Name: 蚂蚁视觉系统解剖学研究方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学习光学与电子显微镜技术用于蚂蚁视觉系统解剖学研究，获取详细结构信息并估算视觉参数。该方法可应用于多种昆虫物种，为视觉生态学提供重要数据支持。

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我们感谢Jochen Zeil、Paul Cooper和Birgit Greiner分享他们在昆虫解剖学方面的知识，并演示了本文所描述的多种技术。我们感谢澳大利亚国立大学先进显微镜中心和麦考瑞大学显微镜单元中才华横溢且富有支持性的工作人员。本研究得到了FRE研究生奖学金以及澳大利亚研究理事会（DE120100019、FT140100221、DP150101172）资助项目的资助。

1. 样本制备
注意：首先需要了解复眼与单眼之间及其在头部的相对位置。这可以通过获取头部背视图像来实现。为此，我们建议对样品进行光学显微摄影或扫描电镜（SEM）技术处理。以下是两种方法的具体步骤。
<ol>
	<li>样本采集
	<ol>
		<li>将样本直接收集并保存于70%乙醇中。尽可能收集不同品级的个体。</li>
		<li>用时间、日期、地点以及任何其他相关观察信息标记样本例如采集于觅食期间，交配聚集，巢穴位于小枝内部， 等等。)</li>
		<li>收集足够的样本，以便每种处理组均有多个重复样本。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微摄影与Z轴层扫成像
	<ol>
		<li>将标本风干后，使用水溶性胶水将其固定在三角点卡上，再将三角点卡插在昆虫针上。具体操作细节参见参考文献18.</li>
		<li>使用带有Z轴步进电机和彩色相机的高倍体视显微镜进行成像。</li>
		<li>使用漫射器使样本光照均匀。</li>
		<li>在不同焦平面上采集图像，并以无损文件格式（如 tiff）保存，然后使用市售软件进行图像聚焦堆叠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描电子显微照片 
	注意：使用乙醇彻底清洁所有工具和工作表面，以避免灰尘及其他颗粒物对样本造成污染。
	<ol>
		<li>在乙醇中过夜脱水，并在培养皿中空气干燥。</li>
		<li>使用锋利的剃须刀片将头部与身体其余部分分离。</li>
		<li>将头部固定在所需的观察角度（例如将样本背侧朝上固定在铝制载物台上，使用导电碳胶带或碳导电片。将碳胶带切成细条并折叠，以支撑头壳。</li>
		<li>使用溅射镀膜仪，在20 mA电流下对样品表面喷金2分钟，同时使用旋转台。时间和电流可能需要根据具体仪器进行调整。</li>
		<li>将样本转移至新的铝制载台，使用新鲜的碳导电胶带或碳导电标签。 
		注意：未包被的碳膜可提供黑色背景，但转移样品可能会损坏金镀层。</li>
		<li>使用解剖显微镜检查样本方向是否仍然正确，并根据需要使用精细镊子或类似工具进行调整。注意避免划伤金镀层；尽量减少操作。</li>
		<li>将样品装载到SEM样品台支架上，记录样品台与样品之间的相对位置。 
		注意：一些扫描电镜配备有样品台相机，但多数没有，因此在高倍率下可能难以定位小型样品。</li>
		<li>对样本进行成像。使用较低的加速电压以避免电荷积累，并采用小孔径以获得良好的景深。 
		注意：最佳设置应与熟悉所用特定仪器的技术人员协商确定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 晶面数量与直径的定量分析
<ol>
	<li>角膜复制品
	<ol>
		<li>为此目的使用保存在乙醇中或固定在昆虫针上的蚂蚁（步骤 1.1.1）。</li>
