Name: 用集成电极直接量化 Transendothelial 电阻的 Organ-on-chip 系统的制作与验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学习制作集成电极的器官芯片系统，用于直接测量跨内皮电阻（TEER）。该方法利用血脑屏障模型验证设备性能，为药物发现和个性化医学研究提供可靠的屏障功能监测手段。

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我们衷心感谢 Johan Bomer 在模具制造方面的贡献，以及 Mathijs Bronkhorst 在数据呈现方面的有益讨论和帮助。
本研究由以下机构资助：特文特大学医学工程与技术医学MIRA研究所L.I. Segerink的生物医学微器件专项研究基金（SRO Biomedical Microdevices）；特文特大学医学工程与技术医学MIRA研究所A.D. van der Meer的器官芯片专项研究基金（SRO Organs-on-Chips）；以及A. van den Berg获得的欧洲研究理事会高级资助项目VESCEL（资助编号：669768）。

1. 器官芯片装置的制备
<ol>
	<li>使用标准光刻技术制备具有通道设计的模具，并制作该模具的聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制品，获得微流控芯片的PDMS部件。
	<ol>
		<li>称取约27 g PDMS基础剂和2.7 g固化剂；质量比需为10:1。此配比适用于在直径为130 mm（5英寸）的模具上制备厚度为3 mm的PDMS平板。将这两种组分充分混合。</li>
		<li>将混合物置于真空干燥器中脱气约45分钟，以去除气泡。</li>
		<li>同时，通过在模具周围粘贴透明胶带或将模具放入合适的晶圆 holder 中，为液态PDMS混合物准备模具。</li>
		<li>将脱气后的PDMS混合物倒入模具中。若PDMS混合物中或模具表面仍残留气泡，需再次脱气约30分钟。</li>
		<li>在60 °C烘箱中固化PDMS混合物4小时。随后冷却至室温。</li>
		<li>在层流罩中将固化的PDMS从模具上剥离；模具可立即重复使用以制作更多PDMS复制品。</li>
		<li>沿PDMS上的切割线将PDMS复制品切割成独立的上层和下层芯片部分。</li>
		<li>使用直径为1 mm的锋利活检打孔器在上层部分打四个孔，形成进样口和出样口。应从内向外打孔，以防止PDMS碎屑进入芯片内部。用透明胶带覆盖芯片部件，以防灰尘污染。</li>
		<li>将Transwell插件中的聚碳酸酯膜裁剪成约3×3 mm2的正方形小片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将多孔膜无泄漏地组装在两个PDMS部件之间，以构建与多孔膜界面连接的双层装置。 
	注：本方案改编自Griep et al.19 和 Chueh et al.26
	<ol>
		<li>使用0.7 g PDMS基础剂、0.07 g固化剂和540 µL甲苯配制PDMS/甲苯砂浆，得到5:3的质量比。充分涡旋混合砂浆。</li>
		<li>将200 µL砂浆以1500 rpm转速在玻璃盖玻片上旋涂60秒（加速度为1000 rpm/s），获得一层薄而均匀的砂浆层。</li>
		<li>使用印墨辊将盖玻片上的薄层砂浆转移至芯片的上层和下层部分。将下层部分放入耐高温的培养皿中。</li>
		<li>用镊子夹住膜的边缘，浸入旋涂好的砂浆中，然后小心地将其置于下层部分的中央位置。</li>
		<li>小心地将上层部分放置在下层部分之上，注意对齐。 
		注：切勿对芯片施加压力，也不要将上层部分在下层部分上滑动，以免砂浆进入通道并堵塞膜。</li>
		<li>用透明胶带覆盖芯片的进样口，防止灰尘进入，并在60 °C下烘烤3小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将电极集成到侧通道中。 
	注：本方案改编自Griep et al.19 和 Douville et al.18
	<ol>
		<li>将铂丝裁剪成约2 cm长的小段。将其浸入丙酮中清洗30分钟，随后用水和乙醇冲洗，并自然晾干。</li>
