Name: 非人类灵长类动物遗传学的大体积、行为相关光照 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学习构建大体积组织照明器用于非人灵长类动物光遗传学研究。该方法利用光纤技术实现大体积脑区光照，同时最大限度减少组织损伤，为神经科学与转化医学研究提供重要工具。

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LCA 承认获得 NDSEG 研究金、NSF GRFP 以及 McGovern 研究所之友的资助。EP 承认获得 Harry 和 Eunice Nohara UROP 基金、麻省理工学院 1995 届班级 UROP 基金以及麻省理工学院 UROP 基金的资助。ESB 承认获得 NIH 2R44NS070453-03A1、IET Harvey 奖以及纽约干细胞基金会-Robertson 奖的资助。RD 承认获得 NIH EY017292 的资助。Michael Williams 在拍摄前协助团队组织和收集实验用品。

注意：所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并经麻省理工学院动物护理委员会批准。
1. 照明器的制备
<ol>
	<li>使用一把锋利的剪刀剪取一段直径为 250 µm 的塑料光纤，其长度应比所需照明装置总长度至少长 10 cm。</li>
	<li>使用 22 号剥线钳从塑料光纤一端去除 15 - 20 cm 的聚乙烯护套。</li>
	<li>将已剥除护套端的远端 3 - 5 cm 牢固地夹紧在台钳中。</li>
	<li>用一只手拉紧光纤的带护套端，保持恒定且稳定的拉力。光纤应与地面平行，并与台钳垂直。在整个加热和冷却过程（如下步骤 1.5 和 1.6）中保持此恒定张力，以确保光纤在变细过程中保持笔直和紧绷。</li>
	<li>使用双温热风枪的最低档（570/1,000 °F），加热光纤的剥除部分，直至其直径变细至 60 - 100 μm，或约相当于人类毛发的直径。</li>
	<li>在光纤冷却过程中继续保持恒定张力。若未能维持张力，可能导致光纤卷曲。</li>
	<li>在解剖显微镜下确认变细端的直径。也可选择使用卡尺进行测量。
	<ol>
		<li>如果光纤不够细，可根据需要重复步骤 1.4 至 1.6，以达到所需的尖端直径。</li>
		<li>若需重新拉制，可选操作：在光纤最细处做一小标记，以便再次加热时热风枪中心能对准最细部位。</li>
		<li>如果光纤过细，则需重新开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>待光纤完全冷却并达到所需直径后，在距最细点两侧各 3 cm 处捏住光纤。沿光纤轴向迅速而有力地拉断，形成锥形尖端。</li>
	<li>在低倍（例如，4X）解剖显微镜下检查锥形尖端。若尖端分叉或卷曲（图 1f），则弃用该光纤。</li>
	<li>准备蚀刻锥形尖端：在尖端附近贴上一小段实验室胶带，使末端最后 5 mm 暴露出来。胶带可保护光纤在所需发光长度以上的部分不被蚀刻。该尖端长度的选择基于目标区域灵长类动物皮层的厚度。根据所需照明长度，可暴露更长或更短的长度。如需不同的蚀刻尖端长度，可将胶带边缘向锥形尖端靠近或远离调整。</li>
	<li>将一小块（约 1 英寸 × 2 英寸）5 μm 碳化硅研磨片用拇指和食指折叠成夹层状。将光纤尖端置于研磨片两层之间，以类似在拇指和食指间滚动弹珠的小幅圆周运动轻轻蚀刻光纤。频繁旋转光纤，使各侧面均匀蚀刻。蚀刻区域肉眼观察呈“粗糙”状，而未蚀刻区域通常光滑。</li>
	<li>使用 3 μm 氧化铝研磨片重复步骤 1.11。</li>
	<li>在照明装置的另一端（即非蚀刻尖端端）安装连接器。这使得照明装置可连接至光纤跳线或激光器。 
	注意：该方法不同于固定玻璃/石英光纤于插针中的常用方法。由于金属插针比塑料光纤更硬，在粘合后对光纤与插针整体进行抛光可能会损伤塑料光纤，因为在抛光过程中产生的微小金属碎片可能嵌入端面平整切割的光纤中。
	<ol>
		<li>使用 22 号剥线钳从照明装置另一端去除约 5 mm 的聚乙烯护套。</li>
		<li>用热刀将另一端切平，以使表面光滑。</li>
		<li>依次使用更细的研磨片对该端进行平面抛光：5 µm、3 μm、1 μm 和 0.3 µm。</li>
		<li>将平整的另一端插入内径为 260 µm 的不锈钢插针中，直至其与插针端面齐平。</li>
		<li>使用光纤显微镜目视确认该端已光滑且均匀抛光。</li>
		<li>将光纤从插针中取出，并用胶带将插针垂直固定在桌边，使光纤朝下。</li>
		<li>用 1 mL 注射器吸取塑料环氧树脂，并在注射器上安装一根钝头 18 号针头。</li>
		<li>用针头将环氧树脂注入插针内部，完全填满插针。</li>
		<li>将光纤重新插入插针中。</li>