		<li>将昆虫固定在昆虫针上或黏土上。如果头部相对较大，可去除其余身体部分。</li>
		<li>使用昆虫针或细木签蘸取少量快干无色指甲油，迅速涂抹于眼睛表面。确保针头不会划伤眼睛。指甲油应覆盖整个眼睛及周围部分头壳。 
		注意：指甲油在眼睛表面的厚度应尽量均匀。</li>
		<li>让指甲油在室温下自然固化。</li>
		<li>待其完全固化后，使用细昆虫针轻轻将复制品从眼周的头壳上剥离。</li>
		<li>使用一对干净的精细镊子夹起复制品，夹持部位应为覆盖头壳的部分，而非覆盖眼睛的区域。</li>
		<li>注意识别眼睛的方向：前侧、后侧、背侧和腹侧。</li>
		<li>将复制品置于载玻片上。使用刀片小心修剪复制品边缘多余的材料。使用细针或镊子固定复制品，防止其移动。</li>
		<li>若眼睛曲率较大，可用刀片在边缘做3–4条细小的放射状切口，以帮助“展平”复制品。若眼睛相对“平坦”，则无需进行此类切口。</li>
		<li>轻轻盖上盖玻片，确保已知复制品的方向。切勿施加压力，以免破坏指甲油上的角膜印迹。</li>
		<li>用极少量指甲油在盖玻片四角进行封固。若指甲油渗入盖玻片与载玻片之间，会损坏复制品。</li>
		<li>在复式显微镜下观察载玻片。 
		注意：若仅有部分小眼处于焦平面内，表明复制品展平程度不足。应弃去该样品，并从步骤 2.1.3 重新开始。</li>
		<li>将图像导入ImageJ/Fiji等免费软件中，用于测量小眼数量及每个小眼的尺寸。 
		注意：该方法也可用于制备单眼（ocelli）的复制品。由于单眼为单个透镜结构，建议将所有单眼保留在同一复制品中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分析眼睛的结构
注意：研究眼睛的解剖结构通常需要光学显微镜（LM）和透射电子显微镜（TEM）两种互补的技术。样品的初始处理阶段对LM和TEM而言所需技术相似，差异从切片阶段开始出现。样品处理过程中需使用危险化学品，必须谨慎操作并妥善废弃。操作时应佩戴个人防护装备，在通风橱内进行工作，始终阅读安全数据表（SDS），并在开始前完成风险评估。
<ol>
	<li>解剖
	<ol>
		<li>通过冷却或暴露于气态 CO 麻醉样本2.
		<ol>
			<li>CO2 麻醉过程非常迅速（通常在1分钟以内），应注意避免过度暴露，以免导致标本死亡。若使用干冰颗粒（固体CO₂）2) 避免直接接触标本，以免造成冻伤。</li>
			<li>低温麻醉速度较慢；4 °C 已足够，不建议使用更低温度。应针对特定物种确定合适的冷却时间。体型较大或耐寒的蚂蚁（如牛蚁）可能需要 &#62;10分钟内会完全失去活动能力，而较小的物种可能仅需1至2分钟。过度冷却会导致标本死亡（应避免与冰直接接触）。标本最好置于小型塑料容器中，用泡沫塞密封，并放入可观察的冰盒内，而不应放入电冰箱或冷冻柜中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将样本置于培养皿中，并在解剖显微镜下调整至适宜观察位置。操作需迅速，以维持麻醉状态，并避免切开后组织发生退化（退化可能在数秒内发生）。</li>
		<li>用镊子去除触角。若处理的是有刺昆虫，建议先截除腹部末端，以防被蜇伤。</li>
		<li>使用锋利的剃刀去除口器部分；可用镊子固定标本。对于较大的标本，从眼睛的前部切开；对于较小的标本，尽可能靠近眼睛处切割，注意不要牵拉脑组织，以免撕裂视网膜。</li>
		<li>准备打开头壳。将标本调整至第一刀口朝上的角度；此操作可在解剖显微镜下用镊子夹持标本完成，也可在肉眼观察下用拇指和食指夹持标本进行。</li>
		<li>在头部做一横向切口，以去除头部腹侧部分；对于大型物种，可去除部分腹侧眼部组织，以改善固定和渗透效果。此时头部仍应与身体相连。</li>
		<li>在复眼后方做冠状切口，将头壳与身体分离。</li>
