Name: 应用肺转移法研究骨肉瘤转移性肺定植的实用思考 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学习肺转移法研究骨肉瘤细胞在肺部微环境中的生长与定植。该方法通过气管插管和尾静脉注射实现三维可视化，为肿瘤转移机制研究提供关键技术支持。

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我们感谢Arnulfo Mendoza博士提供了PuMA技术的培训。此外，我们感谢Chand Khanna博士、Susan Garfield博士（NCI/NIH）以及Sam Aparicio博士（BC癌症防治局）在本研究过程中提供其显微镜设备的使用。本研究得到了美国国立卫生研究院癌症研究中心儿科肿瘤分部内部研究计划（部分支持）。M.M.L.曾获得美国国立卫生研究院内部访问学者计划（资助编号15335）的支持，目前获得转移研究Joan Parker奖学金的支持。P.H.S.由不列颠哥伦比亚癌症基金会提供支持。

所有获取成像数据的动物实验方案均获得美国国家卫生研究院国家癌症研究所动物护理与使用委员会的批准。本文视频中讨论和展示的所有动物实验方案均已获得不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会的批准。
1. 准备注射用肿瘤细胞及PuMA模型所需材料
注意：溶液和细胞的用量足够用于1只小鼠。若研究中使用的小鼠数量增加，请相应地按比例放大。有关培养基配方，请参见表1和表2。
<ol>
	<li>将5 mL A-培养基放入15 mL锥形管中，在37 oC水浴中预热。</li>
	<li>使用实验室微波炉熔化1.2%低熔点琼脂糖溶液（溶于无菌水中）。</li>
	<li>将5 mL熔化的琼脂糖转移至15 mL锥形管中，并置于37 oC水浴中保温。确保在肺灌注步骤前，熔化的琼脂糖保持在37 oC并呈液态。</li>
	<li>将30 mL添加了1×青霉素-链霉素的细胞培养级PBS置于冰桶中预冷。</li>
	<li>在6孔板的一个孔中，用1.5 mL B-培养基预先浸泡一块明胶海绵。该海绵将作为肺组织切片的支撑锚定物。</li>
	<li>确保在实验当天，成骨肉瘤（OS）细胞融合度约为70–90%。避免使用过度融合的细胞，或培养基颜色变为橙黄色的细胞，因为此时细胞通常处于应激状态，活力显著下降。对于成骨肉瘤细胞系MNNG和HOS，每只小鼠尾静脉注射5 × 105个细胞，体积为100 μL。若实验中使用更多小鼠，应相应扩大细胞数量。</li>
	<li>使用0.25%胰蛋白酶-EDTA（T75培养瓶用3 mL，10 cm培养皿用2 mL）消化收集肿瘤细胞。当细胞开始从培养皿表面脱落时，用完全培养基中和胰蛋白酶-EDTA。离心收集细胞，并用细胞培养级PBS洗涤一次。将细胞沉淀重悬于5 mL PBS中。</li>
	<li>采用标准方法进行细胞计数。建议制备的细胞悬液量略多于实际所需量，因为在抽吸至注射针管及注射失败过程中常会造成细胞悬液损失。</li>
	<li>取部分细胞悬液进行台盼蓝排斥实验，以评估细胞活力。只有当细胞活力达到90%或更高时，方可继续后续操作。</li>
	<li>注射5 × 105个细胞，体积为100 μL。为准备两倍过量的细胞，应将1 × 106个细胞离心后重悬于0.2 mL HBSS中。</li>
	<li>在准备小鼠注射的同时，将细胞悬液置于冰桶中保存。</li>
</ol>
2. 尾静脉注射与肺部充气
注意：本节中溶液和细胞的用量足够用于1只小鼠。如果研究中使用的小鼠数量更多，请相应扩大用量。有关以下步骤所用设备、材料和手术器械的列表，请参见表3和表4。
<ol>
	<li>将一只雌性小鼠（6-8周龄）置于加热灯下加热5分钟&#160;，以使尾静脉更加明显。对于小鼠K7M2或K12细胞，使用Balb/c小鼠；对于人MG63.3、MG63、MNNG和HOS细胞，使用重度联合免疫缺陷小鼠。</li>
	<li>轻轻摇动试管，确保细胞悬液均匀。将细胞悬液小心吸入1 mL注射器（不带针头），然后用27号针头盖住注射器。确保针头斜面与注射器上的体积刻度在同一侧。</li>
