Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Sander Bekeschus; Anke Schmidt; Felix Niessner; Torsten Gerling; Klaus-Dieter Weltmann; Kristian Wende

doi:10.3791/56331

JoVE Journal
Environment

This content is Free Access.

JoVE Journal Environment

Basic Research in Plasma Medicine – A Throughput Approach from Liquids to Cells

等离子体医学基础研究--从液体到细胞的吞吐量方法

Full Text

13,460 Views

07:37 min

November 17, 2017

DOI: 10.3791/56331-v

Sander Bekeschus¹, Anke Schmidt¹, Felix Niessner¹, Torsten Gerling¹, Klaus-Dieter Weltmann¹, Kristian Wende¹

¹ZIK plasmatis,Leibniz-Institute for Plasma Science and Technology

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This article presents a high-throughput protocol for cold physical plasma treatment of liquids and cells, focusing on the effects of plasma on biological responses in vitro. The study utilizes optical emissions spectroscopy and various assays to analyze cellular activity post-treatment.

Key Study Components

Area of Science

Plasma medicine
Cellular biology
Biochemical analysis

Background

Cold physical plasma has potential applications in medicine, particularly in cancer treatment.
Understanding plasma-derived species is crucial for inducing immunogenic cell death.
The study aims to enhance the efficiency of plasma treatment protocols.
Previous research has shown varying effects of plasma on different biological systems.

Purpose of Study

To investigate the effects of cold physical plasma on oxidants and biological responses.
To develop a semi-automated approach using multi-well plates for increased productivity.
To identify plasma-derived species relevant to biological responses.

Methods Used

Optical emissions spectroscopy for monitoring plasma species.
96 well plates for high-throughput analysis of cellular responses.
Flow cytometry for assessing cell viability and immunogenic markers.
Fluorescence measurements to evaluate metabolic activity post-treatment.

Main Results

Plasma treatment significantly affects superoxide production and cell viability.
Different feed gas compositions yield varying results in plasma-derived species.
Fluorescence intensity correlates with cytotoxic effects observed in treated cells.
Shorter plasma exposure times can enhance calreticulin expression in melanoma cells.

Conclusions

The developed protocol allows for rapid assessment of plasma effects on cells.
Findings contribute to the understanding of plasma's role in cancer therapy.
Future research can explore co-culture systems and immune responses to plasma-treated cells.

Frequently Asked Questions

What is cold physical plasma?

Cold physical plasma is a partially ionized gas that can interact with biological tissues, potentially inducing therapeutic effects.

How does plasma treatment affect cancer cells?

Plasma treatment can induce immunogenic cell death and alter metabolic responses in cancer cells, enhancing their susceptibility to therapies.

What methods are used to analyze plasma effects?

Methods include optical emissions spectroscopy, flow cytometry, and fluorescence assays to assess cellular activity and viability.

Can this technique be applied to other types of cells?

Yes, the protocol can be adapted for various cell types to study the effects of plasma treatment.

What are the implications of this research?

This research may lead to advancements in plasma therapies for dermatology and oncology, improving treatment outcomes.

一个高通量的冷物理等离子体处理协议的液体和细胞显示。它包括设置不同的等离子体点火用气体成分, 测量等离子体的发射光谱, 以及随后对等离子体处理后的液体和细胞活性进行分析。

这些基于多孔的序列测定的总体目标是更好地了解冷物理等离子体对氧化剂对体外生物反应的影响，使用发射光谱、液体分析和细胞活性、显微镜和流式细胞术测定。这种方法可以帮助回答血浆医学领域的关键问题，特别是关于血浆衍生的指令物种，这对诱导免疫原性癌细胞死亡很重要。这种技术的主要优点是它的半自动化方法。

它使用 96 孔板来提高研究的速度和生产力。这项技术的影响延伸到未来的血浆疗法，例如皮肤病学或肿瘤学。而且，因为它们提供了识别与生物反应相关的血浆衍生指令物种的方法。

