集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

本视频的总体目标是展示如何制备和使用集成电极的微流控芯片，进行跨内皮或跨上皮电阻测量，即TEER测量。本方法通过在微流控芯片中构建血脑屏障模型来进行演示。该技术有助于解答器官芯片领域中的关键问题，例如利用集成电极直接测量血脑屏障组织等组织的屏障功能。

本技术的主要优势在于电极可轻松整合到器官芯片系统中，并且不同系统之间的结果具有可比性。该技术的应用前景包括深入理解健康与疾病状态下的血脑屏障功能、药物研发以及个体化医疗。尽管该方法可用于研究血脑屏障功能，但它同样适用于其他器官芯片系统，例如肺芯片和肠芯片。

开始此操作时，将27克PDMS基础剂与2.7克固化剂充分混合。然后将混合物放入真空干燥器中脱气约45分钟，以去除气泡。同时，通过在模具周围粘贴透明胶带的方式准备液态PDMS混合物的模具，或将模具放入合适的晶圆 holder 中。

将脱气后的PDMS混合物倒入模具中。接着，在60摄氏度的烘箱中固化PDMS混合物4小时，之后使其冷却。在交叉流洁净台中，将固化的PDMS从模具上剥离。

使用PDMS上的切割线将PDMS复制品切割成独立的上层和下层芯片部分。随后，使用直径为1毫米的锋利活检打孔器在上层部分打四个孔，形成进样口和出样口。打孔时应从内向外进行，以防止PDMS碎屑残留在芯片内部。

然后，用透明胶带覆盖芯片部件，以防止灰尘污染。接着，将Transwell小室中的聚碳酸酯膜切割成约3×3平方毫米的正方形。随后，将多孔膜无泄漏地组装在两个PDMS部件之间，以构建一个与多孔膜相连接的双层装置。

为此，使用 0.7 克 PDMS 基体剂、0.7 克固化剂和 540 微升甲苯制备 PDMS 甲苯灰浆。充分涡旋混匀灰浆，然后将 200 微升灰浆在 1500 rpm 转速下旋涂 60 秒至玻璃盖玻片上，形成一层薄而均匀的灰浆层。接着，使用印墨辊将盖玻片上的薄层灰浆转移至芯片的底部部分。

将底部部件放入耐热容器中，然后将研磨好的浆料转移至芯片的顶部部件上。使用镊子将膜的边缘浸入旋涂好的浆料中，并小心地将其置于底部部件的中央。随后，注意对齐，小心地将顶部部件放置在底部部件上。

用透明胶带盖住芯片的入口，以防止灰尘进入芯片，并在 60 摄氏度下烘烤三小时。此步骤中需格外小心，切勿对芯片施加压力，也不要将上部在下部表面滑动，以避免砂浆进入通道并堵塞膜。

为了将电极整合到侧通道中，将铂丝切成两厘米长的小段。接着，将其浸入丙酮中30分钟。然后用清水和乙醇冲洗，并使其自然干燥。

在横流罩内，将芯片放置于塑料培养皿上。使用镊子将四根铂丝插入芯片的电极通道中，并将其弯折至塑料培养皿表面，以便在下一步中固定于培养皿上。将铂丝插入培养通道内 0.7 至 1 毫米，越过 T 形通道连接处。

随后，在电极通道入口处滴加一滴紫外光固化胶，通过毛细作用使胶液充满通道。接着打开紫外灯，当胶液流至电极通道末端时进行固化。使用双组分环氧树脂胶将四个集成电极固定在塑料培养皿上。

随后，用透明胶带覆盖芯片，并在 60 摄氏度下烘烤两小时。待其冷却后，于无尘环境中保存备用。为促进细胞贴附，需先向两个通道中加入 PBS，然后再引入试剂以对芯片进行包被处理。

在显微镜下检查通道中是否存在气泡。如果存在，用额外的PBS冲洗以去除气泡。接着，向两个通道中各加入30微升含20微克/毫升人纤维连接蛋白的PBS溶液。

在37摄氏度下孵育三小时。然后用内皮细胞生长培养基冲洗芯片，并在37摄氏度下继续孵育两小时。随后，测量空白芯片的TEER值，以确保所有电极均与通道内的液体直接接触。

为此，从培养箱中取出一个芯片，并使其在室温下静置至少十分钟。清除电极周围塑料培养皿中的任何液体，以防止芯片外部发生电桥现象。接着，对每对电极组合在200赫兹至1兆赫范围内采集阻抗谱，每张芯片共获得六条阻抗谱，耗时五到十分钟，由此可直接计算出TEER值。

检查阻抗谱是否具有预期的幅值和形状，以验证TEER测量结果。接下来，通过从培养有融合单层hcMEC/D3细胞的培养瓶中移除培养基，制备细胞悬液用于接种至顶部通道。随后，用PBS洗涤细胞。

移除 PBS，然后加入 2 毫升 0.5% 的胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 2 至 5 分钟，直至细胞从培养瓶上脱落。接着，用添加了 20% 胎牛血清（FBS）的培养基中和胰蛋白酶活性。对细胞进行计数，并计算悬浮液中的细胞总数。

同时，将 hcMEC/D3 细胞在 390 × g 条件下离心五分钟。随后，弃去上清液，并用适当体积的内皮细胞生长培养基重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到每毫升五百万个，相当于芯片中每平方厘米接种二十万个细胞的密度。接下来，将 30 微升充分混匀的细胞悬液缓慢加入上层通道中，并在持续施加压力的同时，流畅地将移液枪头从入口处移出。

在显微镜下检查接种密度，应实现细胞在上层通道内的均匀分布。随后将芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少一小时。

随后，用内皮细胞培养基冲洗掉未贴壁的细胞。需要注意的是，在培养期间应持续监测跨上皮电阻（TEER）。以下是典型的阻抗谱示意图，显示了无细胞和有细胞芯片在电学阻抗谱检测中阻抗幅值和相位偏移随频率的变化情况。

主要有四个区域，分别由电极的双层电容、培养基电阻、细胞屏障电阻或细胞膜电容主导。感兴趣的区域指示了可对细胞层贡献进行定量的位置。这是根据四个电极之间所有六种组合测得的电阻来计算 TEER 的公式。

图中显示了芯片上四个人工血脑屏障（BBB）在三天培养期间的平均经皮电极电阻（TEER）值，达到 (22 ± 1.3) Ω·cm² 的稳定平台期。作为对照，图中还包含了空白芯片的数据，显示在同一时期内其电阻值接近零 Ω·cm²，仅有微小波动，与接种细胞的芯片在TEER值上的显著变化形成对比。对染色细胞核的荧光显微观察显示，在插图所示位置，PDMS表面和膜上均形成连续的内皮单层结构。

免疫荧光结果显示存在紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens one），表明细胞间形成了血脑屏障特异性的紧密连接，从而产生了所测得的TEER值。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和使用集成电极的芯片，以在器官芯片系统中进行TEER测量。该技术可用于血脑屏障研究领域，以研究诸如阿尔茨海默病等疾病中的药物直接递送过程及疾病特征。

通过该方案，还可监测源自人诱导性多能干细胞的脑血管内皮细胞的屏障功能，用于个体化医学的应用研究。