Name: 荧光显微镜评价辐射诱发克隆细胞死亡模式的一步协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: 了解使用DAPI染色和荧光显微镜评估电离辐射诱导克隆细胞死亡模式的一步法。该方法可同时检测细胞凋亡、有丝分裂灾难和衰老，为辐射生物学研究提供快速经济的分析手段。

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感谢 Shibata Akiko 女士提供的技术支持。本工作由日本文部科学省“引领研究生院计划”以及“培养重离子治疗与工程领域全球领军人才”项目提供的专项经费资助。

1. 材料准备
<ol>
	<li>高压灭菌盖玻片。
	<ol>
		<li>将盖玻片放入玻璃烧杯中。</li>
		<li>用铝箔覆盖玻璃烧杯。</li>
		<li>在121 °C、15 psi条件下高压灭菌20分钟。</li>
		<li>在50 °C下干燥，于室温下存放于超净工作台中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制固定液：含2%蔗糖的3%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）。
	<ol>
		<li>向一个1,000 mL玻璃瓶中加入700 mL PBS和30 g多聚甲醛。 
		注意：多聚甲醛具有腐蚀性，操作时应佩戴合适的手套。</li>
		<li>使用微波炉加热至80 °C，使多聚甲醛完全溶解。 
		注意：多聚甲醛蒸气有毒，操作时应佩戴口罩。</li>
		<li>室温下静置过夜。</li>
		<li>加入20 g蔗糖。</li>
		<li>加入PBS定容至1 L。</li>
		<li>分装至50 mL离心管中。固定液可在-20 °C保存3年，或在4 °C保存3个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养的准备
注意：这些操作应在培养罩内进行。
<ol>
	<li>培养并传代U2OS人骨肉瘤细胞以维持其对数生长期5. 
	注意：在确定最佳辐照剂量后，也可使用其他细胞类型。</li>
	<li>用经70%乙醇润湿的纸巾擦拭解剖刀。使用解剖刀将盖玻片放置于35 mm细胞培养皿上（下文简称为 &#34;培养皿&#34;). 
	注意：可根据实验设计增加一个培养皿中盖玻片的数量（参见讨论部分）。</li>
	<li>加入1 mL培养基：含10%胎牛血清的DMEM。 
	注意：可根据所选细胞类型使用其他培养基。</li>
	<li>用经70%乙醇润湿的纸巾擦拭镊子。用镊子轻轻夹住盖玻片中心，在保持夹持盖玻片的同时，将培养皿中的培养基完全吸除。 
	&#8203;注意：此步骤有助于将盖玻片固定于培养皿上。</li>
	<li>使用胰蛋白酶消化贴壁培养的细胞5.
	<ol>
		<li>吸出培养皿中的培养基。</li>
		<li>加入1 mL PBS，轻轻摇动培养皿。</li>
		<li>吸出培养皿中的 PBS。</li>
		<li>加入1 mL胰蛋白酶溶液［0.25%（w/v）胰蛋白酶-1 mmol/L EDTA］至培养皿中。</li>
		<li>37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟2.</li>
		<li>向培养皿中加入 9 mL 培养基。</li>
		<li>使用1000 μL移液器制备单细胞悬液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计数细胞5.
	<ol>
		<li>在1.5 mL离心管中，加入0.9 mL细胞悬液和0.1 mL 0.4%台盼蓝溶液。</li>
		<li>将10 μL样品加入血细胞计数板。</li>
		<li>检查未染色的数量（即在倒置相差显微镜下观察活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 mL离心管中，用培养基制备3 mL细胞悬液，细胞密度为0.5 × 105 cells/mL 
	注意：细胞密度可根据实验需求进行调整（参见 讨论).</li>
	<li>轻轻将2 mL细胞悬液加入培养皿中。</li>
	<li>37 °C、含5% CO的环境中孵育过夜2.</li>
</ol>
3. 照射
警告：请根据制造商的说明小心操作X射线辐照仪。
<ol>
	<li>在倒置相差显微镜下观察细胞，确认细胞已贴附于盖玻片且存活。</li>
	<li>使用6 Gy X射线（1.4 Gy/min，300 KVP，20 mA）照射培养皿。</li>
	<li>在含5% CO2的环境中，37 °C孵育72小时。 
	注意：孵育时间可根据实验设计进行调整（见讨论部分）。</li>
</ol>
4. 固定
<ol>
	<li>从培养皿中吸除培养基。</li>
	<li>使用剪刀，在1,000 μL移液器吸头末端5 mm处剪去吸头尖端。 
	注意：剪切后的吸头有助于更平滑地加入固定液。</li>
	<li>使用剪切后的吸头，从培养皿侧壁加入1 mL固定液（按步骤1.2配制）至培养皿中。 
	注意：此步骤对时间敏感，因此在处理多个样品时应避免更换移液器吸头。直接将固定液加至培养皿底部可能损伤细胞。</li>
	<li>将培养皿放入方形培养皿中，轻轻摇动方形培养皿，使固定液均匀覆盖盖玻片。</li>
	<li>室温孵育10分钟。</li>
	<li>从培养皿中吸除固定液。</li>
	<li>从培养皿侧壁加入2 mL PBS至培养皿中。 
	注意：直接将PBS加至培养皿底部可能损伤细胞。</li>
	<li>从培养皿中吸除PBS。</li>
	<li>重复步骤4.7和4.8两次。 
	注意：培养皿可在4 °C条件下储存1周，期间盖玻片浸没于2 mL PBS中。</li>
</ol>
5. DAPI 染色
<ol>
	<li>在载玻片上加入 5 μL 浓度为 1 μg/mL 的 DAPI 染色试剂。 
	注意：DAPI 染色试剂在避光且温度为或低于 -20 °C 的条件下保存时，可保持稳定长达 6 个月。</li>
	<li>使用手术刀从培养皿中取出盖玻片。</li>
	<li>用纸巾轻触盖玻片边缘，吸去盖玻片上多余的 PBS。</li>
	<li>将盖玻片细胞面朝下倒置贴附于载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴中，使细胞与 DAPI 染色试剂接触。 
	注意：此步骤对时间敏感。若 DAPI 染色试剂干燥，可能导致染色效果不理想。</li>
	<li>样品可在 -20 °C 条件下保存长达 1 年。</li>
</ol>
6. 图像采集
<ol>
	<li>在荧光显微镜下观察样品，使用DAPI滤光片观察细胞核。 
	注意：可根据研究者需求选择使用20X或60X油镜。使用60X油镜时，需在盖玻片上滴加一滴镜油。注意避免样品接触镜头，否则可能导致镜头损坏。</li>
	<li>使用CCD相机及数字图像采集软件，在以下设置和参数下采集细胞核图像：DAPI滤光片、单层图像、增益1X、自动曝光。</li>
	<li>完成图像采集后：用蘸有镜头清洁剂的纸巾擦拭20X镜头；用蘸有氯仿的纸巾擦拭60X油镜。</li>
</ol>
7. 克隆源性细胞死亡方式的评估
<ol>
	<li>在随机选择的图像中，计数符合凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老标准的细胞核数量，直至计数的细胞核总数达到300。每种实验条件下均重复进行三次。
	<ol>
		<li>细胞凋亡的判断标准：出现凋亡小体（即，浓缩且断裂的细胞核）6,7.</li>
		<li>有丝分裂灾难的判断标准：出现含有两个或更多明显叶状结构或微核的细胞核8,9,10.</li>
		<li>细胞衰老的判断标准：存在衰老相关异染色质灶（SAHF）（即，细胞核DNA含有30-50个明亮且致密的焦点2,11.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWouters%2C+BG+%22Basic+Clinical+Radiobiology.+4th+ed%22">Basic Clinical Radiobiology. 4th ed</a>. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).</li>
