非人类灵长类动物遗传学的大体积、行为相关光照

该方案的总体目标是创建一个非常适合非人灵长类动物光遗传学作的大体积组织照明器。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如不同大脑区域中的神经元群如何影响行为，以及一个区域中的时间特异性神经元放电模式如何影响另一个区域？该技术的主要优点是它使用光，因此允许以最小的组织损伤对大的行为相关脑体积进行光遗传学作。

由于人类和非人类灵长类动物大脑之间的相似性，这项技术的影响延伸到转化医学。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为在拉动这些纤维时需要一些练习才能施加适当的压力。要开始此过程，请使用一对锋利的剪刀切割一段直径为 250 微米的塑料光纤，该光纤至少比所需的照明器总长度长 10 厘米。

接下来，使用 15 号剥线钳从塑料光纤的一端取下 20 到 22 厘米的聚乙烯护套。然后，将光纤剥去端最远端的 3 到 5 厘米固定在台虎钳中。用一只手拉紧光纤的夹套端，持续稳定地拉动。

纤维应与地板平行，从台虎钳上拉开。在整个加热和冷却过程中保持纤维上的这种恒定张力，以便纤维在变薄时保持笔直和绷紧。使用双温热风枪的最低设置，加热纤维的剥离部分，直到它变细到 60 到 100 微米的直径，或大约是人类头发的直径。

保持纤维上的恒定张力，同时让其冷却。未能保持张力或纤维过热可能会导致纤维卷曲和/或断裂。为了帮助在加热纤维时保持纤维的恒定张力，请使用非惯用手，这样在使用热风枪时就不必松手。

此外，您可以轻轻地将纤维缠绕在手掌上，以获得更好的抓地力。纤维完全冷却并达到所需的直径后，从两侧最窄的点捏住纤维 3 厘米。沿着纤维的轴线快速猛烈地拉动，将两侧分开，形成一个锥形尖端。

然后，在解剖显微镜下以低倍检查锥形尖端。如果尖端是分叉或卷曲的，请丢弃纤维。即使经过大量练习，大约三分之一的纤维尖端也会有分叉或卷曲。

我们只是丢弃这些纤维，而不是尝试修复它们，因为拔掉另一根纤维既快速又便宜。通过在尖端末端附近放置一块实验室胶带，准备蚀刻锥形尖端，使所需的尖端长度暴露在外。在这里，最后 5 毫米被暴露出来。

该胶带可保护光纤免受超过所需光发射长度的蚀刻。之后，在拇指和食指之间折叠一个小方块的 5 微米碳化硅研磨片。将纤维的尖端放在研磨板的两侧之间，然后以小圆周运动轻轻蚀刻纤维。

经常旋转光纤，使所有侧面都均匀蚀刻。接下来，使用 22 号剥线钳从照明器的另一端去除约 5 毫米的聚乙烯护套。然后，用热刀将另一端切平以使表面光滑。

照明器的末端与蚀刻尖端相对的地方贴上一个连接器。这允许照明器连接到电缆或激光器。然后，用连续更细的研磨片将另一端平整。

随后，将平坦的另一端插入内径为 260 微米的不锈钢密封垫圈中，直到它与密封垫圈的末端齐平。目视确认另一端用光纤显微镜平滑均匀地抛光。将密封垫圈垂直贴在桌子的边缘，使密封垫圈的较小开口朝下。

然后，用塑料环氧树脂填充 1 毫升注射器，并将 18 号钝针头连接到注射器上。然后，用针头将环氧树脂向下涂抹到密封垫圈中。用环氧树脂完全填充套圈。

将光纤插入密封垫圈，使其与密封垫圈底部齐平。如果需要，在干燥前用湿的无绒布擦去纤维抛光表面多余的环氧树脂。在此步骤中，在每次测试之前准备一个塔式微型驱动器。

然后将带有斜面尖端的 25 号导管固定在驱动器的下部夹具上。将大容量照明器固定在同一驱动器的上夹具中。该夹具安装在驱动电机上。

然后，将大容量照明器完全穿过导管，并确认照明器的尖端伸过导管的尖端。或者，可以将实验室胶带贴在光纤上，以便夹住胶带而不是光纤本身，以保护光纤。接下来，将导管和照明器浸泡在消毒液中进行消毒。

在洁净腔内放置一个孔径为 1 毫米的定制灭菌网格，并用腔室侧面的螺钉将其固定在预先指定的方向。使用无菌钝钳将照明器向上拉，从导管中收回消毒的照明器。照明器的尖端应高于导管尖端 5 到 10 毫米。

将微型驱动器固定在支架上，并将导管放入目标网格孔中。然后，降低微驱动载物台，直到导管刚好穿过硬脑膜的水平。同时，用无菌镊子手动降低照明器。

如果有任何阻力，请将照明器缩回 5 到 10 毫米，等待 10 分钟，然后重试。如果第二次尝试时仍有阻力，请将照明器尖端缩回导管中，将导管降低 0.25 毫米，然后重试。将照明器另一端的套圈连接到较大的光学装置或激光器。

该图显示，误差率随着光照的增加而显著增加。这里的栅格图显示了跨越 2.5 毫米厚的皮层的神经元的抑制。局部场势显示了跨度为 4.5 毫米的光伪像。

一旦掌握，就可以在 10 到 15 分钟内使用这种技术构建一个大容量照明器，再加上环氧树脂干燥时间。校准会再增加半小时左右，因此为了最大限度地提高效率，我们通常会一次制作多个照明器。在参加此程序时，重要的是要记住许多照明器不符合质量控制标准。

没关系。如果它们未通过尖端检查，我们会丢弃它们。但是，如果它们未通过校准，我们通常会重新校准并重复校准。

开发后，这项技术为神经科学领域的研究人员使用光遗传学抑制神经元放电和调节非人类灵长类动物的行为铺平了道路。看完这个视频后，您应该对如何构建大容量组织照明器有很好的了解。