		<li>在层流罩中，将芯片置于塑料培养皿上。使用镊子将四根铂丝插入芯片的电极通道中，并将其弯折固定在塑料培养皿上，以便后续步骤中固定。将导线插入培养通道内0.7–1 mm，越过T形通道连接处。</li>
		<li>在电极通道入口处滴加一滴紫外光固化胶，利用毛细作用使胶水填充电极周围的通道。</li>
		<li>当胶水到达电极通道末端时，打开紫外灯进行固化。 
		注意：切勿直视紫外光源，以免损伤眼睛。</li>
		<li>使用双组分环氧树脂胶将四根集成电极固定在塑料培养皿上。这可在测量过程中更方便地操作电极，避免电极被从芯片中拉出。</li>
		<li>用透明胶带覆盖芯片，并在60 °C下烘烤2小时。冷却后，在无尘环境中保存备用。如此可安全保存长达一个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脑源性内皮细胞的芯片培养
<ol>
	<li>包被芯片以促进细胞贴附。
	<ol>
		<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）填充两个通道，以润湿通道，然后再引入试剂。在显微镜下检查通道中是否存在气泡。如有气泡，用额外的PBS冲洗以去除。</li>
		<li>向两个通道中各加入30 µL含20 µg/mL人纤维连接蛋白的PBS溶液。在37 °C下孵育3小时。检查是否存在气泡，如有需要，用PBS冲洗通道并重新加入纤维连接蛋白溶液。</li>
		<li>用内皮细胞生长培养基冲洗芯片，并将芯片置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育2小时。</li>
		<li>按照步骤3所述方法测量空白芯片的跨上皮电阻（TEER），以确保所有电极均与通道内的液体直接接触。空芯片的典型TEER值为0–1 Ω cm2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞接种至顶部通道。
	<ol>
		<li>从培养瓶（75 cm2培养面积）中移除含融合单层人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）的培养基。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞。加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C、5% CO2条件下孵育2–5分钟，直至细胞从培养瓶表面脱落。</li>
		<li>使用添加了20%胎牛血清（FBS）的培养基终止胰蛋白酶反应。计数细胞并计算悬浮液中的总细胞数。</li>
		<li>同时，将hCMEC/D3细胞在390 × g下离心5分钟，并弃去上清液。</li>
		<li>用适量内皮细胞生长培养基（EGM-2）重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到5 × 106个/mL。此浓度可使芯片内的接种密度达到2 × 105个/cm2。</li>
		<li>缓慢将30 µL充分混匀的细胞悬液通过移液枪加入顶部通道，在拔出枪头时仍保持施压，动作应流畅。</li>
		<li>在显微镜下检查接种密度。应实现细胞在整个顶部通道内的均匀分布。</li>
		<li>将芯片在37 °C、5% CO2条件下孵育至少1小时。用内皮细胞培养基冲洗去除未贴壁的细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维持芯片上的内皮细胞培养。
	<ol>
		<li>每天两次，将装有培养基的移液枪头作为储液池插入入口，利用重力驱动流动更换芯片内的培养基。 
		注意：为避免气泡进入微通道并破坏细胞层，插入枪头前应确保枪头与芯片表面液体之间形成液-液接触。可在插入移液枪头前于进/出口处预先滴加少量液体以辅助实现此操作。</li>
		<li>同时在出口处也插入移液枪头储液池，以防止通道干燥。</li>
		<li>将芯片置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 芯片上TEER测量
<ol>
	<li>设置TEER测量装置，该装置由锁相放大器和探针电缆电路组成，具体配置如Van der Helm所述 等.16 或者，也可使用恒电位仪或阻抗分析仪进行基于阻抗的TEER测量。</li>