	<li>将小鼠放入固定器中，并用酒精棉片擦拭尾部。</li>
	<li>进行尾静脉注射，注入100 μL细胞悬液。注射后5分钟&#160;，将小鼠放入CO2室中，并开始实施安乐死标准操作程序（按照您所在机构动物护理委员会的规定）。不应采用颈椎脱位作为安乐死方法，因为该操作会损伤气管。</li>
	<li>小鼠安乐死后，开始在层流罩内准备用于向小鼠肺部灌注琼脂糖/A培养基溶液的工作。在层流罩内设置一个无菌操作区域，并放置无菌垫。将灭菌器械、静脉导管、静脉延长管和重力灌注装置放置于该垫上（见补充图1）。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位。使用无菌小剪刀小心剪除胸骨，暴露胸腔。注意避免刺破肺组织，因为后续将使用琼脂糖/A培养基溶液对肺进行灌注。</li>
	<li>在剪除胸骨时，应沿气管两侧剪至胸廓入口处。通过剥离周围软组织暴露气管。</li>
	<li>使用20号静脉导管插管气管。用无菌肠线在插管部位的气管周围 loosely 打一个外科结。</li>
	<li>将静脉延长管一端连接至气管导管，另一端连接至重力灌注装置的10 mL注射器。</li>
	<li>将预热至37 oC的琼脂糖溶液（5 mL）与A培养基（5 mL）混合，形成1:1的混合液。将液态琼脂糖/A培养基混合液倒入重力灌注装置的10 mL注射器中。在向肺组织灌注琼脂糖/A培养基溶液前，确保整个延长管已完全充满该溶液，以避免将空气意外灌入肺样本中。</li>
	<li>用琼脂糖/A培养基溶液灌注肺组织，直至肺完全膨胀。</li>
	<li>肺完全膨胀后，移除导管，并牢固收紧外科结，防止琼脂糖/A培养基溶液从气管泄漏。</li>
	<li>继续解剖取出整块肺组织（包括气管、心脏和肺），注意避免刺破或损伤肺表面。</li>
	<li>将取出的肺组织（无需特定方向）放入预先冷却的30 mL含1X青霉素/链霉素的PBS中，静置20分钟，使琼脂糖/A培养基完全凝固。</li>
	<li>使用精细剪刀和镊子，按图1A所示切割肺组织成小片（3 mm × 1.5 mm）。较小的肺切片可使用2.5X物镜轻松成像。每个实验条件下可制备多个切片，通常每组4-10片。 
	注：对于每个实验组，将肺切片分别放入6孔板的不同孔中，每孔含一块预先用B培养基浸泡过的2 cm × 2 cm明胶海绵。每孔培养基体积应为1.5 mL。每2-3天更换一次培养基。对于药物实验，更换培养基/药物的频率由使用者自行决定。</li>
</ol>
3. 肺组织切片的宽场荧光成像与分析
注意：对于宽场荧光成像，需将组织切片切割得更小（3 mm × 1.5 mm × 1 mm），以便使用 2.5X 物镜在单幅图像中容纳整个肺组织切片。
在宽场荧光显微镜上进行图像采集：
<ol>
	<li>肺组织切片通常在注射后第0、3、7和14天进行成像。在生物安全柜的无菌环境中，小心地将肺组织切片从明胶海绵转移至无菌的35 mm玻璃底圆形培养皿中。转移时应注意用吸水纸轻轻吸去肺组织切片表面多余的液体，因为残留液体会形成镜面，反射肿瘤细胞发出的荧光。</li>
	<li>将肺组织切片按图1A所示方式排列，每一列代表不同的实验条件。操作过程中需避免镊子造成不同肺组织之间的交叉污染。在处理下一组实验样本前，应使用70%乙醇冲洗镊子并晾干。</li>
	<li>优化成像参数（例如增益、偏移、曝光时间、像素合并），以在对照组（未接受药物处理）样本中获得荧光肿瘤细胞与背景肺组织之间最佳的对比度。实验组的成像应使用与对照组相同的参数设置。图像保存为TIFF格式。</li>
	<li>为提供比例尺参考，需使用相同物镜对显微测微尺拍摄一张数码照片。</li>
	<li>由于肺组织的自发荧光会随时间变化，每次成像时均需根据对照组肺组织调整成像参数。某一次成像所用的参数设置未必适用于后续的成像会话。</li>
</ol>
图像分析： 
注意：以下图像处理步骤使用 ImageJ 1.51h 软件包完成17。
<ol>
	<li>在 ImageJ 中打开一个图像文件（图 3A）。</li>
