等离子体医学中的基础研究——从液体到细胞的高通量方法

这些基于多孔板的序列检测方法的总体目标是，通过光学发射光谱、液体分析以及细胞活性检测、显微镜观察和流式细胞术分析，更深入地理解冷物理等离子体产生的氧化剂对体外生物反应的影响。该方法有助于解答等离子体医学领域中的关键问题，特别是关于由等离子体产生的活性物质在诱导免疫原性癌细胞死亡中的重要作用。该技术的主要优势在于其半自动化操作流程。

该技术采用96孔板，以提高研究的速度和效率。该方法的应用前景可拓展至未来的等离子体治疗领域，例如皮肤病学或肿瘤学。此外，该技术能够鉴定出与生物响应相关的等离子体衍生活性物质。

演示该实验操作的是本实验室的技术员 Felix Niessner。进行等离子体物种监测时，将大气压等离子体射流置于光学发射光谱仪前方，使其与羽流轴线垂直，并使用专用软件记录在每分钟两标准升进气流量条件下，每种气体状态的光发射强度及其波长。对于等离子体处理后的超氧化物分析，请为 XYZ 平台设置最终实验方案，明确相应的处理时间及孔位。

然后，将100 µL新配制的预混液以每孔三个复孔的方式加入透明平底96孔板的孔中，并使用酶标仪在550 nm处测定吸光度。为了分析等离子体处理对细胞代谢反应的影响，在超净工作台中，将1×10⁴个目标细胞接种于含100 µL完全培养基的平底96孔板中，每孔接种量为100 µL，过夜培养。在细胞培养箱中过夜培养后，使用XYZ载物台根据实验设计对孔板施加等离子体处理或仅气体处理，随后将细胞放回培养箱继续培养20小时。

第二次孵育结束时，向细胞以及三个仅含刃天青的背景对照孔中各加入25微升新鲜细胞培养基，培养基中需添加500微摩尔刃天青。将细胞放回孵育箱，继续孵育3小时。随后，在酶标仪中检测荧光信号。

对于等离子体处理细胞的成像，在读取荧光信号后，将上清液更换为100微升新鲜细胞培养基，其中添加1微克/毫升的碘化丙啶。将培养板置于电动显微镜载物台上，选择20倍物镜对细胞进行成像。然后，使用适当的定量图像分析软件，基于每个孔中所有视野的数字相差图像，确定总的细胞质面积。

对于等离子体处理细胞的流式细胞术分析，在成像后，用200微升含钙和镁的PBS溶液洗涤每孔细胞两次，每次洗涤后在50微升含钙和镁的PBS中加入15微克/毫升的抗小鼠钙网蛋白单克隆抗体进行标记，每孔加入50微升。在细胞培养箱中孵育15分钟后，用200微升完全细胞培养基将细胞洗涤两次，每孔加入100微升细胞解离溶液，在37摄氏度下作用20分钟。当细胞完全解离后，将培养板置于流式细胞仪上，获取前向散射和侧向散射群体中至少1,000个事件，该群体通常对应于活细胞。

然后，使用适当的流式细胞术分析软件对目标细胞群进行设门，并确定钙网蛋白表达的平均荧光强度。光学发射光谱可用于监测在不同进气条件下与活性等离子体组分相关的特征峰。对于液体的等离子体处理，需首先确定氩气及氩等离子体引起的蒸发情况，不同条件会导致不同的蒸发结果，因为等离子体也会对温度产生影响。

与羟基自由基的光发射光谱结果类似，加入氧气或氮气会显著降低过氧化氢的沉积量，而使用加湿的进气气体则会增加过氧化氢的沉积。此外，与氩等离子体处理的液体相比，向进气气体中添加氮气会导致硝酸盐浓度显著升高。超氧阴离子主要在干燥的氩气条件下产生，而加入氧气和/或氮气会显著抑制超氧阴离子的生成，但在加湿的氩气-氧气等离子体条件下除外。

Resazurin 和等离子体处理细胞的荧光强度与细胞培养上清液中肉眼观察到的物理变化相似，证实了长时间等离子体处理的细胞毒性作用。在等离子体处理的样品孔中也观察到总细胞面积减少，尤其是在加湿进气条件下，miren 黑色素瘤细胞上的钙网蛋白染色总体上调，这是对较短时间等离子体处理的响应。若操作得当，mytoplex 细胞检测及其读数可在数小时内完成。

在完成该操作步骤后，还可进行其他方法，例如与免疫细胞的共培养，或对细胞培养上清液的分析。这有助于回答有关DAMPs、细胞因子或氧化还原蛋白的释放，以及经等离子体处理的黑色素瘤细胞被免疫系统识别的相关问题。该技术建立后，为进一步研究黑色素瘤细胞周期铺平了道路，例如利用三维肿瘤球体进行研究。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展等离子体医学的基础研究，从等离子体气相、活性分子与液体，到黑色素瘤细胞中的生物学响应。