<li>Aird, K. M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+senescence-associated+heterochromatin+foci+%28SAHF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF).</a> Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).</li>
<li>Kobayashi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+catastrophe+is+a+putative+mechanism+underlying+the+weak+correlation+between+sensitivity+to+carbon+ions+and+cisplatin%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin.</a> Sci. Rep. 7, 40588(2017).</li>
<li>Amornwichet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon-ion+beam+irradiation+kills+X-ray-resistant+p53-null+cancer+cells+by+inducing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe.</a> PLoS One. , 115121(2014).</li>
<li>Masters, J. R., Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+medium+and+passaging+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Changing medium and passaging cell lines.</a> Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).</li>
<li>Sawai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+sulforaphane+as+a+radiosensitizer+for+murine+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells.</a> Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).</li>
<li>Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cell+death+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of cell death in mammalian cells.</a> Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C646%2C+a+selective+small+molecule+inhibitor+of+histone+acetyltransferase+p300%2C+radiosensitizes+lung+cancer+cells+by+enhancing+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Radiother.+Oncol%22%5BJournal%5D)">C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe.</a> Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).</li>
<li>Oike, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+lethality-based+strategy+to+treat+cancers+harboring+a+genetic+deficiency+in+the+chromatin+remodeling+factor+BRG1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1.</a> Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).</li>
<li>Russo, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+radiosensitization+of+glioblastoma+cells+by+the+poly+%28ADP-ribose%29+polymerase+inhibitor+E7016%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016.</a> Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).</li>
<li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+oncogene-induced+DNA+damage+response+and+heterochromatin+in+senescence+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer.</a> Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).</li>
<li>Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+assay+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Clonogenic assay of cells in vitro.</a> Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).</li>
<li>Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+through+a+tragedy%3A+mitotic+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Death through a tragedy: mitotic catastrophe.</a> Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).</li>
<li>Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+breaks+during+mitotic+catastrophe+trigger+%CE%B3H2AX-ATM-p53-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis.</a> J. Cell Sci. 129, 1950(2016).</li>
<li>Torres-Roca, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+assay+of+tumor+radiosensitivity%3A+a+roadmap+towards+biology-based+personalized+radiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Per.+Med%22%5BJournal%5D)">A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy.</a> Per. Med. 9, 547-557 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