		<li>如有需要，在干燥前用湿润的无尘布擦拭光纤抛光面上多余的环氧树脂。否则，可在 12 - 24 小时后去除多余环氧树脂。</li>
		<li>轻柔存放光纤直至校准，并在插针上戴上防尘帽。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 照明器校准与质量控制
注意：这些校准方法用于评估光纤尖端在不同距离处的光输出非线性情况。不均匀的光分布通常由“不平整”或“波浪状”的锥形部分引起。
<ol>
	<li>使用吸光箔为积分球顶部制作一个遮光光阑（图2）。 
	注意： 每次操作吸光箔时均应佩戴手套，以防止皮肤油脂造成反光污迹。
	<ol>
		<li>将一块2英寸×4英寸的吸光箔对折，形成一个2英寸×2英寸的正方形。&#160;另一种方法是裁剪出一个2英寸×2英寸的正方形，其中一侧为吸光面，另一侧为反光面（即标准铝箔面）；但翻折法更安全，因为在下一步操作中可提供较钝的边缘以便于手持光阑。&#160;</li>
		<li>用实验室胶带或电工胶带沿正方形边缘折叠，以固定未折叠的两边。这既能将两侧粘合在一起，又能防止被锋利边缘划伤。</li>
		<li>使用26号针头在正方形中心穿刺一个小孔。</li>
		<li>从积分球上取下大螺钉盖，并用光阑覆盖开口，将小孔对准中心位置。如果光阑具有一面吸光、一面反光的结构，则应将吸光面朝上，反光面朝下，面向积分球内部。 
		注意： 为防止灰尘和碎屑进入积分球，并确保小孔居中，应用实验室胶带将光阑固定在积分球外侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用显微操作器或立体定位臂与积分球，以500 µm为增量，沿光纤尖端测量光输出。 
	注意： 激光开启时，应佩戴适用于相应波长的安全护目镜。
	<ol>
		<li>将光纤另一端连接至激光器或光源，但暂不启动光输出。</li>
		<li>将照明装置固定在立体定位支架上（建议使用实验室胶带），使其尖端位于支架底部下方7–10 mm处。</li>
		<li>将立体定位支架旋入立体定位臂中。</li>
		<li>将照明装置的尖端与光阑中心的小孔对齐。当尖端与光阑处于同一水平面时，将显微操作器归零。</li>
		<li>关闭室内灯光，并对积分球进行归零校准。</li>
		<li>启动激光器（或其他光源），使用积分球测量总光功率输出。 
		注意： 校准测试时应使用尽可能低的光输出。</li>
		<li>将光纤向下移动500 µm进入积分球，并重复步骤2.2.6。</li>
		<li>继续以500 µm为增量将光纤逐步下移并测量总光输出，直至总光功率趋于稳定。 
		警告： 当整个光纤尖端完全进入积分球后，总光功率应趋于平稳。切勿将光纤继续下移超过刻蚀尖端长度1–2 mm以上。若尖端接触积分球底部，可能导致其熔化和/或损坏积分球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过绘制总光功率输出随光纤进入积分球深度的变化曲线，验证光纤刻蚀是否均匀，确认其呈线性关系。</li>
</ol>
3. 体内 光照
注意： 此处这些方法使用塑料模型演示，而非非人灵长类动物。
<ol>
	<li>在实验前，将一个直径为25 mm的记录 chamber 植入目标脑区上方。</li>
	<li>在实验前进行解剖磁共振成像（MRI）。将定制的记录网格置入腔室，并填充无菌外科润滑剂，以利于观察网格并确定硬脑膜及目标脑结构的水平位置。</li>
	<li>每次测试前准备一个微型驱动装置。
	<ol>
		<li>将一根带斜面尖端的25号导引管固定在驱动装置的中段和下段夹具上。使用两个夹具可确保导引管保持平直。如有需要，这两个夹具均可手动移动。 
		注意： 导管可通过环氧树脂粘合或焊接固定在夹具上。</li>
		<li>将大容量照明器固定在同一驱动装置上方的夹具中。该夹具连接在驱动电机上。</li>
		<li>将大容量照明器完全穿过导引管，并确认照明器的尖端超出导引管的尖端。 
		注意： 照明器超出导管尖端的长度应等于从硬脑膜到目标脑区下缘的距离，该距离由测定确定 通过 磁共振成像</li>
		<li>将导管和照明器浸泡在消毒液中（例如，氯己定）进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将定制的灭菌网格放入洁净室中，并用腔室侧面的螺丝将其固定在预设方向。此处所示网格的间距为1 mm；但可根据需要定制间距。 
	注意： 这应与解剖 MRI 中使用的网格和方向完全相同。</li>
	<li>将立体定位微驱动器支架以预先确定的方向固定在记录室中。</li>
	<li>使用无菌钝头镊子向上牵拉无菌光源，将其从导管中撤出。光源尖端应位于导管尖端上方5 - 10 mm处。 
	注意： 照明器在导管与夹具之间会向外弯曲。这不会损坏柔性照明器。</li>
	<li>将微型驱动器固定在支架上，并将导管插入目标网格孔中。</li>
	<li>降低微驱动装置，直至导管刚好穿过硬脑膜层面。 