	<li>从培养箱中取出芯片，静置至少10分钟使其恢复至室温。清除电极周围塑料培养皿中的液体，以防止芯片外部发生电极短路。</li>
	<li>对每对电极组合，在200 Hz至1 MHz范围内采集阻抗谱，每枚芯片在仅5–10分钟内即可获得6条阻抗谱。检查阻抗谱的幅值和形状是否符合预期，以验证TEER测量的准确性，具体判断标准见结果部分所述。</li>
	<li>将芯片放回培养箱中 37 &#176;C 和5% CO₂2 测量结束后。</li>
	<li>将获得的阻抗谱进行处理，以得到归一化的TEER值。
	<ol>
		<li>获取测量得到的电阻值 <img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg" /> 电极之间 <img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg" /> 和 <img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg" />，如所标注的 图2B 和 D，来自相应阻抗谱中10 kHz处的电阻平台。</li>
		<li>使用以下公式，根据同一时间点一个芯片对应的六个测量电阻值计算TEER： 图 2G16: 
		<img alt="公式 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg" /> 
		在此方程中， <img alt="方程 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg" /> 是测量电阻所通过的培养区域， <img alt="公式 5" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg" /> 细胞屏障和膜的电阻 <img alt="公式 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg" />, <img alt="方程 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg" />, <img alt="方程 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg" /> 和 <img alt="公式 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg" /> 通过细胞屏障测得的电阻值 <img alt="方程 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg" /> 和 <img alt="方程 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg" /> 是在直通道中测得的电阻值。16 该方程源自图示的等效电路 图2C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从所有时间点的TEER值中减去空白对照的TEER值，以获得TEER随时间的变化情况。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，介绍了一种器官芯片装置的构建方法，以及对在该装置中培养的细胞屏障进行跨内皮电阻（TEER）的直接测定。该方法无需洁净室设备即可集成电极，并利用四个电极直接测定TEER，适用于任何具有两个微流控腔室的器官芯片装置。只要四个电极分置于两个腔室内，芯片的布局和几何结构可根据预期实验需求进行调整。这四个电极甚至可方便地插入现有芯片的入口中，前提是它们在完成六次测量期间保持固定。通过调节PDMS/甲苯比例，可优化无泄漏键合方法以适配不同的膜材料和通道几何结构。较高的甲苯含量会形成更薄的旋涂砂浆层26，可能更适用于PDMS部件中较浅且较窄的通道；而较低的甲苯含量则产生较厚的砂浆层26，可能更适合将较厚的膜封装于PDMS部件之间。
从图2A中的示意图阻抗谱以及图2E和2F中的实验谱可以看出，阻抗测量结果受到电极-培养基界面双电层电容的影响。由于微通道内电极尺寸较小，双电层电容在阻抗谱中可能主导细胞屏障的电阻平台，从而增加跨上皮电阻（TEER）定量的复杂性。为克服这一问题，可在固定前将电极进一步插入培养通道中。这将增加电极暴露于培养基中的表面积，从而使双电层电容也随之增大。其结果是电容斜率向更低频率方向移动，使得细胞屏障的电阻平台更易于识别和定量。尽管两个电极之间测量路径的电阻会因此变小，但这不会影响采用本文所述方法进行的TEER定量。