协议中的关键步骤如下。首先，细胞应在培养皿上以单层形式生长，因为对于多层细胞，难以对DAPI染色的细胞核进行形态学评估。为此，在步骤2.9中，建议小心地将培养皿转移至培养箱；剧烈晃动培养皿会导致悬浮细胞产生涡流，从而使细胞聚集于培养皿中央。此外，应避免细胞过度汇合而形成多层生长。为此，在步骤2.7中，可根据细胞的群体倍增时间以及照射与固定之间的间隔时间，调整接种到培养皿上的细胞数量。建议在固定时细胞汇合度约为80%。其次，固定和DAPI染色过程中的操作速度至关重要即，步骤4和5）。这些步骤在不同样本间所需时间的不一致可能导致细胞核DAPI信号强度的异质性，从而影响对形态学的评估。
在步骤2.2中，可增加单个培养皿中盖玻片的数量；一个35 mm培养皿中最多可放置四张盖玻片，使用更大的培养皿可进一步增加数量。在每个培养皿中放置多张盖玻片可高效地对特定处理进行时间过程评估即，可以在多个感兴趣的时间点从培养皿中逐个收集盖玻片。
在步骤3.2中，可根据研究人员的兴趣调整照射剂量。对多个细胞系施加一致的剂量，可实现不同细胞系之间克隆源性细胞死亡各模式敏感性的比较。另一方面，对每个细胞系使用等克隆源性存活剂量，则可实现细胞系之间克隆源性细胞死亡特征的比较。等克隆源性存活剂量可通过克隆源性存活实验12确定。D10值是指达到10%克隆源性存活率所需的剂量，是等克隆源性存活剂量常用的终点指标。
在步骤3.3中，从照射到固定的时长可根据研究人员的兴趣进行调整；这一点非常重要，因为不同细胞系和处理条件下，电离辐射诱导的凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的峰值时间各不相同。本文中，我们选择照射后72小时作为初始筛选克隆形成性细胞死亡谱型的最适时间点，该选择基于本课题组及他人的多项研究1,2,3,4,8,9，具体依据如下：（i）来源于实体瘤的细胞中，X射线诱导的凋亡主要发生在照射后的数天内。（ii）癌细胞中X射线诱导的有丝分裂灾难在经历照射引起的短暂细胞周期阻滞并恢复后的第二次或第三次有丝分裂时最为显著。细胞通常在照射后约24小时解除阻滞，随后每隔约24小时发生一次有丝分裂。（iii）X射线诱导的细胞衰老显现的时间间隔取决于具体的细胞系：某些情况下最早在照射后2天出现，而大多数细胞系则在照射后7天左右显现。在通过初步筛选获得克隆形成性细胞死亡谱型的整体图像后，时间进程实验将进一步明确特定细胞系和/或条件下每种克隆形成性细胞死亡模式的峰值时间4。
需要注意的是，DAPI染色实验与克隆形成存活实验（评估辐射敏感性的金标准方法）不可互换。细胞凋亡和有丝分裂灾难仅持续数小时，因此在特定时间点进行的DAPI染色实验仅能检测该时间点发生的细胞凋亡和有丝分裂灾难。相反，在特定时间点获得的克隆形成存活实验结果则包含了照射后通常为期10 -&#160;14天的培养期间内所发生的细胞凋亡和有丝分裂灾难的总量。与细胞凋亡和有丝分裂灾难不同，衰老细胞会保留在培养皿中，并在照射后随着时间逐渐累积。因此，DAPI染色实验和克隆形成存活实验的结果均反映了培养期间内所发生的细胞衰老的总量。重要的是，不同细胞系和不同照射剂量所诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的比例存在广泛差异。综上所述，理论上，一种实验的结果无法直接转换为另一种实验的结果。
DAPI 染色实验存在一些局限性。首先，有丝分裂灾难是否是一种独立的细胞死亡方式仍存在争议。在辐射生物学领域，有丝分裂灾难被认为是一种主要的电离辐射（IR）诱导的细胞死亡方式，与其他克隆源性细胞死亡机制不同1。然而，也有观点认为有丝分裂灾难并非一种独立的细胞死亡方式，而是一个先于细胞死亡（包括凋亡和坏死）发生的前导过程13,14。因此，细胞凋亡与有丝分裂灾难在一定程度上可能存在重叠。其次，先前的研究表明，在某些细胞系和处理条件下，细胞衰老可在无SAHF形成的情况下发生2。目前，应使用针对每种克隆源性细胞死亡方式专门设计的其他实验方法，以增强特定实验结论的可靠性。第三，DAPI 染色实验无法评估除凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老之外的其他克隆源性细胞死亡方式（例如，坏死和自噬）。第四，DAPI 染色实验作为预测肿瘤对放射治疗反应的工具，其临床应用价值尚未明确。从这一角度来看，克隆源性存活实验优于 DAPI 染色实验，因为它能够评估总的克隆源性细胞死亡量，并且已有研究证实，经 2 Gy X 射线照射后细胞的存活分数（SF2）与肿瘤对放疗的反应之间存在相关性15。然而值得注意的是，克隆源性存活实验在临床上并未被广泛使用，主要原因是其实验操作需要较高的专业技术水平，且数据获取耗时较长（即，约 14 天）。相比之下，DAPI 染色实验的操作更为简便，生成结果所需时间显著缩短，约为 3 - 4 天。DAPI 染色实验作为预测肿瘤对放射治疗反应的潜在工具，将在不久的将来接受临床验证。
综上所述，DAPI染色实验是一种经济高效的单步检测方法，可同时评估电离辐射诱导的克隆形成性细胞死亡的三种主要模式。该方法能够方便地筛选不同细胞系、处理条件和时间点下的克隆形成性细胞死亡模式，旨在阐明特定靶细胞及实验条件下细胞死亡的作用机制。