	注意： 如有需要，可将第二个带有电极的微型驱动装置放置于载物台上，并插入另一网格孔中。该电极记录的局部场电位将显示与距离相关的光伪迹，可用于确认照明器的位置。</li>
	<li>使用无菌镊子手动降低照明器。
	<ol>
		<li>如果遇到任何阻力，将照明器回撤5 - 10 mm，等待10分钟使组织稳定，然后再次尝试。</li>
		<li>如果第二次尝试时仍有阻力，将照明器头端缩回引导管内，将引导管下调0.25 mm，然后再次尝试。</li>
		<li>重复操作，直至照明光源在导管内滑动无任何阻力。</li>
		<li>降低照明器，直至其绷紧。 
		注意： 切勿用力将照明探头推向阻力处。此时，导引管通常尚未完全穿透硬脑膜。强行推进光纤会导致其自身弯曲，从而阻碍光纤进入脑组织，并可能损坏光纤尖端。图1g).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将照明器另一端的卡套连接到更大的光学装置或激光器上。</li>
	<li>确保非人灵长类动物无法看到任何光线。
	<ol>
		<li>使用遮光屏蔽罩或吸光箔完全包裹记录塔。</li>
		<li>将所有光学连接置于由吸光箔制成的屏蔽袋中。</li>
		<li>使用吸光铝箔或黑色电工胶带屏蔽所有光纤跳线。</li>
		<li>作为额外的预防措施，在非人灵长类动物后方放置一组与实验中所用光色相同的诱饵发光二极管（LED）阵列，并以2.5 Hz的频率持续闪烁。这可以防止眼睛完全适应黑暗环境。如果发生意外的光线泄漏，这种闪烁光有助于避免泄漏光成为行为触发因素。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Hum+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Front Hum Neurosci. 3, 31(2009).</li>
<li>Tamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glass-coated+tungsten+microelectrode+enclosing+optical+fibers+for+optogenetic+exploration+in+primate+deep+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">A glass-coated tungsten microelectrode enclosing optical fibers for optogenetic exploration in primate deep brain structures.</a> J Neurosci Meth. 211 (1), 49-57 (2012).</li>
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<li>Acker, L., Pino, E. N., Boyden, E. S., Desimone, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEF+inactivation+with+improved+optogenetic+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">FEF inactivation with improved optogenetic methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 7297-7306 (2016).</li>
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<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
<li>Ohayon, S., Grimaldi, P., Schweers, N., Tsao, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccade+modulation+by+optical+and+electrical+stimulation+in+the+macaque+frontal+eye+field%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccade modulation by optical and electrical stimulation in the macaque frontal eye field.</a> J Neurosci. 33 (42), 16684-16697 (2013).</li>
<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