		<li>将解剖出的带有复眼的头壳置于冰冻固定液中：含2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液（pH 7.2–7.5）。 
		注意：固定剂具有腐蚀性和毒性，需佩戴适当的防护装备，并在通风橱中操作。 
		注意：为防止神经组织退化，操作需迅速进行。解剖过程应在2分钟或更短时间内完成（熟练的解剖操作可能需要一定练习）。 
		注意：如果眼睛需要适应明亮或黑暗环境，则首先将动物暴露于所需光照条件下数小时。解剖操作应在相应的光照条件下进行。可使用红光进行解剖，以模拟黑暗环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本处理
	<ol>
		<li>将标本置于固定液中，在室温下于旋转摇床上以2小时进行固定。较大的标本可能需要更长的固定时间。</li>
		<li>去除固定剂并妥善处理。在摇床中用室温磷酸盐缓冲液洗涤样本（3次，每次5分钟）。 
		注意：磷酸盐缓冲液由 8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4，以及 0.244 g KH2PO4 在1 L蒸馏H2O（pH 7.2）</li>
		<li>除去磷酸缓冲液，加入2% OsO₄4. 将样本瓶置于通风橱内的摇床上，摇晃1-2小时。此为后固定步骤，用于固定脂肪并为透射电镜提供对比度。 
		注意：锇酸固定时间取决于样本大小；粗略的经验法则是，每1毫米样本厚度固定1小时3.</li>
		<li>移除锇溶液并妥善处理。将样品置于室温缓冲液中，在摇床上清洗三次，每次5分钟。</li>
		<li>将样本置于浓度递增的乙醇或丙酮中进行脱水；例如，依次使用50%、70%、80%和95%的溶液，每种浓度处理10分钟，最后用100%溶液处理两次，每次15分钟。每次更换溶液时将样本置于摇床中。 
		注意：如有必要，标本可在70%乙醇中保存过夜。</li>
		<li>吸去乙醇，加入100%丙酮，在摇床中放置20分钟（若已在丙酮中脱水，则跳过此步骤）。更换新鲜丙酮，再继续放置20分钟。</li>
		<li>使用以下丙酮与树脂的比例对组织进行树脂渗透：2:1（3小时）、1:1（过夜）、1:2（4小时）和纯树脂（过夜）。每一步均将样品置于通风橱内的摇床上，并在除最后两步以外的所有步骤中盖紧容器。 
		注意：树脂黏度过高，无法排出，因此每一步骤均需将样本转移至新的 disposable 容器中。</li>
		<li>准备用于安装样品的块状基座。可通过将有机玻璃切割成小矩形块（1.5 × 0.5 × 0.3 cm）来自制基座。也可使用环氧树脂（市面上有多种商用试剂盒）倒入硅胶模具中，在60 °C烘箱中固化12–14小时制备基座。 
		注意：未固化（液态）树脂具有致癌性，应放回烤箱直至完全硬化。</li>
		<li>将包埋块垂直放入模具中。小心地从液体树脂中取出样品，让多余的树脂流尽，然后将样品放置在包埋块的顶部。可使用少量额外树脂将样品固定于包埋块上。</li>
		<li>标记包埋块。打印纸质标签并将其嵌入包埋块中，或贴附在包埋块的表面。</li>
		<li>将带有嵌入块的模具在60 °C的烘箱中放置12–14小时。</li>
		<li>将样本块存放在干净的信封中。以此方式可保存数月到数年。</li>
		<li>将使用过的容器、污染的手套及其他受污染的设备留在通风橱内，使丙酮完全蒸发（至少12小时）。</li>
		<li>在丢弃一次性设备或从镊子等物品上刮除树脂之前，先将树脂放入烘箱中固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下观察组织块，以确保样本的方向适合切片平面。</li>
		<li>如果方向不合适，可使用珠宝锯切除标本，并利用已固化的树脂碎片和新鲜树脂重新调整标本方向并固定。也可将头部沿中线切分为两半，以便分别切片两个眼球。重新包埋后再次固化树脂，然后继续后续操作。</li>