电离辐射（IR）可诱导多种模式的克隆源性细胞死亡。关于电离辐射诱导克隆源性细胞死亡的研究，对于理解电离辐射对正常组织的毒性，以及开发提高癌症放射治疗疗效的方法具有重要意义。凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老是电离辐射诱导克隆源性细胞死亡的主要模式1。凋亡是一种由DNA损伤启动的受调控的细胞死亡方式1。有丝分裂灾难是指由于未修复的DNA双链断裂导致异常有丝分裂而引发的细胞死亡1。细胞衰老被定义为不可逆的细胞生长停滞状态2；需要注意的是，细胞衰老本身并非细胞死亡，但由于其消除了衰老细胞的克隆源性存活能力，因此被视为一种克隆源性细胞死亡模式。
已开发出多种基于细胞的检测方法，用于分别评估凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。细胞凋亡可通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色、annexin V染色、DNA片段化检测以及通过流式细胞术测定亚G1期细胞周期来评估1。有丝分裂灾难可通过针对有丝分裂标志物（如MPM2）、TUNEL染色以及透射电镜进行免疫荧光染色来评估1。细胞衰老可通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、生长停滞检测和透射电镜进行评估1。重要的是，不同细胞系及处理条件下，克隆源性细胞死亡的主要模式存在差异3,4。因此，为了阐明特定实验条件下克隆源性细胞死亡的整体特征，必须同时开展涵盖上述所有死亡模式的多种检测，而这需要大量人力和高昂成本。
本文介绍了一种快速且经济高效的单步检测方法，可同时评估电离辐射（IR）诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老3,4。该方法中，生长在盖玻片上的细胞经X射线照射后，使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色。通过荧光显微镜观察，根据DAPI染色细胞核各自的特征性形态，分别识别细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。该方法适用于在不同细胞系、处理条件和时间点筛选克隆形成性细胞死亡谱型，有助于研究特定细胞类型和条件下细胞死亡的机制。