在测量细胞屏障时，可能无法识别出额外的电阻平台。这可能是由于两个通道之间存在流体连通所致，例如，当膜未被砂浆充分封闭时，会导致测量信号绕过细胞屏障。此外，如果电极被一滴培养基液滴连接，则芯片外部可能发生电学桥接。这种情况通常伴随测得的阻抗较低，可通过去除培养基液桥来解决。最后，如果不存在电阻平台，且测得的阻抗远高于预期值数个数量级，则可能是电路连接松动或电源处接触不良所致。
未来，可通过将内皮细胞暴露于生理水平的剪切应力来提高当前类血脑屏障芯片的生理相关性，据报道，生理水平的剪切应力可促进血脑屏障的分化，并增强屏障紧密性，而这一点在传统模型中难以实现 体外 模型29 此外，该装置的底部通道为脑源性细胞与内皮细胞共培养提供了合适的区域。这不仅有望增强屏障功能，还能在病理条件下研究相关细胞类型之间的复杂相互作用。29
综上所述，本出版物中描述的器官芯片装置可使用标准实验室设备制备，并能够通过四个集成电极直接测量跨上皮电阻（TEER），且不影响对所研究细胞层的显微观察。通过在该芯片中模拟血脑屏障（BBB）并在培养期间监测TEER，验证了该装置在器官芯片领域中的适用性。通过将其他相关细胞类型引入该芯片，还可模拟多种其他（屏障型）器官。此外，该TEER测量方法可轻松应用于其他基于双室结构的器官芯片装置，从而获得可在不同装置和系统间进行比较的可重复且具有生物学意义的TEER数值。

器官芯片正迅速崛起为一类新兴且极具前景的技术 体外 组织模型1 在这些模型中，细胞被培养在微流控装置内，该装置经过特殊设计，可模拟细胞的生理微环境。1,2 这使得这些细胞表现出比传统方法预期更为真实的生理或病理行为 体外 结构简单、功能基础的模型。3,5,6 此外，器官芯片提供的环境控制性优于 体内 模型可整合源自人体的健康与病变组织，以真实模拟人体生理与病理状态。近期对类器官芯片上血脑屏障（BBBs-on-chips）构建进展的综述表明，该领域正迅速发展。7
器官芯片的另一优势在于，其可通过显微镜观察、在线生化分析以及集成传感器，对芯片内培养的组织进行实时和连续的监测。1,2 例如，测量跨内皮或跨上皮电阻（TEER）是一种用于无创监测屏障组织形成与破坏的有力方法。8,9,10 TEER 是细胞屏障两侧的电阻，因此可反映屏障的完整性和通透性。10 在器官芯片中，细胞屏障通常培养在分隔两个流体通道的膜上，这两个通道分别代表该屏障组织的顶侧和基底外侧区室。在此类芯片中，可通过将电极插入两个通道的入口和出口，方便地进行跨上皮电阻（TEER）测量。3,4,11,12,13,14,15 然而，手动插入和重新插入电极容易导致放置误差，从而引起测得的电阻值发生变化 例如 与细胞屏障电阻相比，微通道中较长或较短路径的电阻差异显著。16 为消除重插入错误，已提出采用集成电极的装置。然而，大多数此类集成电极在观察组织培养时会遮挡视野。17,18,19,20,21 和/或需要专门的洁净室工艺进行制造。17,22
本出版物中描述的器官芯片装置最早在之前的一项研究中应用16，该装置将集成电极的稳定性、对所测细胞层的可视性以及易于制造等优点结合在一起。该芯片的设计与制造过程如图1所示。简而言之，该装置由两部分带有微通道印模的聚二甲基硅氧烷（PDMS）组成，两者之间夹有一层孔径为0.4 µm的聚碳酸酯膜，并通过键合实现无泄漏连接。四根铂丝电极被插入并使用光固化胶固定在培养区域之外。所有这些制造步骤均可使用常规实验室设备完成，无需洁净室环境。此外，利用这四根电极可进行六次阻抗测量，从而能够直接分离出所测的经上皮电阻（TEER），不受通向横截面的微通道电阻的影响，因此最大限度地减少了系统中非生物因素变化（如插入或重新插入误差）带来的干扰16。
为了展示该装置及其直接测量经皮电极电阻（TEER）的适用性，本研究在芯片中复制了血脑屏障（BBB）。该生物屏障由特化的内皮细胞构成，可调控血液与大脑之间的物质运输，从而维持大脑内环境的稳态。23，24 为模拟血脑屏障，微流控装置的上层通道内接种了来源于hCMEC/D3细胞系的人脑微血管内皮细胞（由法国巴黎INSERM的Dr. P.-O. Couraud惠赠）。25 然而，所介绍的方法更广泛适用于任何具有两个腔室的器官芯片装置，可通过易于集成的电极实现对TEER的直接测定。
