One-step Protocol for Evaluation of the Mode of Radiation-induced Clonogenic Cell Death by Fluorescence Microscopy

该测定的总体目标是根据用 DAPI 染色的细胞核的特征形态评估电离辐射诱导的克隆形成细胞死亡的主要模式。这种方法可以帮助回答辐射生物学领域的关键问题。这种快速且经济高效的技术的主要优点是可以同时评估电离辐射诱导的克隆形成细胞死亡的主要模式。

一般来说，刚接触放射生物学的个体将难以评估辐射诱导的克隆形成细胞死亡，因为需要不同的检测来评估每种细胞死亡模式。当我们使用多种细胞系和辐射剂量对辐射诱导的克隆形成细胞死亡进行大规模筛选时，我们首先想到了这种方法。虽然这种方法可以提供对放射生物学的见解，但它也可以应用于其他系统，例如癌症化疗。

演示该程序的将是我们的合作者 Atsushi Shibata。首先用蘸有 70% 乙醇的纸巾对手术刀进行消毒。然后使用手术刀将盖玻片放入 35 毫米细胞培养皿中。

在带有盖玻片的培养皿中，加入 1 毫升培养基。现在用无菌镊子轻轻握住盖玻片的中心，并从培养皿中完全吸出培养基。接下来，在 15 mL 试管中的培养基中制备 3 mL 细胞悬液。

将细胞悬液添加到培养皿中。并在 37 摄氏度和 5%CO2 下孵育过夜。通过在倒置相差显微镜下检查细胞，确保细胞附着在盖玻片上并且是活的。

现在用六种灰度 X 射线照射培养皿。照射后，将细胞在 37 摄氏度和 5% CO2 的培养箱中孵育 72 小时。现在从培养箱中取出细胞，从培养皿中吸出培养基。

使用剪刀将 1， 000 微升微量移液器吸头的尖端从末端剪下约 5 毫米。并用它向培养皿中加入 1 毫升固定液。沿培养皿壁涂抹固定溶液，以尽量减少对细胞的损伤。

然后将该培养皿转移到方形培养皿中，轻轻摇晃，使固定液均匀分布在盖玻片上。之后，在室温下孵育培养皿 10 分钟。从培养皿中吸出固定液。

现在沿培养皿壁添加 2 毫升 PBS。然后吸出 PBS。为了准备 DAPI 染色，在载玻片上加入 5 μL 的 DAPI 染色试剂。

然后用手术刀从培养皿中取出盖玻片。然后用纸巾触摸盖玻片的边缘，沥干盖玻片上多余的 PBS。现在将盖玻片倒置安装在载玻片上的 DAPI 染色试剂液滴上，以便细胞暴露于 DAPI 染色试剂中。

最后，在配备 DAPI 滤光片的荧光显微镜下检查染色的细胞。显示了三种细胞死亡模式中的每一种细胞核形态。可以看到凋亡细胞具有浓缩的细胞核。

在经历有丝分裂灾难的细胞核中观察到多个叶。观察到经历衰老的细胞表现出特征性的衰老相关异染色质病灶。显示了模拟照射的原子核和用 6 种灰 X 射线照射的原子核的比较观察。

圆圈表示细胞核正在凋亡，箭头表示细胞核正在经历有丝分裂灾难。显示了与模拟相比，大约 300 个受到照射的细胞核的评估。六格雷 X 射线照射被认为更频繁地导致有丝分裂灾难，约为 25%，其次是细胞凋亡，约为 5% 和非常罕见的衰老事件。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住不要通过将溶液直接涂抹在盖玻片上来损坏细胞。按照此程序，可以执行其他方法，例如流式细胞术分析或细胞死亡标志物蛋白，以及衰老相关的 β-半乳糖苷酶染色以评估衰老，以进一步了解克隆形成细胞死亡的每种模式。