		<li>将组织块安装在可拆卸的切片机卡盘上。取下卡盘并放置于持架上。</li>
		<li>在解剖显微镜下使用剃刀片修整树脂块。 
		注意：当夹持器安装在切片机臂上时，请勿进行此操作，否则可能导致臂部突然晃动并损坏轴承。</li>
		<li>将卡盘重新安装到切片机臂上，并调整样本角度。</li>
		<li>将刀片以适当角度安装在刀架上（玻璃刀片为0°，金刚石刀片请参阅制造商说明）。 
		注意：玻璃刀可通过玻璃刀制作仪廉价制备，但需定期更换，因其刃口会逐渐钝化；高品质金刚石刀虽可购买，但价格昂贵，需特殊维护，且不适用于初学者。</li>
		<li>使用带有滤器（0.45 µm 孔径）的注射器将蒸馏水注入刀舟中。</li>
		<li>将水注入船体，直至水位达到刀刃边缘；船体其他区域的液面可能呈凸形弯月面。</li>
		<li>将船体内的液体排出，直至弯月面略微凹陷但仍与刀刃边缘接触。可在任意位置调节液面高度，但始终需远离刀刃边缘。</li>
		<li>小心地将刀片移向样品，并对齐样品块与刀片。此步骤最好缓慢进行，通过目镜及从侧面定期检查刀片与样品的接近程度。 
		注意：不同仪器的使用说明可能存在差异，请查阅仪器手册以获取具体操作指南。</li>
		<li>在切片机上设置切片厚度。正确的厚度选择取决于样本大小、感兴趣区域以及所使用的刀具类型。</li>
		<li>若使用玻璃刀，请选择较高的设置（例如，4 µm），如果在到达目标区域之前需要切去大量材料。如果使用金刚石刀或样本非常小，则1-2 µm可能更为合适。</li>
		<li>开始 &#34;切割&#34; （转动切片机手轮），当刀片接近但尚未开始切割样本时，执行进近的最后部分。数次旋转后应开始出现切片；若无切片产生，请停止操作，并非常小心地将刀片略微靠近样本。</li>
		<li>当接近目标区域时，调整切片收集厚度（半薄切片为1 µm）。</li>
		<li>使用睫毛工具收集所有切片。 
		注意：睫毛工具可用指甲油将睫毛固定在细棒上制成。</li>
		<li>如果需要去除大量材料，可让切片累积后一并移除 大规模 通过移除刀片并用水冲洗来清理。如果使用的是玻璃刀，此时可以更换刀片的切割位置或更换为新刀片。</li>
		<li>使用巴斯德移液管或理想情况下使用带有滤器的注射器，将一系列小滴蒸馏水滴加到载玻片上。</li>
		<li>用睫毛小心地将收集到的切片漂浮到水滴上。</li>
		<li>收集此类切片，直至适合检查切片深度时为止。 
		注意：尽管这可能有些繁琐，但最好经常进行检查。</li>
		<li>将载玻片置于设定为 60 °C 的加热板上，待水分完全蒸发，组织切片牢固附着于载玻片上。</li>
		<li>用亚甲蓝染色10-60秒（染色时间根据切片厚度而定）。使用带滤器的注射器（同上）滴加染液。</li>
		<li>在载玻片一端滴加一滴染料，用针的侧面轻轻推开染料，注意不要接触或刮擦组织切片。将载玻片置于加热板上加热约10-20秒。</li>
		<li>用洗瓶中的蒸馏水冲洗载玻片，并将其置于加热板上烘干。</li>
		<li>在复式显微镜下观察并进行成像。</li>
		<li>重复操作直至到达目标区域。</li>
		<li>对于超薄切片：将切片厚度设置为40–60 nm以收集透射电镜切片。</li>
		<li>切取约3-5个切片，使用干涉色图表检查切片厚度。在斜视观察时，切片应呈现浅灰色反光。 
		注意：可将氯仿蒸气吹过切片以舒展任何皱褶。此操作主要适用于有经验的操作者，初学者无需担心。若在切片附近释放过多氯仿，可能损伤切片。</li>
		<li>用镊子夹住一张镀有Formvar膜、铜质的载网，使Formvar膜面朝上。注意不要刺破Formvar膜层。</li>