本文首先描述了集成电极的器官芯片装置的制备过程。接着，介绍了在该装置内接种并培养脑微血管内皮细胞的方法，以及芯片上的跨内皮电阻（TEER）测量技术。在结果部分，展示了典型的TEER测量数据，并阐明了数据处理方法。最后，展示了在连续3天监测过程中血脑屏障芯片的屏障功能，体现了所介绍装置及TEER监测方法的应用价值。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂和固化剂：Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic 透明胶带</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器，1.0 mm 直径</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜，0.4 &amp;micro;m 孔径</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>从 Transwell 培养插件上裁剪获得</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>铂丝，200 &amp;micro;m 直径</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>紫外光固化胶：Norland 光学胶 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>环氧胶：Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3 细胞</td><td></td><td></td><td>人脑微血管内皮细胞系，由法国巴黎 INSERM 的 Dr. P.-O. Couraud 惠赠</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>人血浆纤连蛋白，20 &amp;micro;g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>内皮细胞生长培养基-2（EGM-2）</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>内皮基础培养基-2（EBM-2）添加 EGM-2 SingleQuots 补充剂</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA，0.05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烘箱</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪：Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>紫外光源，365 nm，350 mW/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 条件下照射 5 秒</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机：Allegra X-12R 离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Binder</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>带探针电缆电路的锁相放大器，专用于芯片上 TEER 测量</td></tr></tbody></table>

集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

器官芯片， 体外 涉及在微流控装置内培养（人类）组织的模型正在迅速兴起，有望为研究人类健康与疾病提供有用的科研工具。为了表征器官芯片装置内培养的细胞层的屏障功能，通常需测量跨内皮或跨上皮电阻（TEER）。为此，通常通过微加工方法将电极集成至芯片中，以获得比手动将电极插入芯片入口更稳定的测量结果。然而，这些电极常常妨碍对所研究细胞层的显微观察，或需要昂贵的洁净室加工工艺。为克服这些局限性，本文所述装置包含四个易于集成的电极，其位置固定于培养区域之外，从而实现对细胞层的可视观察。利用这四个电极，可量化六条测量路径的电阻，并由此直接分离出TEER值，排除充满培养基的微通道电阻的干扰。本研究在该装置中模拟了血脑屏障，并通过监测其TEER验证了装置的适用性。该芯片、集成电极及其TEER测定方法可广泛适用于各类器官芯片系统，既可用于模拟其他器官，也可整合至现有的器官芯片体系中。