	<li>减去背景：Process &#62; Subtract Background &#62; Rolling ball radius（起始值设为 50 像素），取消勾选“Light Background”（图 3B）。</li>
	<li>将图像转换为 8 位格式：Image &#62; Type &#62; 8-bit（图 3C）。</li>
	<li>设置单位为像素：Image &#62; 在“Unit of Length”中输入“Pixels”，在“Pixel width”、“Pixel Height”和“Voxel Depth”中均输入 1。勾选“Global”框，以便将该设置应用于后续图像。</li>
	<li>使用多边形选择工具，勾勒出整个肺组织切片的轮廓，并测定总肺切片的面积（pixel2）。该数值将用于计算肺部肿瘤负荷百分比。</li>
	<li>设定图像阈值：Image &#62; Adjust &#62; Threshold &#62; 选择“Default”和“B&amp;#38;W”&#62; 使用滑块调整阈值，使大多数肿瘤细胞被准确高亮显示。点击“Apply”后，将生成一幅黑白图像，其中肺组织为黑色，荧光病灶为白色（图 3D）。再次点击“Apply”将反转图像，使所有荧光结构变为黑色形状（图 3E）。</li>
	<li>病灶数量与形态的定量分析： 
	Analyze &#62; Set Measurements &#62; 勾选“Area”，取消勾选其他所有选项。 
	Analyze Particles &#62; Size（pixel2）：0 至无穷大表示 ImageJ 将计数的形态范围。根据 Day 0 载体处理图像中被认定为单个肿瘤细胞的最小病灶，通过经验确定其面积，并将该面积作为数据集中其余图像的下限。本论文所述工作中，下限设为 11 pixel2；视频示例中则设为 24 pixel2。将“Circularity”范围保留为 0–1。“Show”可设为“Nothing”。或者，若选择“Show”和“Outlines”，则会生成所有轮廓形状的示意图。勾选“Display results”将弹出一个独立的测量结果窗口。可选操作：勾选“Add to manager”可将所有定量的形状保存至 ROI 管理器，以便日后参考。点击 OK 后，将弹出“Results”窗口，其中包含所有被计数的形态及其面积测量值（图 3F）。</li>
	<li>将“Results”窗口中的数据复制并粘贴到电子表格中。在 Excel 中使用 SUM 数学函数，计算该肺切片中所有转移性病灶面积的总和。为评估该肺切片的肺部肿瘤负荷百分比，将转移性病灶面积总和除以肺切片总面积。该参数也称为面积分数（AA），Underwood18对此有进一步描述。 
	肺部肿瘤负荷 = 转移性病灶面积总和 / 肺切片总面积</li>
	<li>计算对照组及其他各组其余肺组织切片的肺部肿瘤负荷。绘制各组在 0、3、7 和 14 天的平均肺部肿瘤负荷变化图。图中展示了在 PuMA 模型中随时间进展的高转移性和低转移性人源 OS 细胞生长的代表性宽场荧光图像（图 4A）。同时展示了肺部转移性肿瘤负荷随时间变化的倍数变化（相对于 Day 0 标准化）折线图（图 4B）。</li>
</ol>
4. PuMA 模型的共聚焦荧光成像
注意：对于共聚焦成像，组织处理步骤与前一节相似，但需切割较厚的肺组织切片（完整的横断面，厚度为 1-2 mm），以允许成像更多的感兴趣区域（ROI）。
使用 DAR4M 标记肺实质：
<ol>
	<li>将肺切片浸入10 &#956;&#956;45 分钟内使用 DAR4M（在 HBSS 中）&#160;37℃ &#176;C. DAR4M 可标记肺细胞内的活性氮物种。</li>
	<li>45 分钟后&#160;孵育后，用新鲜的HBSS冲洗肺组织切片。</li>
	<li>将肺组织切片置于35 mm玻璃底圆皿中，在共聚焦显微镜下进行成像。</li>
	<li>示例图像所示成像参数 图5 列于 表 5.</li>
