。弃去上清液，并重复此步骤，直至 PBS 完全澄清。接着，加入 15 毫升冷 PBS，使 PBS 的最终总体积达到 25 毫升。加入 2 毫摩尔的 EDTA，在 4 摄氏度下于滚轴上孵育 45 分钟。弃去 PBS EDTA 后，加入 10 毫升 PBS，通过剧烈吹打组织碎片上下以分离隐窝。然后，收集上清液。重复此步骤四次。加入培养基，使最终体积达到 50 毫升。通过离心收集细胞沉淀。最后，将沉淀物重悬于10毫升培养基中，然后通过离心收集隐窝。对于单细胞制备，首先弃去隐窝沉淀的上清液，然后将其重悬于1毫升类胰蛋白酶溶液中，并加入50微升DNase。将细胞在32摄氏度水浴中孵育2分钟。加入 10 毫升培养基后，通过剧烈吹打至少五次将隐窝解离为单个细胞。使用 40 微米滤网过滤溶液，以去除细胞团块及其他杂质。随后，在 300 × g 离心力下离心 5 分钟，沉淀单细胞。进行流式细胞术时，每百万个细胞用一毫升含2%胎牛血清的1×Hank's平衡盐溶液重悬细胞沉淀。向细胞悬液中加入标记了Brilliant Violet 421的谱系标记抗体CD31、CD45和Ter119，工作浓度为1:100。同时加入抗CD24 APC抗体和抗CD117 PE抗体，工作浓度为1:250。30分钟后，将Lgr5阳性干细胞和潘氏细胞分别分选至低吸附离心管中。以300 × g离心5分钟。随后，将细胞重悬于100 µL培养基中，培养基成分见文本方案所述。处理细胞时，在总体积为100微升的培养基中加入5微升脂质体介导的转染试剂和浓度为100纳摩尔的小干扰RNA。将细胞在37摄氏度下孵育30分钟（小干扰RNA处理），或根据所选修饰所需的时间进行孵育。用500微升培养基洗涤细胞两次。将细胞在300 × g条件下离心5分钟后，用10 µL培养基重悬。随后，将两种细胞组分混合，总体积为20 µL，在室温下以300 × g离心5分钟。将潘氏细胞与Lgr5阳性细胞在室温下共孵育10分钟。吸取10微升上清液并保留少量液体，以避免吸到细胞沉淀。然后向细胞中加入30微升重悬的基底膜，总体积为40微升。重悬细胞后，将其接种至预热的96孔板中。10分钟后，加入200微升完全培养基。每48小时更换一次培养基。最后，在第5天计数类器官的多重性。与未处理组或乱序序列对照组相比，通过小干扰RNA介导敲低Lgr5阳性干细胞中的小鼠APC基因，可导致经典Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而显著提高类器官的出芽数量。持续性的Wnt通路激活还可消除对潘氏细胞的需求，这与先前报道结果一致。此外，这些类器官呈现为空心球状结构，与来自潘氏细胞-Lgr5阳性细胞双细胞组合所获得的类器官形态相比，这种形态是APC突变或Wnt刺激类器官中已有明确描述的表型。一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。在尝试该技术时，遵循所有步骤及孵育时间至关重要。观看本视频后，您应能充分理解如何提取肠隐窝、制备单细胞悬液，并重建微环境与干细胞以生成类器官。该技术为肠道干细胞领域的研究人员提供了研究小鼠小肠或大肠中干细胞或微环境细胞特异性作用的途径。尽管该方法已用于肠道干细胞微环境的功能分析，但也可应用于其他体细胞干细胞微环境，如乳腺或毛囊。在完成该操作后，可进一步开展实验，对类器官中的基因组或蛋白质表达进行分析，例如定量PCR（QPCR）或蛋白质印迹（Western blotting）。

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

化重构法 (的) 对肠道干细胞和小生境细胞功能分析的研究

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria...

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

本文介绍一种用于量化小肠类器官屏障完整性的技术。该方法基于活体类器官，能够以时间分辨的方式连续检测不同屏障完整性调节物质或其组合的影响。...

研究活体类器官中肠道屏障的破坏

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。...

生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

本文介绍了由人源类器官衍生的肠上皮单层细胞的制备方法，用于研究肠道屏障功能、通透性及物质转运。由于类器官能够再现原始上皮组织对外界刺激的反应，因此该模型兼具细胞系可扩增性的优势以及原代组织的相关性和复杂性。...

类器官来源的上皮单层：一种用于肠道屏障功能研究的临床相关体外模型

将活检来源的肠道类器官与器官芯片技术结合，构建出一种微生理系统平台，用以模拟特定区域的肠道功能。...

结合人类类器官与器官芯片技术模拟肠道区域特异性功能

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

在此，我们介绍一种用于生成大鼠肠道类器官并将其应用于多种下游实验的方案。大鼠常被作为首选的临床前模型，而稳定的肠道类器官系统填补了该领域对一种可靠的体外模型的需求。 体外 系统以配合 体内...

大鼠肠道类器官的生成与操作

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

学习利用分选的Lgr5+肠道干细胞和Paneth小生境细胞进行类器官重构的方法，实现细胞类型特异性功能分析。该技术支持基因或生化修饰，为干细胞微环境研究提供精确工具。

用于肠道干细胞与微环境细胞功能分析的类器官重建实验（ORA）

探索更多视频