芯片中无细胞（实线）和存在细胞屏障（虚线）时的电学阻抗谱示意图结果如图2A所示。可识别出四个主要区域，每个区域均由特定的电学元件主导。在约1 kHz以下，电极-培养基界面处的双电层电容占主导地位，其特征是阻抗幅值呈负斜率，相位移接近-90°。双电层电容占主导的频率取决于暴露于培养基中的电极面积。在1 kHz（无细胞时）或100 kHz（有细胞时）以上的电阻平台区，相位移接近0°，对应于微流控通道内培养基的电阻，其值取决于通道长度和横截面积，以及膜内的电阻，其值取决于膜的孔隙率和厚度。当通过细胞屏障进行测量时，在1至10 kHz之间会出现一个额外的电阻平台区，并在相位图中出现局部最大值。该区域对于经上皮/内皮电阻（TEER）的测定至关重要，因为在测量路径中存在细胞时阻抗显著升高，因此被称为“感兴趣区域”。在10至100 kHz之间的额外斜率对应于细胞屏障电容，该电容来源于电学绝缘的脂质双分子层膜，其值取决于细胞层的总面积。27 这些区域的边界及阻抗幅值取决于所研究的系统，并随通道尺寸、培养基电导率、电极位置和细胞类型等因素而变化。有关屏障形成组织电学阻抗谱理论与实践的进一步阅读，推荐参阅Benson et al. 的综述文章。28
空白芯片和含hCMEC/D3人脑微血管内皮细胞层的芯片的TEER测量代表性数据分别如图2E和2F所示。简而言之，使用六个测量点和四个电极进行阻抗谱分析：其中两次测量通过充满细胞培养基的通道（实线），另外四次测量则通过通道以及膜结构，若存在细胞屏障，则还包括细胞屏障（虚线）。这六条测量路径可在图2B的等效电阻电路中识别，该电路基于示意图横截面（图2C）和顶视图（图2D）推导而来。空白芯片的测量结果（图2E）显示了无细胞时典型的阻抗谱形状，如图2A所示。通过细胞屏障的测量结果（图2F中的虚线）则与图2A中含细胞时典型的阻抗谱相似。请注意，阻抗幅值和相位偏移均随频率趋近于1 MHz而增加。这是测量系统在高频下的典型响应，并非来源于实验因素。
为了利用这些实验阻抗谱测定TEER，首先需确定测得的芯片电阻，即细胞层、通道和膜的总电阻。为此，选择一个在感兴趣区域内的合适读出频率，该频率位于有细胞时相位图的局部最大值处，且在无细胞时相位偏移接近0°：10 kHz。根据在四个电极之间测得的六个10 kHz频率下的电阻值，直接使用图2F中的公式计算TEER。
为了证明本装置适用于器官芯片中TEER的测定，实验在芯片内构建了血脑屏障（BBB）模型，并在3天培养期间监测其TEER值。图3A展示了四个芯片上BBB模型的平均TEER值±均值标准误（SEM），结果显示TEER达到稳定平台期，为22 ± 1.3 Ω cm2，与文献报道的该细胞系的TEER值相当。29 此外，在实验结束后对细胞核进行荧光染色后可以观察到，脑微血管内皮细胞在装置内形成了连续的单层结构（图3B）。对紧密连接蛋白Zonula Occludens-1（ZO-1）进行免疫荧光染色的结果表明，脑微血管内皮细胞保持了BBB特异的表型，并形成了紧密连接复合物。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg" /> 
图1：集成电极的器官芯片装置的设计与组装。 
(A) 微流控芯片的分解示意图，包括顶部带有上通道（TC）的PDMS部件、膜（M）以及底部带有下通道（BC）的PDMS部件。四根铂丝电极（E1-4）插入并固定在侧通道中。在上通道及膜的上方培养hCMEC/D3脑微血管内皮细胞，以模拟血脑屏障（BBB）。 (B) 组装完成的芯片，固定于塑料培养皿中。经Elsevier许可转载并改编。16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg" /> 
图2：代表性阻抗数据及TEER的测定。 