	<li>获取感兴趣区域的Z轴层扫图像。采用建议的Z轴切片厚度以满足奈奎斯特采样标准。文中提供了一段代表性三维层扫视频，显示了DAR4M标记的肺组织中绿色荧光标记的骨肉瘤细胞。 视频 1 和 补充视频 1.</li>
</ol>
对于图5所示的共聚焦显微示例图像，成像过程为终点性操作。若需进行纵向成像，建议使用配备双光子或多光子的共聚焦激光扫描显微镜（LSM），因为此类技术对活体组织的光损伤更小19,20。 
在PuMA模型中对表达mito-RFP的MG63细胞进行成像：
<ol>
	<li>使用表达 mito-RFP 构建体的 MG63 细胞，按照步骤 1 和步骤 2 中概述的方案进行 PuMA 实验。</li>
	<li>将肺组织切片置于 35 mm 玻璃底圆皿中，并在共聚焦显微镜下进行成像。</li>
	<li>图 6 所示示例图像的成像参数列于 Table 6 中。展示绿色荧光 OS 细胞及其红色荧光线粒体的三维图像序列的代表性视频见 Movie 2 和 Supplemental Movie 2。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

以下技术文章介绍了PuMA模型在研究骨肉瘤肺转移中的某些实际应用方面。在实验方案中，研究人员需格外注意的一些关键步骤包括：
a) 气管插管。在分离气管周围肌肉和结缔组织时，气管容易受损。此外，导管的针头也容易穿透气管。插入插管时，需密切注意针头斜面进入气管的方式。
b) 穿刺或损伤肺表面。在去除胸骨并暴露胸腔时，使用解剖剪刀容易穿刺或损伤肺组织。从胸腔中分离整块肺组织（pluck）时需格外小心。若穿刺或损伤肺表面，会导致液态琼脂糖/A型培养基泄漏，从而使肺组织塌陷。
c) 成像过程中去除肺组织切片上多余的培养基。 在显微镜下观察时，肺组织切片周围多余的液体培养基可能产生&#34;镜面&#34;效应。这些多余的液体会反射肿瘤细胞的荧光信号，从而夸大图像中的荧光区域。去除多余的培养基液体可避免图像中出现此类伪影。或者，也可在图像后期处理过程中消除此类图像伪影。
d) 活体组织的光损伤。使用汞灯或单光子显...

儿童转移性骨肉瘤（OS）患者的预后改善仍然是一个亟待解决的重要临床需求 1这凸显了开发新型分子靶向治疗策略的重要性。传统的化疗药物以肿瘤细胞增殖为靶点，在治疗转移性疾病方面并未显示出显著疗效，因此新的治疗策略必须直接针对转移过程本身。 2本文讨论了一种相对较新型的 离体 肺转移模型，由Mendoza及其同事开发的肺转移检测法（PuMA）3，这为发现骨肉瘤肺转移进展中的新分子驱动因素提供了有力工具 4,5在继续之前，有必要简要探讨几种当前的转移模型，以及PuMA模型相较于传统模型所具备的若干优势。 体外 检测方法
大多数用于研究转移的实验模型包括 体外 和 体内 能够模拟转移级联过程中某一特定步骤或多个步骤的系统。这些步骤包括：1）肿瘤细胞从原发性肿瘤迁移，2）侵入邻近血管（血液或淋巴管）并在循环系统中运行，3）在继发部位滞留，4）在继发部位穿出血管并存活，5）形成微转移灶，以及6）生长为具有血管化的转移灶。图1). 体外 转移模型可包括二维（2D）迁移和三维（3D）Matrigel侵袭实验，这些方法在其他文献中已有详细综述 6。对于 体内 模型，两种常用的模型系统包括：1） 自发性转移模型 是将肿瘤细胞原位注射到特定类型的组织中，以形成局部肿瘤，该肿瘤会自发地向远端部位释放转移细胞；2） 实验性转移模型 是将肿瘤细胞注射到目标器官上游血管的部位。例如，通过尾静脉注射肿瘤细胞可导致肺转移灶的形成5,7,8其他实验性转移模型包括将肿瘤细胞注射到脾脏或肠系膜静脉，从而形成肝转移。9,10这些的实际考虑因素 体内 Welch 详细讨论了这些模型 11另一个 体内 用于研究儿童肉瘤转移的模型是肾包膜下肿瘤植入模型，该模型可导致局部肿瘤形成并自发转移至肺部 12,13一种技术要求更高的方法，如活体视频显微镜技术，可实时直接观察转移性癌细胞与转移部位（例如肺或肝）微血管系统之间的相互作用，如MacDonald所述。14 和 Entenberg15，或如 Kim 所述的绒毛尿囊膜中癌细胞的外渗 16.