<table><tbody><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>C013001</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-250G</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Cosmo Bio</td><td>16232000</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Kai Medical</td><td>No.20, 520-A</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 细胞培养皿</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>倒置相差显微镜</td><td>Shimazu</td><td>114-909</td><td></td></tr><tr><td>X射线辐照仪</td><td>Faxitron Bioptics</td><td>Faxitron RX-650</td><td></td></tr><tr><td>方形培养皿</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Matsunami</td><td>Pro-11</td><td></td></tr><tr><td>DAPI染色试剂</td><td>Cell Signaling</td><td>8961S</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ni</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜 DAPI 滤光片</td><td>Nikon</td><td>U-FUW, BP340-390, BA420IF, DM410</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜物镜 (20&amp;times;)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 20X/0.75</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜物镜 (60&amp;times;, 油镜)</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &amp;lambda; 60X/1.40 oil</td><td></td></tr><tr><td>镜油</td><td>Olympus</td><td>N5218600</td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Nikon</td><td>DS-Qi2</td><td></td></tr><tr><td>数字图像采集软件</td><td>Nikon</td><td>NIS-Elements Document</td><td></td></tr><tr><td>镜头清洁剂</td><td>Olympus</td><td>OT0552</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Wako</td><td>035-02616</td><td></td></tr></tbody></table>

一步法荧光显微镜评估辐射诱导克隆性细胞死亡模式的实验方案

One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

研究电离辐射（IR）诱导的克隆形成性细胞死亡对于理解电离辐射对恶性肿瘤和正常组织的影响具有重要意义。本文介绍一种快速、经济的一次性检测方法，可同时评估电离辐射诱导的克隆形成性细胞死亡的主要模式， 即，凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。在本方法中，将生长在盖玻片上的细胞用X射线照射，并用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色。通过荧光显微镜观察，根据DAPI染色细胞核的特征性形态来识别凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。凋亡的判定依据是出现凋亡小体（即，浓缩且断裂的细胞核）。有丝分裂灾难通过存在两个或更多明显叶状结构的细胞核以及微核来确定。细胞衰老通过衰老相关异染色质灶（SAHF）的存在来确定。即，细胞核DNA呈现30-50个明亮且致密的焦点）。该方法可帮助实验人员利用不同细胞系、处理条件和/或时间点，便捷地筛选克隆形成性细胞死亡模式，旨在阐明目标细胞在特定条件下的细胞死亡机制。