尽管光遗传学工具已广泛用于研究啮齿类动物的疾病和生理功能，但由于技术上难以照亮较大的脑区体积，光遗传学在非人灵长类动物中的应用受到限制。早期在猴子中开展的研究使用了较高的光功率密度（约100 mW/mm2 至 20 W/mm2）来照射较小的脑区体积，可能&#60; 1 mm3，并报告了在大脑皮层表达兴奋性视蛋白4,9,10,11以及在上丘表达抑制性视蛋白12时产生较微弱的行为效应。
因此，开发了一种大体积照明装置，以实现对大体积组织的光传递。利用该照明装置和红移型卤视紫红质Jaws，已在非人灵长类动物中观察到显著的光遗传学驱动行为8。
<p class="jov...

光遗传学工具能够以毫秒级精度实现光驱动的神经元控制，被广泛用于研究啮齿类和无脊椎动物的功能生理学与行为。然而，技术上的挑战限制了光遗传学在非人灵长类动物大脑中的应用，其脑体积约为啮齿类动物大脑的100倍1。
为了促进非人灵长类动物中的光遗传学研究，设计了一种照明装置，以解决两个相互矛盾的目标：大体积照明与最小化穿刺损伤。以往尝试解决其中一个问题时，往往以牺牲另一个目标为代价。光纤束能够照亮更大的体积，但其直径较大，因而造成更大的损伤2,3。锥形玻璃光纤可减少穿刺损伤，但会将光聚焦于极小的发光表面积（&#60;100 µm2），从而限制照明范围4,5。通过硬脑膜上的窗口进行外部脑组织照明可避免穿刺损伤问题，并可能实现大体积照明，但该方法仅适用于少数表层脑区6。
要制作一个大容量、小直径的照明器（图1a），塑料光纤尖端经热拉锥处理，并对纤芯和包层进行刻蚀（图1b，c）。与其他将光聚焦到一个狭窄点的锥形光纤不同，这种刻蚀技术使光能够均匀地从尖端侧面逸出，从而在较大区域内广泛分布光线（图1d，e）。由于穿透损伤与穿透直径成正比，该照明器的穿透损伤不高于传统光纤，但其具有 &#62;比发光表面积大100倍，并在脑模体（1.75%琼脂糖）中以1/100的光功率密度实现更广泛的光照射图1e). 蒙特卡罗模型（图1f)展示了在发光表面光功率密度相等的情况下，传统光纤与大体积照明器之间光扩散范围的差异。每个照明器均使用积分球进行单独校准（图2a，b）确保尖端的光照分布均匀（图 2c).
这种大体积照明装置已在非人灵长类动物中通过光遗传学手段调控行为和神经元放电活动方面得到验证。光纤尖端长度可根据不同脑区以及每只动物个体化的感受野图谱进行定制。该照明装置可与穿透式电极配合使用，实现覆盖整个照明区域的神经元记录。此外，由于光纤可传导任意可见光颜色，因此可与目前可用的任何光遗传学分子配合使用。