PuMA 模型是一种 离体 肺组织外植体，封闭式培养系统，可通过荧光显微镜在长达一个月的时间内对荧光标记的肿瘤细胞生长进行纵向观察（参见 图2A）。该模型可重现转移级联过程中肺部定植的初始阶段（步骤3至5）。与传统模型相比，PuMA模型具有若干主要优势 体外 模型的优势在于：1）可在保留肺部微环境多种特征的三维微环境中，对转移性癌细胞的生长进行纵向测量 体内 3；2）PuMA 可使研究人员评估候选基因的敲低或药物处理在三维肺微环境背景下是否具有抗转移活性；3）PuMA 模型可兼容多种类型的荧光显微镜平台图2B）例如宽场荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜，每种示例均展示于 图2C &amp;#38; D分别。本文将讨论如何利用PuMA模型，通过低倍率宽场荧光成像获取表达增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的人高转移性和低转移性骨肉瘤细胞（分别为MNNG和HOS细胞）在转移性生长过程中的纵向影像数据。此外，还讨论了在PuMA模型中使用共聚焦激光扫描显微镜成像肺实质荧光染料以及标记骨肉瘤细胞线粒体的红色荧光蛋白遗传报告系统的示例。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;表2&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;用于A培养基、B培养基及完全培养基的细胞培养试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNNG-HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1547</td><td>高转移性骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>HOS</td><td>ATCC</td><td>CRL-1543</td><td>转移能力差的骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>MG63.3</td><td>Amy LeBlanc 实验室（NCI）</td><td>N/A</td><td>高转移性骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>MG63</td><td>ATCC</td><td>CRL-1427</td><td>转移能力差的骨肉瘤细胞系</td></tr><tr><td>10X M199 培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11825015</td><td>A培养基和B培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>蒸馏水（灭菌）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15230-147</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-媒体</td></tr><tr><td>7.5% 碳酸氢钠溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25080094</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-媒体</td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6909</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-媒体</td></tr><tr><td>视黄醇醋酸酯-水溶性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0635-5MG</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-媒体</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 10 倍浓缩液（10000 U/ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-培养基，完全培养基。</td></tr><tr><td>牛胰岛素溶液（10 mg/ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516-5ML</td><td>A培养基组分 &amp;amp; B-媒体</td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965092</td><td>完全培养基的基础培养基</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030081</td><td>完全培养基的组分</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Thermofisher</td><td>16000044</td><td>完全培养基的组分</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190144</td><td>用于细胞培养。</td></tr><tr><td>汉克&amp;rsquo;不含钙、不含镁、不含酚红的缓冲盐溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14175095</td><td>用于注射前重悬细胞沉淀</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200114</td><td>用于细胞培养。</td></tr><tr><td>DAR4M</td><td>Enzo</td><td>ALX-620-069-M001</td><td>用于标记肺实质。