		<li>将载网侧边朝下浸入舟皿中，远离切片位置，然后将载网平行地移至切片下方的液面处。如有必要，可用睫毛工具引导切片覆盖到载网上。</li>
		<li>用滤纸小心地轻拭镊子尖端周围，吸去夹臂间滞留的水分。若不进行此操作，水的表面张力可能将网格拉入夹臂之间或使其粘附于一侧，从而导致污染或机械损伤。</li>
		<li>将网格边缘轻轻竖立在滤纸上，以去除网格上多余的水分。</li>
		<li>将网格放入网格架中。</li>
		<li>重复此步骤，直至收集到足够数量的切片。</li>
		<li>半薄切片可直接使用配备相机的任何复合显微镜进行成像。可将浸油直接滴加至切片上。载玻片应存放于载玻片盒中，以防止变色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电镜超薄切片染色以增强反差 
	注意：以下步骤应在避光条件下进行，因为染料对光和 CO 敏感。2 敏感。此外，电镜染色剂使用重金属产生对比度，因此属于危险物质。处理这些染色剂时必须采取适当防护措施。
	<ol>
		<li>用铝箔覆盖几个大型培养皿以遮挡光线，后续步骤在避光条件下进行。操作时可部分掀开铝箔以留出工作空间，但应尽快重新盖好。</li>
		<li>用巴斯德移液管吸取6%饱和醋酸铀溶液，在石蜡膜上小心滴加五滴。
		<ol>
			<li>配制溶液时，将 2 g 醋酸铀酰与 100 mL 50% 甲醇水溶液混合，并在使用前过滤。该溶液不可储存，需每次现配现用。19.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用镊子小心夹起透射电镜载网，将切面朝下置于染液液滴上，平衡放置25分钟。</li>
		<li>将载网逐个快速浸入并取出蒸馏水中进行漂洗；依次经过四个不同的盛有蒸馏水的瓶子。</li>
		<li>在一张新的膜上放置五滴柠檬酸铅溶液。在染液滴周围放置几粒氢氧化钠颗粒（用于吸收空气中的CO₂）。2 以防止碳酸铅沉淀。
		<ol>
			<li>制备柠檬酸铅溶液时，先将蒸馏水煮沸0.5小时以制得重蒸水。待水冷却后，在可密封的容器中加入0.3 g柠檬酸铅至100 mL重蒸水中。加入1 mL 10 M NaOH，密封容器并振荡至完全溶解。19.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将载网置于染液滴上，操作如4.3所述，加盖避光。染色5分钟。</li>
		<li>将载网如前所述浸入蒸馏水中，反复进出20次，用蒸馏水冲洗。依次经过三个盛有蒸馏水的容器。</li>
		<li>用滤纸吸去多余的水分，并将载网放入载网盒中晾干。</li>
		<li>在低加速电压下的透射电子显微镜图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Narendra, A., Greiner, B., Ribi, W. A., Zeil, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+and+dark+adaptation+mechanisms+in+the+compound+eyes+of+Myrmecia+ants+that+occupy+discrete+temporal+niches%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Light and dark adaptation mechanisms in the compound eyes of Myrmecia ants that occupy discrete temporal niches.</a> J. Exp. Biol. 219, 2435-2442 (2016).</li>
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</ol>