<table><tbody><tr><td>塑料光纤</td><td>Industrial fiber optics</td><td>SK-10</td><td>250 微米直径，Super Eska 系列</td></tr><tr><td>剥线钳</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td><td>22 号规格</td></tr><tr><td>台虎钳夹具</td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>通用台式安装虎钳夹具</td></tr><tr><td>双温加热枪</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &amp;deg;F</td></tr><tr><td>实验室标记笔</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>立体显微镜，配备双白炽光源，2X/4X 放大倍数，可从 VWR 购得</td></tr><tr><td>实验室胶带</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>紫色，4 卷装；但胶带颜色无特殊要求</td></tr><tr><td>碳化硅研磨片</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>5 微米粒径，10 片装</td></tr><tr><td>氧化铝研磨片</td><td>ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>3 微米粒径，10 片装</td></tr><tr><td>氧化铝研磨&amp;nbsp;片</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>1 微米粒径，10 片装</td></tr><tr><td>煅烧氧化铝研磨片</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>0.3 微米粒径，10 片装</td></tr><tr><td>热切割刀</td><td>Industrial fiber optics</td><td>IF370012</td><td>60 瓦，重型</td></tr><tr><td>光纤检测镜</td><td>ThorLabs</td><td>FS201</td><td>可选</td></tr><tr><td>不锈钢套管</td><td>Precision fiber optics</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>内径 265 微米</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>建议使用鲁尔锁接头以降低泄漏风险，但非必需</td></tr><tr><td>塑料环氧树脂</td><td>Industrial fiber optics</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>18 号钝头针</td><td>BD</td><td>305180</td><td>长度 1.5 英寸</td></tr><tr><td>无尘擦拭纸（KimWipe）</td><td>ThorLabs</td><td>KW32</td><td>可从多家供应商处获得</td></tr><tr><td>吸光箔</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>电工胶带</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>可选，可用其他品牌/型号替代</td></tr><tr><td>26 号锐头针&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>长度 0.5 英寸</td></tr><tr><td>微操纵器</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>可用其他品牌/型号替代</td></tr><tr><td>立体定位臂</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>可用其他品牌/型号替代</td></tr><tr><td>激光防护眼镜</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>必须根据所用激光的颜色选择，此处为示例</td></tr><tr><td>激光器或其他光源</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>蓝色激光示例</td></tr><tr><td>积分球</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>附带功率计，也可从 ThorLabs 购得，货号 PM100D</td></tr><tr><td>Ultem 记录室</td><td>Crist 仪器公司</td><td>6-ICO-J0</td><td>定制带对齐槽</td></tr><tr><td>带夹具的塔式微驱动器</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>导管</td><td>定制</td><td>N/A</td><td>由 25 号脊髓穿刺针（BD）或钝头管制成</td></tr><tr><td>NAN 驱动系统</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>定制网格设计</td><td>定制</td><td>定制</td><td>设计图纸可应要求提供</td></tr><tr><td>钝头镊子</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>通用不锈钢钝头镊子</td></tr><tr><td>数字卡尺</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>可在 amazon.com 上购买。可选择更高分辨率的卡尺以获得更精确的测量。</td></tr><tr><td>跳线电缆</td><td>ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>这是众多可能跳线电缆中的一个示例。只要光纤直径小于或等于大体积照明器的光纤直径，并且连接器接口匹配，任何跳线电缆（玻璃或塑料，厂商购买或实验室自制）均可用于此应用。</td></tr><tr><td>透明塑料防尘帽</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>25 个装</td></tr><tr><td>陶瓷分体对接套管</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