以U2OS人骨肉瘤细胞为例，用6 Gy X射线处理后，于37°C孵育72小时，并按照本方案进行DAPI染色实验。 图1展示了使用60×油镜获得的典型细胞核形态的放大图像，这些形态分别对应于凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老。每种克隆性细胞死亡模式的特征性形态详见步骤7.1.1–7.1.3。 图2 展示了使用20×物镜获得的细胞核整体视野图像。6 Gy X射线辐照后，有丝分裂灾难发生较为频繁，细胞凋亡较少见，而细胞衰老则极为罕见。通过低倍镜视野观察，可快速全面了解特定实验条件下克隆性细胞死亡的整体分布情况。 图3展示了定量数据的图示化结果。
<img alt="细胞结局：凋亡、有丝分裂灾难、衰老；显微镜图像；细胞核变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：DAPI染色细胞核的放大图像，显示凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的典型形态。 U2OS细胞接受6 Gy X射线照射。照射后72小时，固定细胞并用DAPI染色。使用60倍油镜采集细胞核图像。比例尺 = 20 μm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞对辐射的响应；显微镜图像，0 Gy 与 6 Gy 处理的细胞，DNA 损伤指示。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：经 X 射线处理的细胞中 DAPI 染色细胞核的概览图像。 U2OS 细胞接受 6 Gy X 射线照射或模拟照射。照射后 72 小时，固定细胞并用 DAPI 染色。使用 20X 物镜采集细胞核图像。圆圈：凋亡；箭头：有丝分裂灾难。比例尺 = 50 μm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="辐射剂量-反应柱状图；0 Gy和6 Gy剂量下的细胞存活率；比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56338/56338fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：X射线处理细胞后诱导的细胞凋亡、有丝分裂灾难和细胞衰老的定量数据。 U2OS细胞接受6 Gy X射线照射或模拟照射。照射72小时后，固定细胞并用DAPI染色。使用20倍物镜采集细胞核图像。从随机视野中，共评估300个细胞核的凋亡（Ap）、有丝分裂灾难（MC）和细胞衰老（Sns）情况。实验重复三次。图中显示平均值，误差线表示标准差。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56338/56338fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

电离辐射（IR）诱导的克隆形成性细胞死亡研究对于理解电离辐射对恶性肿瘤和正常组织的影响具有重要意义。本文介绍了一种基于荧光显微镜下观察4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）染色细胞核形态的单步检测方法，用于评估电离辐射诱导克隆形成性细胞死亡的主要模式。

研究电离辐射（IR）诱导的克隆形成性细胞死亡对于理解电离辐射对恶性肿瘤和正常组织的影响具有重要意义。

本实验的总体目标是基于DAPI染色后细胞核的特征性形态，评估电离辐射诱导的克隆源性细胞死亡的主要模式。该方法有助于解答辐射生物学领域中的关键问题。这种快速且经济高效的技术主要优势在于，可同时评估电离辐射所诱导的克隆源性细胞死亡的各种主要模式。通常，刚接触辐射生物学的研究人员会难以评估辐射诱导的克隆性细胞死亡，因为需要采用不同的检测方法来分别评价每种细胞死亡方式。我们最初是在使用多种细胞系和不同辐射剂量进行辐射诱导克隆性细胞死亡的大规模筛选时，提出了该方法的构想。尽管该方法可为辐射生物学研究提供重要信息，但也同样适用于其他系统，例如癌症的化学治疗。演示该操作的是我们的合作者 Atsushi Shibata。首先，用经70%乙醇润湿的纸巾对解剖刀进行灭菌。然后使用解剖刀将盖玻片放入35毫米的细胞培养皿中。向含有盖玻片的培养皿中加入一毫升培养基。现在用无菌镊子轻轻夹住盖玻片中央，彻底吸除培养皿中的培养基。接下来，在15毫升离心管中用培养基制备三毫升细胞悬液。将细胞悬液加入培养皿中，在37摄氏度、5% CO2条件下培养过夜。通过倒置相差显微镜观察，确保细胞已贴附在盖玻片上且存活。现在用6 Gy的X射线照射培养皿。照射后，将细胞置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育72小时。随后从培养箱中取出细胞，吸去培养皿中的培养基。使用剪刀从1,000微升微量移液器吸头末端约五毫米处剪去尖端。用其向培养皿中加入一毫升固定液。沿培养皿壁加入固定液，以尽量减少对细胞的损伤。然后将此培养皿转移至方形培养皿中，轻轻摇晃，使固定液均匀覆盖盖玻片。随后在室温下孵育10分钟。从培养皿中吸除固定液。现在沿培养皿壁加入两毫升 PBS，然后吸去 PBS。为准备 DAPI 染色，将五微升 DAPI 染色试剂加到玻片上。然后用解剖刀从培养皿中移除盖玻片，并用纸巾轻触盖玻片边缘以吸去多余的 PBS。现在将盖玻片细胞面朝下倒置在载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴上，使细胞与 DAPI 染色试剂接触。最后，在配备 DAPI 滤光片的荧光显微镜下观察染色后的细胞。图中展示了三种细胞死亡模式下的核形态。可见凋亡细胞的细胞核发生凝聚。在经历有丝分裂灾难的细胞核中可观察到多个叶状结构。经历衰老的细胞显示出典型的与衰老相关的异染色质灶。图中展示了假照射手段处理的细胞核与接受6 Gy X射线照射的细胞核的对比观察结果。圆圈表示正在经历凋亡的细胞核，箭头表示正在经历有丝分裂灾难的细胞核。图中显示了约300个经照射处理与对照组细胞核的评估结果。6 Gy X射线照射导致有丝分裂灾难的发生率约为25%，凋亡的发生率约为5%，而衰老事件极为罕见。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一小时内完成。在进行此操作时，需注意避免将溶液直接施加于盖玻片上而损伤细胞。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术分析或细胞死亡标志物蛋白检测，以及衰老相关β-半乳糖苷酶染色以评估细胞衰老情况，从而更深入地理解克隆形成性细胞死亡的每一种模式。