作者声明无竞争利益。

上述一系列方法可有效用于研究蚂蚁及其他昆虫的视觉系统。这些技术有助于我们理解所研究眼睛的采样分辨率、光学敏感性以及潜在的偏振光敏感性。这些知识为深入探究其视觉功能的生理学和行为学研究提供了重要基础。此外，尽管本文详述的方法主要聚焦于蚂蚁的视觉系统，但这些技术也可应用于其他昆虫，仅需对实验方案进行轻微调整（例如，在较厚的组织中延长固定和渗透时间）。已有经稍作修改的实验方案被用于表征多种昆虫的视觉系统，包括蝉22、蝇类14、蜜蜂23、黄蜂24、蝴蝶25和蛾类26。尽管本文所述大多数技术已应用多年，但本文旨在将其整合于蚂蚁视觉系统研究的背景下，比较不同技术方案，并描述常见的操作误区。
目前有许多成像技术，其应用范围存在重叠，因此很难判断哪种技术最适合当前任务。一个相关的例子是选择用于整体...

视觉是大多数动物重要的感觉方式。在导航过程中，视觉尤其关键，可用于精确定位目标、建立并遵循路线，以及获取罗盘信息1,2。昆虫通过一对复眼来感知视觉信息，有些种类还具有一到三个位于背部的单眼，称为小眼3,4,5。
蚂蚁的眼睛具有特殊的研究价值，因为尽管蚂蚁物种极为多样，但在不同物种间仍保留了一些关键特征。尽管在解剖结构、体型大小和生态习性上存在显著差异，绝大多数蚂蚁物种均为真社会性生物，营群居生活；因此，不同物种在视觉上面临相似的挑战，即需要在固定巢穴与资源点之间反复往返导航。从体长0.5至26毫米、从 exclusively diurnal 到 strictly nocturnal 的物种，以及从缓慢爬行的地下种类到善于跳跃的视觉捕食者，蚂蚁中均可观察到相同的基本复眼结构6,7,8,9,10。这些在生态与行为上的巨大差异，导致相同的基本眼结构演化出无数种适应不同环境、生活方式和体型大小的形态变异11,12。因此，对蚂蚁视觉生态的研究为有志研究者提供了极为丰富的探索机会。
理解昆虫视觉系统对于深入了解其行为能力至关重要。这一点在一些整合性研究中尤为明显，这些研究成功地将解剖学与生态学及行为学紧密结合，在少数昆虫类群中取得了显著成果。例如，参考文献13,14,15,16,17尽管蚂蚁导航和蚂蚁行为领域的研究总体上已取得显著成果，但除少数选定物种外，针对蚂蚁视觉的研究仍十分有限。本文将详细阐述研究蚂蚁眼睛结构的相关技术。虽然我们将重点讨论蚂蚁，但这些技术经过适当修改后，也可应用于其他昆虫。

<table><tbody><tr><td>蚂蚁</td><td>Myrmecia midas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica M205 FA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Pro Sci Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Leica MZ6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>昆虫针</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无色指甲油</td><td>无品牌：任意化妆品店购买</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃载片</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>ProSciTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>复式显微镜</td><td>Leica DM5000 B</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na2HPO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH2PO4）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Araldite 环氧树脂</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲苯胺蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Riechert HK120</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

研究蚂蚁视觉系统解剖结构的技术

Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System

本文概述了一系列可用于研究昆虫眼内外解剖结构的光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）技术。这些技术包括为蚂蚁眼睛研究优化的传统组织学方法，并已调整为可与其他技术（如透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM））协同使用。尽管这些技术具有极高的应用价值，但对于初学者而言可能较难掌握，因此本文特别强调针对不同样本的故障排查与优化方法。我们提供了针对完整样本的成像技术（显微摄影和SEM）相关信息，并讨论了各自的优缺点。我们重点介绍了用于测定整只复眼晶状体直径的技术，并探讨了改进该方法的新技术。最后，我们论述了用于LM和TEM的样本制备、切片、染色及成像相关技术，讨论了在样本制备过程中可能遇到的困难以及最佳应对策略。

本文所述方法可实现对蚂蚁单眼和复眼的详细研究。通过使用Z轴堆叠显微摄影技术对头部背侧进行成像，可获得视觉系统布局的全面概览。图1）。这有助于为解剖做准备，并确定所需的切片角度。该技术还可用于测量头宽、眼长及单眼晶状体直径等参数。扫描电镜成像不仅能提供详细的整体图像，还可获取高倍率、高分辨率的图像。可对眼部特定感兴趣区域进行细致观察，并识别晶状体形状的差异。图2）。扫描电镜图像对于解析具有小眼和单眼的蚂蚁尤为有用。角膜复制品可提供每只眼睛晶状体的形状、大小和数量信息。图3）。利用光学显微技术成像的半薄切片可用于研究眼球的整体内部解剖结构（图 4 和 图5）；这包括晶状体厚度、晶锥直径、晶锥小管的存在与否、小眼面的形状、宽度和长度、背缘区的定位，以及初级和次级色素细胞的位置。该技术...

