应用肺转移法研究骨肉瘤转移性肺定植的实用思考

该肺转移检测的总体目标是直接观察和研究转移性骨肉瘤细胞在活肺组织中的生长。这种方法可以帮助回答骨肉瘤转移领域的真正关键问题。例如，转移性骨肉瘤细胞如何在肺部微环境中适应、存活和增殖。

该技术的主要优点是它允许在相关的三维微环境中直接可视化转移性骨肉瘤细胞的生长。一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为插管气管和吹肺的步骤在技术上具有挑战性。肿瘤细胞的尾静脉注射和小鼠安乐死是根据标准机构指南进行的。

五分钟后，将安乐死的小鼠背卧放在层流罩中的无菌垫上，并使用小的无菌剪刀小心地解剖胸骨，穿过气管两侧的胸廓入口，不要刺穿肺部。解剖气管周围的所有肌肉和结缔组织对于成功插管至关重要。接下来，使用 20 号静脉导管小心地插管气管，并使用无菌肠线缝合线松散地固定导管和气管。

将静脉延长装置从导管连接到重力增流装置的 10 毫升注射器上，并将 37 摄氏度的液体琼脂糖与 A 培养基溶液混合倒入注射器中。用琼脂糖溶液填充肺部，直到它们完全充气。然后取下套管并牢固地系住缝合线，以防止琼脂糖溶液泄漏。

吹气期间保持肺完整很重要。适当地吹入琼脂糖并随后冷却拔毛，将使肺保持扩张状态。收获拔毛、气管、心脏和肺，注意不要刺穿或损坏肺表面。

将组织放入 30 毫升补充有抗生素的预冷 PBS 中，让琼脂糖凝固。将采摘物放在冰上 20 分钟。20 分钟后，用细剪刀和镊子将肺切成 3 x 1.5 毫米的小块，然后将切片放入 6 孔板的各个孔中，该板含有 2 x 2 厘米的明胶海绵，预浸泡在 B 培养基中。

在成像当天，根据实验组，小心地将肺切片从 6 孔板转移到无菌的 35 毫米玻璃底圆培养皿中。接下来，在宽视场荧光显微镜上，选择 2.5 倍物镜并设置成像参数，以在荧光肿瘤细胞和对照组织样品组中的非荧光背景组织之间提供最佳对比度。使用与对照组织相同的参数对所有样品进行成像。

如果软件未进行刻度校准，请使用与肺组织相同的物镜对千分尺进行成像，以获得刻度参考，并将所有图像保存为 tif 文件。获得所有图像后，要在 ImageJ 中分析图像，请打开第一个文件。使用面选择工具勾勒出整个肺切片的轮廓，以确定总肺切片的面积。

选择 Process and Subtract background（处理并减去背景）。将滚动球半径设置为 50 像素的起始值。该值将取决于背景荧光的程度，并且应针对每个数据集进行优化。

确保取消选中浅色背景。选择图像和类型，8 位，然后选择图像和属性，输入像素。在 unit of length （长度单位） 下，输入 1 作为像素宽度、像素高度和体素深度。

然后，选中 global 以将这些参数应用于所有后续图像。接下来，选择 image（图像），然后选择 adjust（调整），然后选择 threshold（阈值）。突出显示默认和黑白，并使用滑块对图像进行阈值处理，以便准确突出显示大多数肿瘤细胞。

单击一次，将肺变黑，将荧光病灶变白。然后，再次单击 apply 以反转图像，使所有荧光结构都变为黑色。要量化病变的数量和形状，请选择 [分析并设置测量值]，然后检查 [面积]。

取消选中所有其他框。然后，选择 分析粒子 并在 size 字段中使用 ImageJ 确定为单个细胞的最小病变的面积，以设置程序将枚举的形状范围。使用来自第 0 天载体组的图像选择被认为是单个肿瘤细胞的最小区域。

设置下限后，单击 确定。将弹出一个结果窗口，其中包含所有枚举的形状和面积测量值。然后，将结果窗口中的数据复制并粘贴到电子表格中，并使用 sum 数学函数添加该特定肺切片的所有转移病灶区域。

高转移细胞系和低转移细胞系的转移倾向在进行时间点上直观可见。更具体地说，这些显微镜图像显示了高度转移性细胞如何能够比低转移性细胞系更有效地定植肺部。图像数据的图像分析、定量和统计分析证实，高度转移性的肿瘤细胞可以有效地定植于肺组织。

而低转移性细胞根本无法生长。与表达 EGFP 的肿瘤细胞相比，高放大倍率共聚焦荧光显微镜可以以极高的空间细节可视化肺实质细胞。以及促进亚细胞结构的分析，例如这些线粒体。

根据使用的小鼠数量，如果执行得当，这项技术可以在四个小时内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住使用干净、无菌的手术设备。开发后，该技术为癌症研究领域的研究人员探索小鼠肺部的转移进展铺平了道路。

在此程序之后，可以进行其他方法，如体外细胞培养测定和蛋白质印迹，以回答有关基因敲低或药物治疗对癌细胞影响的其他问题。观看此视频后，您应该对如何进行肺转移检测有很好的了解。不要忘记，与人类癌细胞一起工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在生物级安全二实验室工作。