研究骨肉瘤肺转移定植的实用考量：基于肺转移检测实验

本肺转移实验的总体目标是直接观察并研究转移性骨肉瘤细胞在活性肺组织中的生长情况。该方法有助于解答骨肉瘤转移领域中的一些关键问题，例如，转移性骨肉瘤细胞如何在肺部微环境中适应、存活并增殖。

该技术的主要优势在于能够在相关的三维微环境中直接观察转移性骨肉瘤细胞的生长。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，原因在于气管插管和肺部充气等操作步骤技术难度较高。肿瘤细胞尾静脉注射及小鼠安乐死操作均按照本机构的标准指南进行。

五分钟后，将已处死的小鼠置于超净台中的无菌垫上，呈仰卧位，使用小型无菌剪刀小心解剖取出胸骨，沿气管两侧至胸廓入口处剪开，注意避免刺破肺部。彻底清除气管周围的所有肌肉和结缔组织，对于成功插管至关重要。接下来，使用20号静脉导管小心地对气管进行插管，并用无菌肠线将导管与气管 loosely 固定。

将静脉延长管的一端连接至导管，另一端连接至重力灌注装置中的10毫升注射器，随后将37摄氏度的液态琼脂糖与A培养基溶液混合液倒入注射器中。用琼脂糖溶液灌注肺部，直至肺完全膨胀。然后移除套管，并牢固结扎缝线以防止琼脂糖溶液泄漏。

在灌注过程中保持肺部完整非常重要。使用琼脂糖进行充分灌注，并对肺组织块进行后续冷却，可使肺部保持扩张状态。采集肺组织块、气管、心脏和肺时，需注意避免刺破或损伤肺表面。

将组织置于含有抗生素的30毫升预冷PBS中，并让琼脂糖凝固。将组织样本放在冰上20分钟。20分钟后，使用精细剪刀和镊子将肺组织切成3 × 1.5毫米的组织块，并将组织片放入6孔板的各个孔中，每孔内含已预先浸泡于B培养基中的2 × 2厘米明胶海绵。

成像当天，将肺组织切片从6孔板中小心转移至无菌的35毫米玻璃底圆皿中，并根据实验分组按列放置。随后，在宽场荧光显微镜上选择2.5倍物镜，并调整成像参数，使对照组织样本组中荧光标记的肿瘤细胞与无荧光背景组织之间获得最佳对比度。所有样本均采用与对照组织相同的参数进行成像。

如果软件尚未进行尺度校准，请使用与肺组织相同的物镜拍摄显微尺图像，以获得尺度参考，并将所有图像保存为 tif 文件。当获取全部图像后，若要在 ImageJ 中分析图像，请打开第一个文件。使用多边形选择工具勾勒整个肺切片轮廓，以确定肺切片的总面积。

选择过程并减去背景。将滚珠半径的初始值设为 50 像素。该值取决于背景荧光的程度，应针对每组数据进行优化。

确保取消勾选浅色背景。选择图像和类型，8位，然后选择图像和属性，输入像素。在长度单位下，像素宽度、像素高度和体素深度均输入1。

然后，选择“全局”以将这些参数应用于所有后续图像。接着，选择图像，然后调整，再选择阈值。选中默认值和黑白模式，并使用滑块对图像进行阈值处理，使肿瘤细胞的大部分区域被准确地高亮显示。

单击“应用”一次，使肺组织变为黑色，荧光病灶变为白色。然后再次单击“应用”，反转图像，使所有荧光结构变为黑色。为量化病灶的数量和形态，请选择“分析”并设置测量参数，勾选“面积”选项。

取消选择所有其他选项。然后，勾选“分析颗粒”（analyze particles），在“大小”（size）字段中输入由 ImageJ 确定为单个细胞的最小病灶面积，以设定程序将计数的形态范围。使用第0天对照组（vehicle group）的图像，选择被认定为单个肿瘤细胞的最小面积。

设定下限后，单击“确定”。结果窗口将弹出，其中包含所有枚举的形状及面积测量值。然后，将结果窗口中的数据复制并粘贴到电子表格中，并使用求和数学函数计算该特定肺切片中所有转移病灶的面积总和。

高转移性和低转移性细胞系的转移倾向在不同时间点的观察中可直观显现。更具体而言，这些显微图像显示了高转移性细胞相较于低转移性细胞系能够更高效地在肺组织中定植。对图像数据进行图像分析、定量及统计学分析后证实，高转移性肿瘤细胞能够高效定植于肺组织。

而低转移性细胞则完全无法生长。与表达EGFP的肿瘤细胞相比，高倍共聚焦荧光显微镜能够更清晰地呈现肺实质细胞的空间细节，并有助于分析线粒体等亚细胞结构。

根据使用小鼠的数量不同，如果操作得当，该技术可在四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记使用清洁、无菌的外科器械。该技术在开发完成后，为癌症研究领域的研究人员探索小鼠肺部转移进展铺平了道路。

完成此操作后，还可采用体外细胞培养实验和蛋白质印迹（Western blotting）等其他方法，进一步探究基因敲低或药物处理对癌细胞的影响。观看本视频后，您应已充分掌握如何开展肺转移实验。请注意，操作人类癌细胞具有极高的危险性，在进行本实验时，必须始终采取相应防护措施，例如在生物安全二级实验室中操作。