本文概述了一系列用于研究昆虫眼内、外部解剖结构的光学显微镜和电子显微镜技术。这些技术包括针对蚂蚁眼睛优化的多种传统方法、详细的故障排除步骤，以及针对不同样本和感兴趣区域的优化建议。

本文概述了一系列可用于研究眼内和眼外结构的光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）技术……

本系列显微技术的总体目标是获取蚂蚁视觉系统的详细解剖学信息。该方法有助于解决视觉生态学领域中的关键问题，以估算多种视觉参数，例如光学敏感度、视觉敏锐度以及视场范围的大小。该技术的主要优势在于能够对特定视觉系统提供全面的概览。该方法也可适用于许多不同物种。制作角膜复制品时，可使用保存在乙醇中的蚂蚁，或固定在针上或黏土上的蚂蚁。如果蚂蚁头部相对较大，可以去除其余身体部分。首先，使用牙签将快干无色的指甲油迅速涂抹在眼睛表面，注意不要刮伤眼睛。让指甲油在室温下自然凝固。然后，用细小的昆虫针轻轻从眼周的头壳上剥离复制品。用镊子夹住覆盖头部但不覆盖眼睛的印模部分。接着，将印模放置在玻璃载片上。在此过程中，用剃刀小心修剪眼睛周围多余的材料，同时固定好印模。在盖上盖玻片之前，可能需要进行三到四条细小的不完全径向切口，以帮助展平复制品。放置盖玻片时，应记录复制品在载玻片上的方向。然后用少量指甲油在盖玻片的四个角上轻轻点涂以封固，注意确保液体不接触复制品。此时即可使用复式显微镜对载玻片进行成像。首先，将蚂蚁麻醉并置于培养皿中。若需针对明亮或点状条件调整染料，应在解剖前数小时完成该步骤。如果保持红光条件，解剖应在红光下进行。首先使用镊子去除触角，然后使用锋利的剃刀刀片去除口器部分。对于较大的标本，切开眼睛的前部。对于较小的标本，应尽可能靠近眼睛处切割，但不要牵拉脑组织，以免撕脱视网膜。接着，调整头部方向，进行横向切口，去除头部的腹侧部分，该区域可能包含部分腹侧的眼组织。然后，通过冠状切口在复眼后方切断头壳。在此示例中，横向切口和冠状切口同时进行。最后，将带有复眼的解剖后头壳转移至冰冻固定液中。进行这些步骤时必须迅速，以防止组织降解，因此在首次切开后两分钟内应将组织放入固定剂中。按照文本方案，制备样本并沥去多余的树脂。然后将样本垂直放置在包埋块上，如有需要，可使用少量多余的树脂将其固定。使用嵌入树脂中或附着在包埋块上的纸质标签对包埋块进行标记。然后，在60摄氏度的烘箱中固化树脂12至14小时。固化完成后，将样品装入干净的信封中。接下来，将包埋块安装到切片机的夹具上。在切片前，首先确保样本的朝向适合所需的切片平面。在解剖显微镜下，使用剃须刀片修整树脂包埋块。然后，将卡盘重新安装到切片机臂上，并调整样本角度。接着，使用带有0.45微米滤膜的注射器将蒸馏水注入刀槽中，加水至刀刃边缘。在某些位置，弯月面可能呈凸形。此时，应排出载物台中的液体，直至弯月面略微呈凹形，但仍能接触到刀刃边缘。然后，缓慢而小心地将刀刃移向样品，并将包埋块与刀刃对齐。通过目镜频繁检查。当刀片接近但尚未开始切割样本时，开始转动切片机手轮以完成进近。随后，当接近组织块中的目标区域时，调整切片收集厚度。在此情况下，使用金刚石刀具切割一微米厚的切片。然后，用带有滤器的注射器在载玻片上滴加一系列小滴蒸馏水。为收集目标切片，使用睫毛工具将其拾起。然后小心地将收集到的切片漂浮到一滴水面上。根据载玻片的空间，继续加载尽可能多的切片。当载玻片完全加载后，将其转移至60°C的加热板上，以蒸发水分并使切片牢固附着于载玻片上。此过程大约需要15至20分钟。接下来，使用另一个装有滤器的注射器将一滴甲苯胺蓝染液滴加到载玻片上。将染液滴加在载玻片的一端，并用针头边缘轻轻涂抹，注意不要接触或刮擦组织切片。然后，将玻片置于加热板上加热20至60秒。随后，用洗瓶向玻片喷洒蒸馏水，并使用加热板将其烘干。之后，在复式显微镜下检查玻片，然后进行成像。所述技术可实现对蚂蚁单眼和复眼的详细研究。通过Z轴堆叠显微摄影法对头部背侧进行成像，可获得视觉系统的整体布局，有助于进行宏观测量。扫描电镜成像则提供了分辨微小眼睛所需的细节，以及识别每个晶状体形状所需的精细结构信息。利用光学显微镜观察的半薄切片可显示眼睛的内部解剖结构。在此分辨率和放大倍数下，可测量晶状体、晶锥和小眼杆的尺寸，同时也能研究色素细胞、晶锥小管的存在情况以及小眼杆形态的分布。通过透射电子显微镜（TEM）成像的超薄切片可提供超微结构信息，例如微绒毛的取向以及晶体锥状狭窄区域的宽度。在尝试该技术时，务必保持耐心，使用洁净的仪器，并采用新鲜配制的溶液。完成这些实验后，可进一步开展其他行为学或生理学实验。这些实验将帮助我们了解动物视觉功能与其眼睛解剖结构之间的关系。利用这些技术，我们可以探索不同蚂蚁物种视觉系统的多样性，以及这些系统如何演化以适应不同的生活方式和生态环境。尽管该方法可用于研究蚂蚁的视觉系统，也可用于研究其他昆虫的视觉系统以及其他神经组织。请务必注意，使用固定剂和树脂具有极高的危险性，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作并佩戴腈手套。