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;表3&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;PuMA 材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔡司 710 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>直立式激光扫描共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>蔡司 780 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>蔡司</td><td>N/A</td><td>倒置激光扫描共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>SCID 小鼠</td><td>Charles River</td><td>N/A</td><td>NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl，雌性，6-8 周龄</td></tr><tr><td>GelFoam</td><td>哈佛仪器公司</td><td>59-9863</td><td>用作肺组织切片的支撑材料。</td></tr><tr><td>SeaPlaque 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50100</td><td>肺部充气时使用。</td></tr><tr><td>1 ml 注射器配27号针头</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-87</td><td>用于尾静脉注射。</td></tr><tr><td>10 ml 注射器</td><td>BD</td><td>309604</td><td>用于肺部充气。</td></tr><tr><td>20 号导管</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2032CA</td><td>用于肺部充气过程中。</td></tr><tr><td>Abbott IV 延长管（30&quot;，无菌</td><td>Medisca</td><td>8342</td><td>肺部充气时使用。</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD</td><td>326895</td><td>注射前擦拭尾静脉</td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Fisher Scientific</td><td>随尺寸而异</td><td>小鼠肺组织的无菌操作</td></tr><tr><td>30 cm 尺子</td><td>订书钉</td><td></td><td>用于肺部充气。</td></tr><tr><td>用于尺子的支撑架</td><td>Pipette.com</td><td>HS29022A</td><td>用于肺部充气。</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>用于肺组织切片成像过程中</td></tr><tr><td>带防水防潮层的吸水垫</td><td>VWR</td><td>56617-014</td><td>用于在生物安全柜内铺设无菌工作区域。</td></tr><tr><td>普通肠线可吸收缝合线</td><td>布劳恩</td><td>N/A</td><td>用于结扎套管化的气管。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;表4&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;PuMA 手术器械&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪 3.5&quot; 直尖/尖头</td><td>Roboz</td><td>RS-5910</td><td>用于切割肺组织切片</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 长10厘米，直型带齿超精细，0.5毫米尖端</td><td>Roboz</td><td>RS-5132</td><td>用于操作/夹持肺组织切片。</td></tr><tr><td>4&amp;rdquo; 10 cm 长锯齿状微弯，0.8 mm 尖端</td><td>Roboz</td><td>RS5135</td><td>用于操作/夹持肺组织切片。</td></tr><tr><td>齿状精细拇指敷料钳；4.5&quot; 长度；1.3 mm 尖端宽度</td><td>Roboz</td><td>RS-8120</td><td>用于常规解剖。</td></tr><tr><td>拇指敷料镊 4.5&quot; 锯齿状，2.2 mm 尖端宽度</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td>用于常规解剖。</td></tr><tr><td>超精细显微解剖剪 3.5&quot; 直尖/尖头，20 mm 刀片</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td>用于常规解剖。</td></tr><tr><td>克氏剪刀；直型；尖-钝头；27毫米刃长；4&quot; 总长度</td><td>Roboz</td><td>RS-5960</td><td>用于常规解剖。</td></tr></tbody></table>

研究骨肉瘤肺转移定植的实用考量：基于肺转移检测实验

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

肺转移检测（PuMA）是一种ex vivo肺组织外植体与封闭细胞培养系统，可使研究人员通过荧光显微镜研究骨肉瘤（OS）肺定植的生物学特性。本文详细描述了该实验方案，并讨论了使用宽场或共聚焦荧光显微镜平台获取转移性生长图像数据的示例。PuMA模型具有高度灵活性，研究人员不仅可借此研究OS细胞在肺微环境中的生长情况，还可随时间评估抗转移治疗药物的作用效果。共聚焦显微镜能够以前所未有的高分辨率对OS细胞与肺实质的相互作用进行成像。此外，当PuMA模型与荧光染料或荧光蛋白遗传报告系统结合使用时，研究人员可进一步研究肺微环境、细胞及亚细胞结构、基因功能以及转移性OS细胞中的启动子活性。PuMA模型为骨肉瘤研究人员提供了一种新工具，可用于发现新的转移生物学机制，并评估新型抗转移靶向治疗药物的活性。

低倍率宽场荧光显微镜
在PuMA肺切片的宽场荧光显微镜观察中，代表性图像和定量数据如图2C以及图4A和B所示。高转移性和低转移性细胞系的转移倾向在连续时间点上可直观区分。MNNG细胞能够高效定植于肺组织，而HOS细胞则完全无法生长。通过图像分析可获得定量数据，用于评估随时间推移的生长情况，如图4B中的图表所示。建议采用低倍率（2.5X）成像，以便在单幅图像中完整捕获整个肺切片。该方法可实现大量PuMA切片的批量成像。
高倍率共聚焦荧光显微镜</em...