非人灵长类动物光遗传学中大体积、行为相关照明技术

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

本方案描述了一种大体积照明器，该照明器专为非人灵长类动物大脑中的光遗传学操作而开发。该照明器是一种带有蚀刻尖端的改良塑料光纤，其发光表面积是传统光纤的&#62;100倍以上。除介绍大体积照明器的构建方法外，本方案还详细说明了用于确保光分布均匀的质量控制校准流程。此外，本方案还描述了插入和取出大体积照明器的技术。该照明器可用于照射浅层和深层脑结构。大体积照明器无需与电极物理耦合，且由于其材质为塑料而非玻璃，在传统光学纤维易碎裂的情况下，它只会发生弯曲。该照明器可在行为学相关组织体积（≈ 10 mm3）范围内递送光照，且造成的穿入损伤不高于传统光学纤维，因而促进了在非人灵长类动物中开展基于光遗传学的行为学研究。

在非人灵长类动物中对大脑大范围区域进行照明，可实现与行为相关的光遗传学操控。Acker et al. (2016) 将这种大体积照明装置与红移型卤视紫红质蛋白 Jaws 7 结合使用，研究了额叶眼动区（FEF）在两只恒河猴执行记忆引导性眼跳任务时的时间作用。具体而言，研究人员向 FEF 神经元注射了携带 Jaws 的病毒载体，随后在记忆引导性眼跳任务的目标呈现期、延迟期或运动准备期，利用大体积照明装置以红光进行照射8。图3展示了实验条件。当目标位于被注射区域的感受野内时，照射显著增加了错误率（例如，未能准确执行指向正确目标位置的记忆引导性眼跳），而当目标位于失活/照射位点对侧时，错误率未见显著变化（图4a）。
除了光遗传学诱导的行为变化外，大体积照明器还能在整个2.5 mm范围的皮层上实现神经元失活（<strong class="xf...