(A) 典型的阻抗谱示意图，显示阻抗幅值（Ω）和相位偏移（°）随频率（Hz）的变化，分别代表无细胞（实线）和有细胞（虚线）芯片上的电学阻抗谱。谱图可分为四个主要区域，分别由以下因素主导：电极处的双电层电容、培养基电阻、细胞屏障电阻以及细胞膜电容。“感兴趣区域”表示可对细胞层贡献进行定量的范围（红色箭头所示）。(B) 芯片的等效电阻电路，显示上通道的电阻R1和R3、下通道的电阻R2和R4，以及膜和内皮细胞（EC）屏障电阻Rm。 (C) 示意图横截面，显示在上通道中培养的内皮细胞（EC）。 (D) 血脑屏障（BBB）芯片的示意图俯视图，显示电极的排列以及用于测量阻抗的0.25 mm2培养区域。 (E) 充满细胞培养基的空白芯片的代表性阻抗谱。 (F) 人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3在芯片中培养3天后的代表性阻抗谱。(G) 根据四电极间六种组合测得的电阻计算TEER的公式。经Elsevier许可转载并改编。16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg" /> 
图3：类血脑屏障芯片中TEER的典型发展情况。 
(A) 四个类血脑屏障芯片在三天培养期间的平均跨上皮电阻（TEER）± 均值标准误（SEM），达到 22 ± 1.3 Ω cm2（平均值 ± SEM）的平台期。作为对照，空白芯片的数据也一并展示，其在同一时间段内表现出微小波动，且偏离 0 Ω cm2 的程度远小于含细胞芯片的波动及TEER值。（B） 荧光显微镜下观察染色后的细胞核，显示内皮细胞在PDMS表面以及插件膜上（如插图所示位置）均形成连续的单层结构。（C） 免疫荧光染色显示紧密连接蛋白Zonula Occludens-1的存在，表明细胞间形成的具有血脑屏障特异性的紧密连接是所测得TEER值的基础。经Elsevier许可转载并改编。16 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种集成电极的器官芯片装置的制备方法，用于直接定量跨内皮细胞电阻（TEER）。为验证该方法，利用该微流控装置模拟了血脑屏障，并对其屏障功能进行了监测。所提出的电极集成与直接TEER定量方法具有广泛的适用性。

器官芯片，一种在微流控装置内培养（人类）组织的体外模型，正迅速兴起，并有望提供有价值的……

本视频的总体目标是展示如何制备和使用集成电极的微流控芯片，进行跨内皮或跨上皮电阻测量，即TEER测量。本方法通过在微流控芯片中构建血脑屏障模型来进行演示。该技术有助于解答器官芯片领域中的关键问题，例如利用集成电极直接测量血脑屏障组织等组织的屏障功能。本技术的主要优势在于电极可轻松整合到器官芯片系统中，并且不同系统之间的结果具有可比性。该技术的应用前景包括深入理解健康与疾病状态下的血脑屏障功能、药物研发以及个体化医疗。尽管该方法可用于研究血脑屏障功能，但它同样适用于其他器官芯片系统，例如肺芯片和肠芯片。开始此操作时，将27克PDMS基础剂与2.7克固化剂充分混合。然后将混合物放入真空干燥器中脱气约45分钟，以去除气泡。同时，通过在模具周围粘贴透明胶带的方式准备液态PDMS混合物的模具，或将模具放入合适的晶圆 holder 中。将脱气后的PDMS混合物倒入模具中。接着，在60摄氏度的烘箱中固化PDMS混合物4小时，之后使其冷却。在交叉流洁净台中，将固化的PDMS从模具上剥离。使用PDMS上的切割线将PDMS复制品切割成独立的上层和下层芯片部分。随后，使用直径为1毫米的锋利活检打孔器在上层部分打四个孔，形成进样口和出样口。打孔时应从内向外进行，以防止PDMS碎屑残留在芯片内部。然后，用透明胶带覆盖芯片部件，以防止灰尘污染。接着，将Transwell小室中的聚碳酸酯膜切割成约3×3平方毫米的正方形。随后，将多孔膜无泄漏地组装在两个PDMS部件之间，以构建一个与多孔膜相连接的双层装置。为此，使用 0.7 克 PDMS 基体剂、0.7 克固化剂和 540 微升甲苯制备 PDMS 甲苯灰浆。充分涡旋混匀灰浆，然后将 200 微升灰浆在 1500 rpm 转速下旋涂 60 秒至玻璃盖玻片上，形成一层薄而均匀的灰浆层。接着，使用印墨辊将盖玻片上的薄层灰浆转移至芯片的底部部分。将底部部件放入耐热容器中，然后将研磨好的浆料转移至芯片的顶部部件上。使用镊子将膜的边缘浸入旋涂好的浆料中，并小心地将其置于底部部件的中央。随后，注意对齐，小心地将顶部部件放置在底部部件上。用透明胶带盖住芯片的入口，以防止灰尘进入芯片，并在 60 摄氏度下烘烤三小时。此步骤中需格外小心，切勿对芯片施加压力，也不要将上部在下部表面滑动，以避免砂浆进入通道并堵塞膜。为了将电极整合到侧通道中，将铂丝切成两厘米长的小段。接着，将其浸入丙酮中30分钟。然后用清水和乙醇冲洗，并使其自然干燥。在横流罩内，将芯片放置于塑料培养皿上。