本文旨在详细描述肺转移检测（PuMA）实验方案。该模型允许研究人员利用宽场荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜，在肺组织中研究转移性骨肉瘤（OS）细胞的生长情况。

肺转移检测法（PuMA）是一种离体肺组织外植体与封闭细胞培养系统，可使研究人员研究肺部转移的生物学特性……

本肺转移实验的总体目标是直接观察并研究转移性骨肉瘤细胞在活性肺组织中的生长情况。该方法有助于解答骨肉瘤转移领域中的一些关键问题，例如，转移性骨肉瘤细胞如何在肺部微环境中适应、存活并增殖。该技术的主要优势在于能够在相关的三维微环境中直接观察转移性骨肉瘤细胞的生长。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，原因在于气管插管和肺部充气等操作步骤技术难度较高。肿瘤细胞尾静脉注射及小鼠安乐死操作均按照本机构的标准指南进行。五分钟后，将已处死的小鼠置于超净台中的无菌垫上，呈仰卧位，使用小型无菌剪刀小心解剖取出胸骨，沿气管两侧至胸廓入口处剪开，注意避免刺破肺部。彻底清除气管周围的所有肌肉和结缔组织，对于成功插管至关重要。接下来，使用20号静脉导管小心地对气管进行插管，并用无菌肠线将导管与气管 loosely 固定。将静脉延长管的一端连接至导管，另一端连接至重力灌注装置中的10毫升注射器，随后将37摄氏度的液态琼脂糖与A培养基溶液混合液倒入注射器中。用琼脂糖溶液灌注肺部，直至肺完全膨胀。然后移除套管，并牢固结扎缝线以防止琼脂糖溶液泄漏。在灌注过程中保持肺部完整非常重要。使用琼脂糖进行充分灌注，并对肺组织块进行后续冷却，可使肺部保持扩张状态。采集肺组织块、气管、心脏和肺时，需注意避免刺破或损伤肺表面。将组织置于含有抗生素的30毫升预冷PBS中，并让琼脂糖凝固。将组织样本放在冰上20分钟。20分钟后，使用精细剪刀和镊子将肺组织切成3 × 1.5毫米的组织块，并将组织片放入6孔板的各个孔中，每孔内含已预先浸泡于B培养基中的2 × 2厘米明胶海绵。成像当天，将肺组织切片从6孔板中小心转移至无菌的35毫米玻璃底圆皿中，并根据实验分组按列放置。随后，在宽场荧光显微镜上选择2.5倍物镜，并调整成像参数，使对照组织样本组中荧光标记的肿瘤细胞与无荧光背景组织之间获得最佳对比度。所有样本均采用与对照组织相同的参数进行成像。如果软件尚未进行尺度校准，请使用与肺组织相同的物镜拍摄显微尺图像，以获得尺度参考，并将所有图像保存为 tif 文件。当获取全部图像后，若要在 ImageJ 中分析图像，请打开第一个文件。使用多边形选择工具勾勒整个肺切片轮廓，以确定肺切片的总面积。选择过程并减去背景。将滚珠半径的初始值设为 50 像素。该值取决于背景荧光的程度，应针对每组数据进行优化。确保取消勾选浅色背景。选择图像和类型，8位，然后选择图像和属性，输入像素。在长度单位下，像素宽度、像素高度和体素深度均输入1。然后，选择“全局”以将这些参数应用于所有后续图像。接着，选择图像，然后调整，再选择阈值。选中默认值和黑白模式，并使用滑块对图像进行阈值处理，使肿瘤细胞的大部分区域被准确地高亮显示。单击“应用”一次，使肺组织变为黑色，荧光病灶变为白色。然后再次单击“应用”，反转图像，使所有荧光结构变为黑色。为量化病灶的数量和形态，请选择“分析”并设置测量参数，勾选“面积”选项。取消选择所有其他选项。然后，勾选“分析颗粒”（analyze particles），在“大小”（size）字段中输入由 ImageJ 确定为单个细胞的最小病灶面积，以设定程序将计数的形态范围。使用第0天对照组（vehicle group）的图像，选择被认定为单个肿瘤细胞的最小面积。设定下限后，单击“确定”。结果窗口将弹出，其中包含所有枚举的形状及面积测量值。然后，将结果窗口中的数据复制并粘贴到电子表格中，并使用求和数学函数计算该特定肺切片中所有转移病灶的面积总和。高转移性和低转移性细胞系的转移倾向在不同时间点的观察中可直观显现。更具体而言，这些显微图像显示了高转移性细胞相较于低转移性细胞系能够更高效地在肺组织中定植。对图像数据进行图像分析、定量及统计学分析后证实，高转移性肿瘤细胞能够高效定植于肺组织。而低转移性细胞则完全无法生长。与表达EGFP的肿瘤细胞相比，高倍共聚焦荧光显微镜能够更清晰地呈现肺实质细胞的空间细节，并有助于分析线粒体等亚细胞结构。根据使用小鼠的数量不同，如果操作得当，该技术可在四小时内完成。在进行此操作时，重要的是要牢记使用清洁、无菌的外科器械。该技术在开发完成后，为癌症研究领域的研究人员探索小鼠肺部转移进展铺平了道路。完成此操作后，还可采用体外细胞培养实验和蛋白质印迹（Western blotting）等其他方法，进一步探究基因敲低或药物处理对癌细胞的影响。观看本视频后，您应已充分掌握如何开展肺转移实验。请注意，操作人类癌细胞具有极高的危险性，在进行本实验时，必须始终采取相应防护措施，例如在生物安全二级实验室中操作。

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