本文介绍了一种构建组织穿透式照明装置的方案，该装置可实现大范围体积的光递送，同时具有最小的直径。

本方案描述了一种大体积照明装置，该装置是为非人灵长类动物脑部的光遗传学操作而开发的。该照明装置是一个……

本方案的总体目标是构建一种适用于非人灵长类动物光遗传学操作的大体积组织照明装置。该方法有助于回答神经科学领域的一些关键问题，例如，不同脑区的神经元群体如何参与行为调控，以及某一脑区中具有时间特异性的神经元放电模式如何影响其他脑区？该技术的主要优势在于其使用光作为刺激手段，因此能够在造成最小组织损伤的情况下，对与行为相关的大范围脑区进行光遗传学操控。由于人类与非人灵长类动物大脑之间的相似性，该技术的应用前景可延伸至转化医学领域。通常，初次接触此方法的研究人员会遇到困难，因为在牵拉这些光纤时需要经过一定练习才能掌握适当的压力。开始此操作时，使用一把锋利的剪刀切割一段直径为250 µm的塑料光纤，其长度应比所需的照明装置总长度至少长10 cm。接下来，使用22号电线剥线钳从塑料光纤一端去除15至20厘米的聚乙烯护套。然后，将光纤剥除护套端最远端的3至5厘米固定在台式台钳中。用一只手握住光纤的带护套端，并保持恒定且稳定的拉力。光纤应与地面平行，并从夹具上拉离。在整个加热和冷却过程中，需保持光纤处于恒定张力状态，以确保光纤在变细过程中保持笔直和紧绷。使用双温热风枪的最低档位，加热光纤的去涂覆部分，直至其变细至直径60至100微米，或约相当于人类头发的直径。在让光纤冷却的同时，保持其张力恒定。若未能保持张力或对光纤过热，可能导致光纤卷曲和/或断裂。为在加热过程中帮助维持光纤的恒定张力，建议使用非惯用手操作，以便在使用热风枪时无需松手。此外，可将光纤轻轻缠绕在手掌上以获得更稳固的握持。待光纤完全冷却并达到所需直径后，从两侧最细处向外3厘米处捏住光纤。沿光纤轴向迅速而有力地拉扯，使两侧分离，形成锥形尖端。然后，在解剖显微镜下用低倍镜观察拉细的尖端。如果尖端分叉或弯曲，则丢弃该光纤。即使经过大量练习，大约三分之一的光纤尖端仍会出现分叉或弯曲的情况。我们直接丢弃这些光纤，而不是尝试修复它们，因为重新拉制一根新的光纤非常快速且成本低廉。通过在光纤尖端末端附近贴上一片实验室胶带，使所需长度的尖端暴露出来，以准备刻蚀锥形尖端。此处暴露了最后五毫米。胶带可保护光纤在预期发光长度以上的部分免受刻蚀。随后，将一小片五微米碳化硅研磨片对折成小方块，夹在拇指与食指之间。将光纤末端置于研磨片的两层之间，用轻微的环形运动轻轻刻蚀光纤。频繁旋转光纤，使所有侧面均匀蚀刻。接着，使用22号剥线钳从照明器另一端去除约五毫米的聚乙烯护套。然后，用热刀将另一端切平，以使表面光滑。将连接器固定在照明器末端，远离刻蚀尖端的一端。这使得照明器能够连接到光纤或激光器。随后，使用粒度逐渐增细的研磨片将另一端抛光至平整。随后，将扁平的另一端插入内径为260微米的不锈钢卡套，直至与卡套末端齐平。使用光纤显微镜目视确认另一端已光滑且均匀地抛光。将卡套垂直粘贴在桌边，使卡套较小的开口端朝下。然后，用1 mL注射器吸取塑料环氧树脂，并在注射器上安装一根钝头18号针头。接着，使用针头将环氧树脂注入套管内部，确保完全填满套管。将光纤插入套管中，使其与套管底部齐平。如有需要，在干燥前用沾湿的无尘布擦拭光纤抛光面上多余的环氧树脂。在此步骤中，每次测试前需准备一个塔式微驱动装置。然后将带有斜面尖端的25号导引管固定在驱动器下方的夹具上。将大容量照明器固定在同一个驱动器上方的夹具中。该夹具连接至驱动电机。随后，将大容量照明装置完全穿入导管中，并确认照明装置的尖端伸出导管尖端。或者，可在光纤上缠绕实验室胶带，使夹紧部位为胶带而非光纤本身，以保护光纤。接下来，将导管和照明装置浸入消毒液中进行消毒。在洁净室内部放置一个已定制灭菌、孔距为1毫米的网格，并通过腔室侧面的螺丝将其固定在预设方向上。使用无菌钝头镊子向上拉动照明装置，将其从导管中撤出。照明装置的尖端应位于导管尖端上方5至10毫米处。将微型驱动装置固定到支架上，并将导管插入目标网格孔中。然后，降低微驱动装置的阶段，直到导管刚好穿过硬脑膜层面。同时，使用无菌镊子手动降低照明器。如果存在任何阻力，将照明器回撤5至10毫米，等待10分钟，然后再次尝试。如果第二次尝试时仍有阻力，将照明器尖端完全回撤至导引管内，将导引管下调0.25毫米，再重新尝试。将照明器另一端的卡箍连接至更大的光学装置或激光器上。该图显示，随着光照强度的增加，错误率显著上升。此处的点阵图显示了跨越皮层2.5毫米厚度的神经元抑制情况。局部场电位则显示出跨越4.5毫米的光伪迹。一旦掌握，使用该技术构建大体积照明装置仅需 10 到 15 分钟，另需加上环氧树脂干燥时间。校准还需额外约半小时，因此为了最大化效率，我们通常会一次性制作多个照明装置。在执行该操作过程中，需要注意的是，许多照明装置可能无法达到质量控制标准。没关系。如果它们未能通过针尖检查，我们会将其丢弃；但如果校准失败，我们通常会重新抛光并重复校准过程。该技术开发后，为神经科学领域的研究人员利用光遗传学抑制非人灵长类动物的神经元放电并调控其行为铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建大体积组织照明装置。

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