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科研

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癌症研究

荧光显微镜评价辐射诱发克隆细胞死亡模式的一步协议

克隆形成实验用于评估细胞增殖活力的适用性已有50多年的历史。本文中，我们演示了使用贴壁细胞进行克隆形成实验的一般操作步骤。...

克隆形成实验：贴壁细胞

检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。...

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

本视频展示了利用DAPI染色法对电离辐射（IR）诱导的癌细胞系中的主要细胞死亡特征进行筛选的方法。发生细胞死亡的靶细胞经DAPI染色后，其细胞核呈现明显的形态学变化，可通过荧光显微镜轻松识别。...

利用DAPI染色进行细胞死亡筛选：一种快速筛选电离辐射诱导癌细胞系克隆性细胞死亡的方法

激光显微照射是研究活细胞中DNA修复的有用工具。本文展示了利用UVA激光诱导多种DNA损伤的方法学途径。我们优化了一种局部显微照射方法，能够维持正常的细胞周期；因此，经照射的细胞可正常进行有丝分裂。...

利用高级共聚焦显微镜技术研究DNA损伤位点的蛋白质-蛋白质相互作用及动力学

本文介绍了一种详细方案，应用罗丹明123检测线粒体膜电位（MMP），并研究CLIC4基因敲低诱导的HN4细胞凋亡...

检测线粒体膜电位以研究CLIC4敲低诱导的HN4细胞凋亡 体外

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利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

活细胞成像能够提供单个细胞或整个细胞群体的丰富信息，而这些信息仅通过固定细胞成像无法获得。本文描述了在使用抗有丝分裂药物紫杉醇处理后，通过活细胞成像技术评估细胞命运决定的实验方案。...

长期活细胞成像评估细胞对紫杉醇处理的细胞命运响应

我们在此描述一种用于研究预先激活的CD8细胞毒性的实验方案+ 通过检测凋亡的癌细胞来识别针对癌细胞的T细胞 通过 实时显微镜技术。该方案可用于研究髓系细胞诱导的T细胞抑制机制，并评估旨在恢复T细胞功能的化合物 通过...

实时检测CD8+ T细胞诱导的体外肿瘤细胞凋亡以研究肿瘤浸润性髓系细胞的免疫抑制功能

本方案描述了细胞内亚细胞区室特异性氧化还原状态的评估方法。一种对氧化还原敏感的荧光探针可实现对完整细胞进行便捷的比率分析。...

利用亚细胞区室特异性氧化还原敏感型绿色荧光蛋白评估细胞氧化状态

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本方案描述了一种简单且经济高效的方法，用于研究和量化人结肠类器官在细胞毒性干扰物（如细胞因子）作用下的细胞死亡。该方法采用荧光细胞死亡染料（SYTOX Green...

利用活细胞荧光显微镜定量人结肠类器官中细胞因子诱导的细胞死亡

了解使用DAPI染色和荧光显微镜评估电离辐射诱导克隆细胞死亡模式的一步法。该方法可同时检测细胞凋亡、有丝分裂灾难和衰老，为辐射生物学研究提供快速经济的分析手段。

一步法荧光显微镜评估辐射诱导克隆性细胞死亡模式的实验方案

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