使用镊子将四根铂丝插入芯片的电极通道中，并将其弯折至塑料培养皿表面，以便在下一步中固定于培养皿上。将铂丝插入培养通道内 0.7 至 1 毫米，越过 T 形通道连接处。随后，在电极通道入口处滴加一滴紫外光固化胶，通过毛细作用使胶液充满通道。接着打开紫外灯，当胶液流至电极通道末端时进行固化。使用双组分环氧树脂胶将四个集成电极固定在塑料培养皿上。随后，用透明胶带覆盖芯片，并在 60 摄氏度下烘烤两小时。待其冷却后，于无尘环境中保存备用。为促进细胞贴附，需先向两个通道中加入 PBS，然后再引入试剂以对芯片进行包被处理。在显微镜下检查通道中是否存在气泡。如果存在，用额外的PBS冲洗以去除气泡。接着，向两个通道中各加入30微升含20微克/毫升人纤维连接蛋白的PBS溶液。在37摄氏度下孵育三小时。然后用内皮细胞生长培养基冲洗芯片，并在37摄氏度下继续孵育两小时。随后，测量空白芯片的TEER值，以确保所有电极均与通道内的液体直接接触。为此，从培养箱中取出一个芯片，并使其在室温下静置至少十分钟。清除电极周围塑料培养皿中的任何液体，以防止芯片外部发生电桥现象。接着，对每对电极组合在200赫兹至1兆赫范围内采集阻抗谱，每张芯片共获得六条阻抗谱，耗时五到十分钟，由此可直接计算出TEER值。检查阻抗谱是否具有预期的幅值和形状，以验证TEER测量结果。接下来，通过从培养有融合单层hcMEC/D3细胞的培养瓶中移除培养基，制备细胞悬液用于接种至顶部通道。随后，用PBS洗涤细胞。移除 PBS，然后加入 2 毫升 0.5% 的胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 2 至 5 分钟，直至细胞从培养瓶上脱落。接着，用添加了 20% 胎牛血清（FBS）的培养基中和胰蛋白酶活性。对细胞进行计数，并计算悬浮液中的细胞总数。同时，将 hcMEC/D3 细胞在 390 × g 条件下离心五分钟。随后，弃去上清液，并用适当体积的内皮细胞生长培养基重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到每毫升五百万个，相当于芯片中每平方厘米接种二十万个细胞的密度。接下来，将 30 微升充分混匀的细胞悬液缓慢加入上层通道中，并在持续施加压力的同时，流畅地将移液枪头从入口处移出。在显微镜下检查接种密度，应实现细胞在上层通道内的均匀分布。随后将芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少一小时。随后，用内皮细胞培养基冲洗掉未贴壁的细胞。需要注意的是，在培养期间应持续监测跨上皮电阻（TEER）。以下是典型的阻抗谱示意图，显示了无细胞和有细胞芯片在电学阻抗谱检测中阻抗幅值和相位偏移随频率的变化情况。主要有四个区域，分别由电极的双层电容、培养基电阻、细胞屏障电阻或细胞膜电容主导。感兴趣的区域指示了可对细胞层贡献进行定量的位置。这是根据四个电极之间所有六种组合测得的电阻来计算 TEER 的公式。图中显示了芯片上四个人工血脑屏障（BBB）在三天培养期间的平均经皮电极电阻（TEER）值，达到 (22 ± 1.3) Ω·cm² 的稳定平台期。作为对照，图中还包含了空白芯片的数据，显示在同一时期内其电阻值接近零 Ω·cm²，仅有微小波动，与接种细胞的芯片在TEER值上的显著变化形成对比。对染色细胞核的荧光显微观察显示，在插图所示位置，PDMS表面和膜上均形成连续的内皮单层结构。免疫荧光结果显示存在紧密连接蛋白ZO-1（zonula occludens one），表明细胞间形成了血脑屏障特异性的紧密连接，从而产生了所测得的TEER值。观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和使用集成电极的芯片，以在器官芯片系统中进行TEER测量。该技术可用于血脑屏障研究领域，以研究诸如阿尔茨海默病等疾病中的药物直接递送过程及疾病特征。通过该方案，还可监测源自人诱导性多能干细胞的脑血管内皮细胞的屏障功能，用于个体化医学的应用研究。

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科研

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Bioengineering

生物工程

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