演示该程序的是我们实验室的技术人员 Felix Niessner。对于等离子体种类监测，将大气等离子体射流放置在发射分光光度计前面，垂直于羽流轴，并使用专用软件以每分钟 2 标准升的原料气通量记录每种气体条件的光发射和波长。对于等离子体处理的超氧化物分析，为 XYZ 表设置最终方案，并相应地调整处理时间和孔位置。

然后，将 100 微升新鲜制备的预混液加入透明、平底 96 孔板的孔中，一式三份，并使用微孔板读数器测量 550 纳米处的吸光度。为了分析血浆处理对细胞代谢反应的影响，在层流罩中，将 10 乘以 10 的剂量接种到四个感兴趣的细胞中，每孔，在平底 96 孔板中，放入 10 微升完全补充的细胞培养基中，并孵育过夜。在细胞培养箱中培养过夜后，根据实验分析，使用 XYZ 表单独用血浆或气体处理孔，然后将细胞放回培养箱中再放置 20 小时。

在第二次孵育结束时，向细胞中加入 25 微升新鲜细胞培养基，并补充有 500 微摩尔刃天青，以及三个仅背景对照刃天青的孔中。将细胞放回培养箱中，孵育 3 小时。然后，在微孔板读数器中测量荧光。

对于血浆处理过的细胞的成像，在读取荧光后，用 100 微升新鲜细胞培养基代替上清液，每毫升补充 1 微克碘化丙啶。将板放在电动显微镜载物台上，然后选择 20 倍物镜对细胞进行成像。然后，使用适当的定量图像分析软件来确定数字相差图像中每个孔中成像的所有视野的总胞质面积。

对于血浆处理细胞的流式细胞术分析，成像后，用 200 微升 PBS 洗涤每个孔中的细胞两次，每次洗涤补充钙和镁，然后标记，每毫升抗小鼠钙网蛋白单克隆抗体 15 个字谜，在 50 微升 PBS 中，每孔添加钙和镁。在细胞培养箱中放置 15 分钟后，用 200 μL 完全细胞培养基洗涤细胞两次，并在 37 °C 下向每个孔中加入 100 μL 细胞分离溶液 20 分钟。当细胞分离后，将板加载到流式细胞仪上，并在前向和侧向散射细胞群中获取至少 1， 000 个事件，通常与活细胞相关。

然后，使用适当的流式细胞术分析软件对感兴趣的群体进行门控，并确定钙网蛋白表达的平均荧光强度。发射光谱可用于跟踪不同原料气条件下与反应等离子体成分相关的不同峰。对于液体的等离子体处理，首先确定由氩气和氩等离子体引起的蒸发，条件会产生不同的蒸发结果，因为等离子体也会对温度产生影响。

与羟基自由基的光学发射光谱结果类似，过氧化氢沉积在氧或氮混合物中显着减少，但随着原料气加湿而增加。此外，与氩等离子体处理的液体相比，向原料气中添加氮气会导致硝酸盐浓度明显升高。大多数超氧化物是在干燥的氩气条件下产生的，氧气和/或氮混合物会显着淬灭超氧化物的产生，除非存在加湿的氩氧等离子体。

刃天青和血浆处理细胞的荧光强度与目测观察到的细胞培养物上清液的物理变化相似，证实了长期血浆处理的细胞毒性作用。在血浆处理样品孔中也观察到总细胞面积的减少，特别是在加湿的原料气条件下，由于较短的血浆处理暴露，miren 黑色素瘤细胞上的钙网蛋白染色总体上调。如果作得当，mytoplex 细胞检测和读数可以在短短几个小时内完成。

按照此程序，还可以执行其他方法，例如与免疫细胞共培养或细胞培养上清液的分析。这有助于回答有关dams、cyto clients 或 redux 蛋白的释放以及血浆处理的黑色素瘤细胞的免疫识别的其他问题。开发后，这项技术为进一步研究黑色素瘤周期铺平了道路，例如使用 3D 肿瘤球体。

看完这个视频，你应该对如何进行等离子体医学的基础研究有一个很好的了解，从等离子气相，到反应性分子和液体，再到黑色素瘤细胞中的生物反应。