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Environment

环境

蚂蚁视觉系统解剖学研究方法

非人灵长类动物在我们理解发育和衰老过程中是一个重要的转化研究物种。灵长类动物视网膜的解剖结构可能为人类正常及病理状态提供重要见解。...

通往大脑之门：灵长类眼球的解剖

本方案描述了三种黑腹果蝇（Drosophila）样品制备方法：1）成年果蝇脑组织解剖，2）成年果蝇视网膜解剖，以及3）发育中眼盘-脑复合体解剖。重点介绍了适用于活体成像的特殊制备技术和条件，尽管所有样品制备方法也可用于固定组织的免疫组织化学染色。...

发育期与成年个体的制备 果蝇 用于活体成像的大脑与视网膜

用于直接可视化视网膜刺激器中单个电极邻近视网膜细胞结构的技术。...

用于局部组织病理学分析的视网膜植入假眼处理技术

在此，我们展示了如何定量分析突触活性区的数量及其空间分布 果蝇...

分析长期光照后黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）感光细胞的突触调节

我们提出了一种对束缚状态下的蚂蚁进行经典条件反射的实验方案，该方法使研究人员能够在无法通过自由活动个体实现的分析水平上研究视觉学习和记忆形成。...

木蚁的视觉经典条件反射

本方案描述了制备幼虫和成虫 Drosophila...

幼虫与成虫的解剖、免疫组织化学及封片 果蝇 用于视叶成像的大脑样本

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。...

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

本方案描述了用于研究嗅觉环路组装的触角-脑离体系统的解剖步骤、培养条件以及活体成像方法。...

一种用于嗅觉环路组装延时成像研究的组织块培养系统 果蝇

本方案描述了利用伪瞳现象和感光细胞的瞳孔机制，通过自动化设备测量家蝇复眼视觉轴空间排列的方法。...

家蝇复眼视觉空间的自动制图

我们在此描述了诱导和分析触角叶突触小球在嗅觉经验依赖性重塑过程中的方法 果蝇...

幼年期关键阶段中依赖经验的嗅觉感觉神经元突触连接的脑部重塑

学习光学与电子显微镜技术用于蚂蚁视觉系统解剖学研究，获取详细结构信息并估算视觉参数。该方法可应用于多种昆虫物种，为视觉生态学提供重要数据支持。

研究蚂蚁视觉系统解剖结构的技术

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